Sintezne Peptidne Ucinkovine

neprimeren farmakokinetič farmakokinetični profil praviloma potrebna parenteralna aplikacija zapletena in draga sinteza potencialna imunogenost

visokospecifič visokospecifične interakcije z endogenimi receptorji praviloma visoka jakost nizka toksič toksičnost malo interakcij z drugimi uč učinkovinami

Peptidne učinkovine: pro et contra

Tomaž Bratkovič

Sintezni peptidi kot biološke učinkovine

• stanje danes: - na tržišču več kot 40 peptidnih učinkovin - ~180 učinkovin v kliničnih raziskavah - več kot 400 učinkovin v predkliniki

• razvoj sinteznih in bioloških peptidnih knjiž knjižnic • napredek tehnologij presejanja visokih zmogljivosti • učinkovitejši sintezni pristopi

Razmah peptidnih učinkovin

Sintezni peptidi – biološke učinkovine?

afinitetna selekcija posameznih bakteriofagnih klonov

Zakaj sintezni peptidi? • patentna zaščita postopka rekombinantnega pridobivanja, • ekonomsko upravičeno pri krajših peptidih, • posebne strukturne zahteve (npr. C-amidacija), • varnost...

SINTEZNE PEPTIDNE UČINKOVINE

osrednji predmet današnjega predavanja:

• izolacija iz tkiv (obsoletno) • tehnologija rekombinantne DNA • kemijska sinteza

Priprava peptidnih učinkovin

Neposredna povezava genotipa in fenotipa!

Tehnologija predstavitve na bakteriofagu

Biološke knjižnice peptidov

kalcitonin,

28 = 256 (brez upoštevanja morebitnih kiralnih centrov v stranski verigi!!!)

Število potencialnih stereoizomerov oktapeptida:

peptid = linearen oligomer α-aminokislin Xaan, n < 100

Zapletenost peptidov

...enfuvirtid, bivalirudin, glatiramer, bortezomib...

Nekatere novejše peptidne učinkovine imajo povsem nove strukture. strukture

...inzulin, vazopresin, oksitocin, somatostatin, agonisti/antagonisti gonadoliberina, pramlintid...

Praviloma endogenim peptidnim hormonom enake učinkovine ali njihovi analogi. analogi

Peptidi kot učinkovine

NH

NH

R2

R2

R2

OH

O

X

NH

H2N

Z2

R2

R2

O

O

NH

NH

aktivacija karboksilne skupine

O

OH

O

O

Z1

R1

R1

R1

O

O

Z1

OH

prva AK

O

O

Z1

zaščita karboksilne skupine

O

se lektivn a odstranitev zaščitne skupine z aminske skupine

R1

tvorba peptidne vezi

H2N

H2N

druga (v reakcijo vstopajoč vstopajoča) AK

zaščita aminske skupine

O

R2

O

NH

O

R1

Nobelova nagrada za kemijo 1984

Robert Bruce Merrifield

HN

O

O

- enostavno odstranjevanje nezreagiranih reagentov, recikliranje - izolacija vmesnih produktov sinteze ni potrebna - omejena kapaciteta polimerni nosilec

• Sinteza na trdnem nosilcu

- klasičen pristop - izolacija vmesnih produktov vsake sintezne stopnje - neomejena kapaciteta

• Sinteza v raztopini

Dva načina kemijske sinteze

Z2

Z2

H2 N

Osnovni principi kemijske sinteze peptidov

ločena sinteza krajših peptidnih segmentov (v raztopini ali na trdnem nosilcu), nato združevanje fragmentov v reakciji kondenzacije in odstranitev zaščitnih skupin.

Način priprave daljših sinteznih peptidov:

Kondenzacija fragmentov

(-COOH, -NH2, -SH, -OH, gvanidinska skupina) (preprečena tvorba razvejanih ali cikličnih peptidov)

- potencialne reaktivne funkcionalne skupine v stranskih verigah

(↑ topnost peptida v organskih topilih, preprečena tvorba kislinskih anhidridov v prisotnosti aktiviranih AK, selektivna aktivacija αkarboksilne skupine v reakcijo vstopajoče AK) - α-aminsko skupino v reakcijo vstopajoče AK [karbamati: Z, BOC, BOC Fmoc] Fmoc (preprečeno vključevanje te bazične in nukleofilne skupine v reakcije)

- α-karboksilno skupino prve AK [estri: MeMe-/EtEt-, BzBz-, t-BuBu-estri] estri

• Uporabljamo ortagonalne zaščitne skupine, skupine tj. takšne, ki jih je mogoče odstraniti pod različnimi pogoji. • Ščitimo:

Zaščitne skupine

delovanje) in na žilnih endotelijskih celicah delovanje – le v suprafizioloških odmerkih!)

(prokoagulativno prokoagulativno

- V2 na endotelijskih celicah zbiralc/distalnega nefrona (antidiureti antidiuretič čno

delovanje),

• hipofizni nevrohormon; imenovan tudi AVP, antidiuretični hormon (ADH) • vazopresinski receptorji (GPCR) so dveh podtipov: vazokonstriktorno - V1 (tudi V1a) na GMC v žilnih stenah arteriol in kapilar (vazokonstriktorno

Vazopresin

kemijsko in optično čisti reagenti (analize: polarimetrija, Tm, HPLC, TLC, NMR, IR, MS), topila, katalizatorji in polimerni nosilci 2 odstranitev vseh nečistot (RP-HPLC) 3 AK-analiza, MS, določitev AK-zaporedja; peptidno kartiranje, NMR, disulfidne povezave

1

Vsaka odstopanja od želene strukturiranosti peptidnih učinkovin imajo za posledico zniž znižanje ali izgubo biološ biološke aktivnosti oz. pridobitev toksič toksičnih ali imunogenih karakteristik na račun spremenjene konformacije. ↓ Kemijsko sintezo je potrebno voditi tako, da omejimo verjetnost nastajanja než neželenih analogov1, končni produkt pa izolirati in temeljito preč prečistiti2 ter dokazati ustreznost kemijske strukture3.

Kakovostne zahteve

von Willebrandova bolezen tipa I ter lažja oblika hemofilije A

preprečavanje nočne enureze pri otrocih

kranialni diabetes insipidus

indikacije

dezmopresin

selektivni agonist receptorjev V2, zato deluje antidiuretič antidiuretično, no nima pa vazokonstriktornega delovanja; spodbuja tudi sproščanje vWF in fVIII in tako učinkuje prokoagulativno

Danes zaradi neprimernega PK-profila in multipotentnosti (neželeni učinki: angiozna bolečina, nevarnost miokardnega infarkta, hiponatremija, zastrupitev z vodo, krčenje endometrija) uporaba pretežno opuščena.

alternativa kateholaminskim vazokonstriktorjem pri hipotenziji (npr. septični šok)

kranialni diabetes insipidus (poliurija in polidipsija zaradi pomanjkanja endogenega hormona)

indikacije

Vazopresini Oksitocini Somatostatini Kalcitonini Analogi gonadoliberina Enfuvirtid Pramlintid Eptifibatid Bivalirudin Glatiramer Peptidne učinkovine praviloma apliciramo parenteralno! Bortezomib

Vazopresin

• • • • • • • • • • •

Okrnjen pregled peptidnih učinkovin

preprečevanje mastitisa

spodbujanje dojenja

Sistemska terapevtska uporaba GHIF in analogov je problematič problematična.

⇓

• zapletena fiziologija: - ni klasičen hormon temveč parakrino delujoča signalna molekula, - biosinteza poteka v večini tkiv, v največji meri pa v endokrinem delu pankreasa, sluznici prebavil in centralnem ter perifernem živčevju, - poznamo dve obliki biološko aktivnega somatostatina - znanih je pet podtipov somatostatinskih receptorjev (GPCR): sst1sst5, katerih pojavnost ni tkivno specifična; celo na isti celici so lahko različni receptorji sst

Somatostatin

omejevanje poporodnih krvavitev zaradi atonije maternice

sprožitev poroda (odsotnost naravnih popadkov)

indikacije

povišano izražanje somatostatinskih receptorjev je značilno za številne tumorske celice

- inzulina in glukagona iz endokrinih celic trebušne slinavke, - amilaze iz eksokrinega dela trebušne slinavke, - gastrina iz celic G v želodčni sluznici, - kateholaminov in indolaminov v CŽS...

akromegalija nekateri drugi tumorji (antiproliferativno antiproliferativno delovanje) delovanje

indikacije

somatostatinsomatostatin-14

lanreotid

oktreotid

preprečevanje/omejevanje krvavitev iz ezofagealnih varic cirotičnih bolnikov (nepoznan vazokonstriktrni mehanizem delovanja)

indikacija

Somatostatin

•

•

• hipofizni nevrohormon • spodbuja krčenje GMC v steni maternice in alveolah mlečnih žlez

peptidni mediator, udeležen v uravnavanje sproščanja: - rastnega hormona (⇒ GHIF), GHIF tirotropina in prolaktina iz adenohipofize,

Somatostatin

Oksitocin

uravnavanje menstrualnega cikla

spermatogeneza

!

• Agonisti gonadoliberina ob kontinuirani uporabi izzovejo neodzivnost adenohipofize na endogeni gonadoliberin in tako so njihovi končni učinki podobni antagonistom. antagonistom

• gonadoliberin je hipotalamusni peptidni nevrohormon • izzove sintezo in sproščanje gonadotropinov LH/ICSH in FSH iz adenohipofize

nadzorovana hiperstimulacija jajčnikov z namenom superovulacije (+ rekombinantni FSH in hCG) v okviru oploditve z biomedicinsko pomočjo

prezgodnja puberteta

endometrioza

paliativno zdravljenje tumorjev, odzivnih na steroidne spolne hormone (rak prostate, rak dojke; antiproliferativno delovanje) delovanje

indikacije

Analogi gonadoliberina

**........razlike v imunogenosti, jakosti in t1/2

metastazne bolečine

(izključno sintezen)

karbokalcitonin

lososov kalcitonin

humani kalcitonin

Analogi gonadoliberina

*..........razlike v profilu nečistot

K

hiperkalciemija povezana z rakavimi obolenji

Pagetova bolezen kosti (deformirajoči osteitis)

osteoporoza

• sintezni : rekombinantni * • humani, lososov in sintezni analog kalcitonina **

• ščitnični hormon • vzdržuje homeostazo kalcijevih ionov indikacije

Kalcitonin

Kalcitonin

humani amilin

pramlintid

kot remedium adiuvans pri inzulinskem zdravljenju diabetesa mellitusa

indikacija

sinergistično uravnavata plazemski nivo glukoze amilin deluje na CŽS (prehaja krvno-možgansko pregrado): upočasnjuje praznjenje želodca ter tako zadržuje absorpcijo ogljikovih hidratov ter izzove občutek sitosti

• •

•

endogeni amilin (IAPP, islet amyloid polypeptide) nastaja v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in se v kri izloča skupaj z inzulinom

•

•

sintezni analog humanega amilina, peptidnega nevroendokrinega hormona. ne tvori potencialno toksičnih fibrilarnih agregatov (amilin fibrilizira)

Pramlintid

• največja sintezna peptidna učinkovina (36 AK) • strukturno posnema fragment ektodomene transmembranskega glikoproteina gp41 virusa HIV-1 • zavira proces zlitja virusne ovojnice na gostiteljske celice (limfocite CD4+)

Enfuvirtid

Pramlintid

abareliks (antagonist)

goserelin (agonist)

buserelin (agonist)

gonadoliberin

Analogi gonadoliberina

* * Nε-aminoiminometillizin

(tudi pri pacientih, ki jim nameravajo koronarno arterijo rekanalizirati s postopkom perkutane transluminalne koronarne angioplastike)

preprečevanje ishemičnih dogodkov pri bolnikih z akutnim koronarnim sindromom oz. nestabilno angino pektoris

indikacija

sinergističen učinek

⇓

•

•

a

b

b

ob interferonih β edina učinkovina, ki spremeni potek bolezni pri bolnikih z MS

zmanjševanje frekvence zagonov in upočasnjevanje napredovanja invalidnosti pri bolnikih z RRMS

indikacija

zmes acetatnih soli sinteznih oligopeptidov povprečne molekulske mase 4,7 – 11 kDa, z AK-sestavo Tyr : Glu : Ala : Lys : = 1,0 : 1,5 : 4,5 : 3,6 (množinsko razmerje) dajemo ga subkutano – “terapevtska vakcinacija” vakcinacija”

•

visokospecifičen neposreden reverzibilen inhibitor trombina terapija je vselej kombinirana z acetilsalicilno kislino (tudi antiintegrini)

• •

a

“sintezni hirudin” - v strukturi združuje dva fragmenta hirudina: a. segment, ki se veže v aktivno mesto trombina, in b. segment, ki interagira z oksianionsko luknjo trombina

Glatiramer

•

Bivalirudin

Bivalirudin

(tudi pri pacientih, ki jim nameravajo koronarno arterijo rekanalizirati s postopkom perkutane transluminalne koronarne angioplastike)

preprečevanje ishemičnih dogodkov pri bolnikih z akutnim koronarnim sindromom oz. nestabilno angino pektoris

indikacija

• krajši sintezni fragment barburina, toksina iz strupa severnoameriške klopotače Sistrurus miliarius barbouri • mimetik strukture fragmentov endogenih ligandov integrinskega receptorja (vWF, fibrin ipd.): Arg-Gly-Asp • antitrombotik, antagonist gpIIb/IIIa

Eptifibatid

⇑

multipli mielom

indikacija

[ NF-κB izzove transkripcijo številnih zaviralcev apoptoze ter celičnih adhezivnih proteinov ]

• mielomske celice imajo močno povišano aktivnost jedrskega dejavnika NF-κB v primerjavi z normalnimi hemopoetskimi celicami • proteasom je posredno odgovoren za aktivacijo NF-κB (prek razgradnje njegovega zaviralca IκB)

Bortezomib

Indikacijska področ področja - trendi

Sklepi

dostavni sistemi

sintezna cepiva

antagonisti ali inhibitorji PPI

agonisti

Mehanizem delovanja

!

sintezen dipeptid z boronskim analogom L-levcina učikuje kot visokoselektivni reverzibilni zaviralec kimotripsinu podobne proteazne podenote proteasoma 20S

• •

•

posnema strukturo antigenov mielinskega bazičnega proteina (MBP): periferna senzibilizacija limfocitov T z “napačnimi” antigeni vodi v CŽS ob kontaktu z MBP do sproščanja protivnetnih (Th2) citokinov imunomodulatorno delovanje) (imunomodulatorno delovanje

Bortezomib

Glatiramer