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Taller laboratorio 1. Consulte un protocolo de extracción de ADN microbiano de otra casa comercial y describa las similitudes o diferencias con el usado en la práctica. 2. ¿Qué es la integridad de un ADN? Investigue 3. ¿Por qué la integridad y purificación del ADN son cruciales para los experimentos que se realizan en Biología Molecular? Investigue. 4. Investigue y describa la forma como puede conocerse la calidad (integridad y pureza) de cualquier ADN extraído en laboratorio. Solución

1. Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (BayGene/Sigma-Aldrich): este kit es aplicable tanto a bacterias Gram negativas como positivas y el ADN extraído es adecuado para digestiones por endonucleasas de restricción, PCR y Southern blots. Utiliza un sistema basado en sílica con un formato de microcentrifugado y puede aislar ADN de hasta 50 kb de largo. En este kit las células se lisan enzimáticamente en una solución que contiene sales caotrópicas, y el ADN es adsorbido específicamente en la membrana de sílica, luego los otros componentes del lisado son lavados y los contaminantes eliminados. Por último, el ADN es eluído en un búfer apropiado.

BACMAX DNA purification kit (Epicentre Biotechnologies/Cambio): es ideal para aislar ADN de clones de copia única de BAC (cromosoma bacteriano artificial) o clones BAC CopyControl® inducidos, para aplicaciones tales como secuenciación, identificación genética, PCR y preparación de bibliotecas de secuenciación por “shotgun”. Se basa en un procedimiento de lisis alcalina modificado, y utiliza una mezcla de EPICENTRE's® RiboShredder® y ARNasa junto con varios pasos de precipitación selectiva para eliminar contaminantes.

2. El ADN es un ácido nucleico, con nucleótidos que forman las moléculas de DNA. Consta de tres componentes esenciales: una base nitrogenada (purinas; A, G y pirimidinas; C, T), azúcar desoxirribosa, y un grupo fosfato. El emparejamiento de las bases nitrogenadas en dirección C-5´ a C-3´ por puentes de hidrogeno van formando la estructura de doble hélice característica de ADN. Por lo tanto, la integridad del ADN es aquella donde por medio de pruebas (electroforesis) se observen bandas cromosomales integras, descartando ADN fragmentado, degradado o que no sea visible a las centrifugación. Así mismo, tiene la característica que es de alto peso molecular. Por último, que sea puro es decir, que el ADN no se encuentre contaminado con productos resultantes durante la realización de la lisis celular como proteínas (relacionada con mayor contaminación), membrana lipídica, enzimas proteolíticas y demás componentes celulares y que no hallan restos de reactivos y solventes usados durante el procedimiento

3. La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas moleculares que nos llevarán a comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del conocimiento de genes y genomas que anteriormente era inaccesible para la evolución , es importante conocer si el ADN obtenido está integro. La integridad del ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa . Si el ADN está integro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Si está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho o un sendero luminoso en el carril de la muestra . El ADN fragmentado dificulta la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las técnicas.

4. Pureza (espectrofotometría) la absorción ultra violeta puede ser para evaluar la pureza del adn extraído. Para una muestra del ADN , la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280) es 1.8 . Una relación menor a 1.8 indica que la muestra se encuentra contaminada con proteínas o solventes orgánicos como el fenol.

Método de tinción con bromuro de etidio: es un compuesto fluorescente que se intercala entre las bases del ADN . al producirse dicha unión cambia las propiedades de fluorescencia del bromuro de etidio incrementándose la forma muy importante su emisión fluorescente en presencia del ADN, la fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de ADN presente . sin embargo es poco sensible ya que también reacciona al ARN. La interferencia se puede eliminar tratando las muestras con ARNasa

Integridad (electroforesis) la electroforesis en gel de agarosa al 0.7 % (p/v) teñido con bromuro de etidio posteriormente , el gel fue fotografiado bajo luz ultra violeta . si la muestra es integrada presentara una banda de adn única perfectamente definida en la parte superior del agarosa . una muestra del adn degradada presentara una estela a lo largo del gel que sera mas pronunciada cuanto mayor sea la degradación de la muestra .

ARTICULOS DE REFERENCIA 1. 2. 3. 4. 5. 6.

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K182001 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/PrlnkGenmcBro_flr.pdf https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/purelink_genomic_man.pdf file:///C:/Users/usuario02/Downloads/HB-2248002_1104551_HB_DNY_UltraClean_Microbial_0817_WW.pdf https://mobio.com/us/shop/dna-isolation/di-microbial/dneasy-ultraclean-microbial-kit/ http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2014000200003