Southern Northern Western Blot

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN). Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones. Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias. Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes. Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membrana especial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada. Southern Blot: La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).

Southern Blot El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación ó enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon. A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente. Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

Técnica de hibridación de Southern La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano. Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el problema nº 5. Las etapas experimentales empleadas en un laboratorio de medicina legal o forense para el análisis del perfil de ADN son las siguientes: 1. Extracción del ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre. 2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. 3. Electroforesis en gel de agarosa Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos

más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicaión de la muestra. 4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot") Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis. 5. Hibridación con sonda radiactiva Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana. 6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía 7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".

Northern blot Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda. Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.

Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998). El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación de secuencias específicas de RNA. La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño. Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia de RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot. El Western blot se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas. Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado como positivo.