Teknik Dasar Dna Rekombinan.docx

TUGAS BIOTEKNOLOGI TEKNOLOGI REKOMBINAN DNA TEKNIK DASAR DNA REKOMBINAN

OLEH : KELOMPOK 2

NAMA

: WIRDA TAUFIK

NIM

: 16031071

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI PADANG 2018

TEKNIK DASAR DNA REKOMBINAN

Teknik DNA Rekombinan atau Rekombinasi DNA terdiri dari beberapa teknik dasar yaitu sebagai berikut. A. Isolasi Molekul DNA (gen) Isolasi molekul DNA ini terdiri dari beberapa proses yaitu : 1. Pemecahan sel secara fisik dan kimiawi 2. Disuspensikan ke dalam senyawa tertentu 3. Isolasi dan pemurnian DNA 4. Isolasi fragmen atau bagian DNA (gen) yang akan digunakan dengan enzim endonuclease restriksi B. Pemotongan DNA Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim endoknulease restriksi adalah anzim bakteri yang mengenal sekuen nukleotida spesifik dalam suatu molekul DNA double-stranded. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan bagian pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan. DNA tersusun atas empat basa nukleotida yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). Enzim restriksi ini hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom yaitu urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Salah satu contoh enzim retriksi adalah Enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI Memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada bagian sembarangan tetapi hanya memotong pada bagian antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potonganpotongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Berikut adalah contoh organisme-organisme penghasil Enzim retriksi : Enzim EcoRI GAATTC Escherichia coli Enzim BamHI GGATCC Bacillus amylolyquefaciens Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu : 1. Pemotongan Sticky End

2. Pemotongan Blunt End

C. Penyambungan DNA Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmenfragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk meligasi (menyambungkan ) fragmen-fragmen DNA secara invitro yaitu : 1. Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Cara ini hanya dapat digunakan untuk meligasi sticky end.

2. Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Cara yang kedua ini dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada blunt end.

Gambar Proses ligasi (Penyambungan) DNA oleh Enzim Ligase Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Adapun suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujungujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA

tersebut dengan menggunakan teknik elektroforesis . Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. D. Transformasi Plasmid ke Sel Inang Transformasi bukanlah sesuatu yang mudah untuk dilakukan. Biasanya dari seribu sel yang ditransformasi maka tidak lebih dari satu sel yang tertransformasi, hal ini menunjukkan bahwa sangat sedikit sekali peluang sel untuk tertransformasi. Beberapa transforman akan membawa plasmid utuh. Sedangkan yang lainnya merupakan transforman yang yang membawa plasmid rekombinan atau merupakan sel yang kemasukan DNA non plasmid. Potongan DNA kromosom tidak memiliki replicon sehingga tidak dapat melakukan replikasi di dalam sel. Pemasukan DNA non plasmid tidak membawa dampak yang nyata kecuali menurunkan efisiensi transformasi. Supaya DNA yang akan dimasukkan ke dalam sel inang (E.coli) tidak mengalami perubahan susunan. Sel inang yang digunakan di pilih yang tidak membawa endonuclease dan tidak terjadi rekombinasi antara molekul DNA. Setelah transformasi dilakukan maka tahap selanjutnya adalah identifikasi, identifikasi dapat dilakukan dengan dua tahapan. Tahap pertama yaitu dengan cara selsel campuran transformasi ditumbuhkan dalam media padat yang mengandung antibiotic misalnya ampisilin. Pada contoh plasmid pBR322 yang membawa fragmen DNA kromosom pada daerah Bamhi. Jika ada bakteri yang tumbuh sudah pasti bakteri yang tumbuh itu adalah bakteri yang mengandung plasmid pBR322 atau pBR322 rekombinan. Sedangkan yang tidak tertransformasi tidak akan bertahan hidup. BamHi pada pBr322 terletak antara gen tetr (anti terhadap antibiotic tetrasiklin) sehingga jika penyisipan gen dilakukan akan merusak gen tetr . Oleh karena itu, sel yang membwa plasmid rekombinan resisten terhadap ampisilin dan tidak tahan terhadap tetrasiklin. Gen pBR322 utuh (alami) gen ampr dan gen tetr akan tetap utuh sehingga sel ini tahan terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Selanjutnya tahap kedua adalah dengan membedakannya antara kedua jenis transforman tersebut. Sel yang dapat tumbuh dalam medium mengandung ampisilin dipindahkan ke dalam medium yang mengandung tetrasiklin. E.coli yang dapat hidup pada medium yang mengandung tetrasiklin berarti membawa pBR322 yang utuh (alami) sedangkan sel yang tidak hidup pada medium yang mengandung tetrasiklin berarti membawa pBR322 Rekombinan. E. Analisis dan Konfirmasi Keberadaan DNA Rekombinan Setelah proses transformasi sel inang dengan DNA hasil ligase kemudian dilakukan analisis keberadaan DNA rekombinan di dalam sel inang (sebagai contohnya yaitu analisis DNA rekombinan pada E. coli yang biasa digunakan sebagai inang sementara maupun tetap. Setelah transformasi sel, lalu tumbuhkan sel pada medium selektif sesuai dengan penanda genetik yang ada pada vektor yg digunakan. Sel bakteri yang telah ditransformasi, di tumbuhkan pada medium yang mengandung antibiotik tersebut.

1.

2.

3.

4. 5.

Secara umum, cara analisis keberadaan DNA rekombinan dalam sel yang ditransformasi yaitu sebagai berikut. Analisis Restriksi DNA Praktis dan cepat dilakukan bila jumlah koloni transforman yang dianalisis tidak terlalu banyak. Selanjutnya dilakukan Isolasi DNA dari koloni-koloni transforman yang tumbuh pada medium selektif. Setelah dilakukan isolasi DNA plasmid dan pemotongan DNA dengan enzim restriksi spesifik maka dapat dibedakan antara sel yang membawa DNA rekombinan dengan yang membawa DNA vektor saja tanpa sisipan DNA asing. Hasil pemotongan DNA dielektroforesis pada gel agarose menjadi pita-pita DNA dengan menggunakan analisis pita. Hibridisasi dengan Pelacak DNA (DNA probe) DNA probe merupakan molekul DNA yang dilabel dengan radioaktif atau nonradioaktif. Urutan DNA-nya dibuat mirip dengan urutan nukleotida DNA rekombinan yang akan dilacak. Selanjutnya koloni-koloni transforman yang muncul pada medium selektif dipindahkan ke atas membran nitroselulosa atau nilon dan dilisis dengan alkali dimana DNA dalam sel terpapar keluar, lalu membran diinkubasi dengan pelacak DNA. Analisis Ekspresi Gen Asing Misalnya Klon gen yang kode sintesis protein papain dari pepaya. Maka dibuat antibodi terhadap papain, lalu protein papain yang diisolasi dari daun pepaya digunakan sebagai antigen untuk induksi pembuatan antibodi (misalnya pada kelinci) dan digunakan sebagai alat deteksi ekspresi gen papain yg diklon. Bila ada reaksi positif antara antibodi dan antitigen maka ada ekspresi gen papain hasil kloning. Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR Hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis menjadi pita-pita DNA. DNA Sequencing Pada cara ini dilakukan penentuan urutan nukleotida fragmen DNA asing secara rinci.

F. Karakterisasi Fungsional Gen yang di Klon Rancang sistem ekspresi yang sesuai untuk gen asing tersebut pada sel inang, dan perlu diperhatikan stabilitas gen tersebut di dalam sel inang. Khusus untuk tanaman transgenic diuji pada lingkungan yang terkendali, sedangkan untuk tanaman budidaya digunakan uji lapangan lepas.

REFERENSI Antonius Suwanto.2002.Bioteknologi.Jakarta : Universitas Terbuka http://web.ipb.ac.id/~tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinanpdf.pdf https://www.bbp4b.litbang.kkp.go.id/squalenbulletin/index.php/squalen/article/download/138/ 108 Rizki dan Putri Pratiwi.2013.Bahan Ajar Bioteknologi.Padang : STKIP PGRI Sumatera Barat