Tecnologia Do Dna Recombinante-aline

Tecnologia do DNA Recombinante Novas combinações de DNA criadas in vitro entre sequências de DNA humano (ou outro) de interesse e moléculas vetores bacterianos (ou outro) capazes de duplicação indefinida dentro de uma linhagem de laboratório de microorganismos

Clonagem Engenharia Genética Biotecnologia Aplicações forenses

Antes da Tecnologia do DNA recombinante • Obstáculos enfrentados pelos geneticistas moleculares para desenvolver suas investigações sobre a base molecular das doenças hereditárias – Obtenção de quantidade suficiente de uma seqüência de DNA ou RNA de interesse que permita sua análise – Purificação da seqüência de interesse dentre todos os outros segmentos de DNA ou moléculas de mRNA presentes na célula

Prêmio Nobel de Química 1980 • "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA“

Paul Berg (1/2)

• "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids" Frederick Sanger

Walter Gilbert

Tudo começou com rãs e bactérias... • • • •

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1969 – Primeiro gene isolado ( bactéria)- Metabolismo do açucar - Hamilton Smith descobre a primeira enzima de restrição (Haemophilus influenzae). 1972- Paul Berg et al. : Combina DNA de especies diferentes e re-introdus numa célula hospede.-Nasce o DNA recombinante! 1973- Stanley Cohen e Herbert Boyer "cut and paste" o DNA de rãs na bactéria E.coli. Começo da Engenharia genetica. 1974-1975 – 2 métodos de seqüenciamento de DNA 1. Maxam-Gilbert 2. Sequenciamento de Sanger 1975-Conferência Pacific Grove, California: Regularisa o uso da tecnologia do DNA recombinante - Robert Holley:Bateriófago MS2 sequenciado1976 - Genentech: primeira companhia de Engenharia genetica (Herbert Boyer and Robert Swanson). 1978 – O gene da insulina humana é clonado.

Engenharia Genética Utilização de um conjunto de técnicas que permitem:

identificar, isolar e multiplicar genes

Clonagem gênica

Etapas da Clonagem Molecular Envolve a transferência de uma seqüência de DNA de interesse para uma única célula de um microorganismo • • •

Isolamento do DNA de interesse Inserção em vetores de clonagem Introdução do DNA recombinante em uma célula hospedeira (transformação)

Isolamento do DNA de interesse • Enzimas de Restrição = “tesouras moleculares” – Enzimas que reconhecem seqüências bifilamentares específicas no DNA e clivam o DNA no sítio de reconhecimento ou próximo a ele – Clivagem: gera dois fragmentos, com pontas unifilamentares (pontas “adesivas” – úteis para as reações subseqüentes de união na construção de moléculas recombinantes de DNA) – Seqüências de DNA palindrômicas (Sequência de bases no sítio de reconhecimento, lida de 5´para 3´, é a mesma em ambos os filamentos – Extremidades Coesivas ou Abruptas

Exemplos de Enzimas de Restrição

Escherichia coli

Eco RI

Haemophilus influenzae

Hind III

Haemophilus aegyptius

Hae III

Enzima Acessória: DNA ligase

5´ G↓AATT C 3´ 3´ C TTAA↑G 5´ 5´ A↓ AGCT T 3´ 3´ T TCGA↑A 5´ 5´ GG↓CC 3´ 3´ CC↑GG 5´

Inserção em vetores de clonagem • Vetor – molécula de DNA que pode se replicar de modo autonômo em um hospedeiro (bactéria ou células de levedura) do qual pode ser isolado em forma pura para análise – Transportam o DNA clonado para uma célula hospedeira, possibilitando a multiplicação do Gene de Interesse • • • •

Plasmídeos Bacteriófago Lambda Cosmídeos e cromossomos artificiais de bactérias Cromossomos artificiais de levedura

Plasmídeos • • • • •

Molécula de DNA bifilamentar circular Bactérias e leveduras Eco RI Bam HI Uma Origem de Replicação Múltiplos Sítios de Clonagem Pst I resistência a Sal I ampicilina resistência a Marca de Seleção tetraciclina (Resistência a Antibióticos) (Seleção Enzimática - Cor) ORI

Pvu II

pBR322

Outros vetores • Bacteriófago Lambda – Vírus bacteriano – Infecção/replicação/lise da bactéria/1 milhão de bacteriófagos – 1/3 do genoma não é essencial – trechos de DNA de até 20 Kb

• Cosmídeos e Cromossomos Artificiais de Bactérias (BACs) – Plasmídeos que usam a habilidade das partículas infecciosas do bacteriófago lambda para “embalar” grandes pedaços lineares de DNA em capas de ptns que se ligam à superfície das bactérias e injetam seus conteúdos de DNA (50 Kb) – BACs (100-300 Kb)

• Cromossomos Artificiais de Levedura (YAC) – 1.000 – 2000 Kb

sítios de restrição

clivagem com Pvu II

clivagem com Eco RI

extremidade protundente

extremidade abrupta

DNA ligase vetor de clonagem

vetor recombinante

O Processo de Clonagem = Introdução do DNA recombinante em uma célula hospedeira (transformação) → Clone: Conjunto de células originadas pela divisão de uma célula original (todas com o mesmo material genético) 3. Vetor e DNA de interesse são cortados com a mesma enzima de restrição e em seguida ligados pela DNA ligase. 4. Transformação ou Infecção de Célula Competente 5. Seleção dos Transformantes

Transformação • O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. • A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. • Em 1970, Mandel e Higa : E.coli torna-se marcadamente competente para transformação com DNA exógeno, quando a bactéria for suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um curto choque térmico à 42oC. • O procedimento do cloreto de cálcio que é usado até hoje produz uma eficiência de transformação de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA

Transformação • O tamanho e a conformação da molécula do DNA, afeta o processo de transformação. – Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente. – DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.

• Seleção de bactérias transformadas é feita através do uso de antibióticos (plasmideos contém genes de resistência a antibióticos)

pBR322

Ágar contendo tetracilina

digestão com Pst I

DNA de interesse DNA ligase

Transformação de E. coli

Ágar contendo tetracilina

Ágar contendo tetracilina e ampicilina

Seleção de transformantes

Resumindo: Finalidade da Clonagem Molecular

• Isolar um determinado gene ou outra sequência de DNA em grandes quantidades para posterior estudo • Para gerar grandes quantidades de uma sequência: – Construção de um conjunto de clones de bactérias ou leveduras que contenham um vetor no qual os fragmentos de DNA foram inseridos = Biblioteca

Fontes dos Genes de Interesse • PCR (quando se sabe a seqüência gênica) • DNA genômico - Biblioteca Genômica • RNA mensageiro - Biblioteca de cDNA -

DNAs codificantes de proteínas Extração de RNA Purificação de mRNA (Oligo dT) Síntese de cDNA (transcriptase reversa) Clonagem

1. PCR: Polymerase Chain Reaction • O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no início da década de 1980, tendolhe sido posteriormente atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho • É um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

PCR: Polymerase Chain Reaction • •

1. Desnaturação (94-96ºC, 30-600 segundos). Durante a desnaturação, a cadeia dupla do DNA é separada em duas cadeias simples.A DNA polimerase é estável a altas temperaturas pois é obtida de organismos que vivem em ambientes extremos (extremófilos). A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase (obtida de Thermus aquaticus).

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2. Annealing (emparelhamento) (45-80º C, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.

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3. Alongamento (65-80º C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar à medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucleótidos presentes na reação. Após cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, após múltiplas ciclos, o aumento da quantidade de DNA é exponencial de base 2. Por exemplo, após 30 ciclos, uma cadeia de DNA é copiada em 230 = 1 073 741 824 cadeias, que são cópias exatas da parte da primeira cadeia selecionada pelos iniciadores.

PCR: Polymerase Chain Reaction 1. Desnaturação (94-96ºC, 30-600 segundos). 2. Annealing (emparelhamento) (4580º C, 30-120 segundos). 3. Alongamento (65-80º C, 30-120 segundos).

PCR: Polymerase Chain Reaction • A máquina de PCR (termociclador) é basicamente um forno onde um programa controla o tempo e a temperatura.

2. DNA genômico - Biblioteca Genômica Cromossomo interfásico vetor de clonagem

clivagem com enzima de restrição

DNA ligase vetor recombinante

clivagem com enzima de restrição

RNA mensageiro - Biblioteca de cDNA 1. 2. 3. 4. 5. →

DNAs codificantes de proteínas Extração de RNA Purificação de mRNA (Oligo dT) Síntese de cDNA (transcriptase reversa) Clonagem Apenas as seqüências codificantes estarão presentes neste conjunto de clones!!!!!!

Identificação do clone portador da seqüência de interesse

• Hibridização de ácidos nucléicos – Ácidos nucléicos unifilamentares são misturados sob condições de temperatura e concentração de sal que permitem apenas o pareamento correto de bases entre os filamentos de DNA – Sondas de ácidos nucléicos • DNA clonado ou PCR: várias centenas a vários milhares de nucleotídeos • Oligonucleotídos: 15-60 nucleotídeos • Fragmento de DNA ou RNA de sequência conhecida, marcada – radioativo, – composto bioquímico – substância fluorescente

Métodos de Análise dos Ácidos Nucléicos • Transferência Southern – DNA/digestão/eletroforese/filtro de nitrocelulose/hibridização com a sonda

• Análise com sondas oligonucleotídicas específicas • Transferência Northern – RNA

Identificação do clone portador da seqüência de interesse

Hibridização in situ em cromossomos • Hibridização das sondas ao DNA contido dentro dos cromossomos imobilizados em lâminas de microscopia • Método mais comum: FISH – Citogenética clínica diagnóstica

Análise da Sequência de DNA • Seqüênciamento – – – –

Síntese de DNA Nucleotídos marcados radioativamente Eletroforese Seqüênciamento automatizado – Projeto Genoma Humano

SEQÜENCIAMENTO DE DNA • Desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979), conhecido também como método do término do crescimento da cadeia. • Exige a clonagem do fragmento de DNA a ser sequenciado em vetores apropriados (Ex: da série M13mp) • O príncipio do método: – baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar uma fita de DNA a partir do molde na presença de um iniciador. – A reação de sequenciamento consiste na hibridização de um oligonucleotídeo sintético (iniciador), com uma região conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao inserto a ser sequenciado.

SEQÜENCIAMENTO DE DNA 4. A seguir, promove-se a síntese da fita complementar empregando o fragmento Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotídeos (dNTP), sendo um deles marcado com 32P ou 35S. 5. No processo são realizadas quatro reações independentes, sendo que em cada uma delas é adicionado um tipo de dideoxinucleotídeo (ddNTP). –

Em cada reação, um número muito grande de moléculas de fita complementar estão sendo copiadas simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extensão, uma pequena porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio, devido à ausência do grupamento 3'OH do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a reação de extensão continua a ocorrer até que um ddNTP seja incorporado.

SEQÜENCIAMENTO DE DNA 6. Uma vez terminadas as reações de extensão, cada fragmento recém sintetizado é separado em gel desnaturante de poliacrilamida-uréia e a seguir autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de resolução, é possível então visualizar na autoradiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda específica. Desta forma, é possível analizar de 200 a 300 nucleotídeos por gel. 7. Sendo assim, em cada uma das quatro reações, haverá fragmentos de todos os tamanhos sendo que todos eles tem início comum ou seja adjacente ao iniciador.

Exemplos da utilização da engenharia genética podem ser dados na produção de : – Melhora da qualidade das vacinas contra as doenças (vacinas de DNA); – Produtos humanos puros e em quantidades comerciais como a insulina e o hormônio de crescimento; – Produção de antibióticos por meios mais econômicos ou outrora não existentes; – Plantas mais resitentes a pesticidas, doenças e a insetos; – Plantas com melhora em sua qualidade nutricional.

A tecnologia do DNA recombinante também é usada em: • Terapia gênica • Diagnósticos de doenças genéticas • Medicina forense – Identificação de indivíduos (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorfism ) – Teste de paternidade (STR- Short Tandem Repeats)