Sidra-final.docx

TecNM

SEP

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO

INGENIERÍA DE BIORREACTORES. PROYECTO

ING. ADRIANA GALICIA

GRUPO B 10:00 am- 13:00 Pm.

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INDICE INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 4 OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 4 PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA ............................................................................... 5 HIPOTESIS ....................................................................................................................... 5 MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 6 Biorreactor .................................................................................................................... 6 REACTOR BIOLÓGICO Y SU DISEÑ O ........................................................................ 7 CLASIFICACIÓN ........................................................................................................... 8 MODO DE OPERACIÓN Y SISTEMAS DE CULTIVO ................................................... 9 CLASES, Y CARACTERÍSTICAS ................................................................................. 9 CLASES DE REACTORES ......................................................................................... 10 APLICACIONES DE LOS BIORREACTORES ............................................................ 10 COMPONENTES DE UN SISTEMA DE AGITACIÓN .................................................. 11 Sistemas de operación .............................................................................................. 12 Sistema continuo ...................................................................................................... 12 Sistema discontinuo o batch ..................................................................................... 13 Sistema semi-discontinuo ......................................................................................... 14 Material y elementos del biorreactor ......................................................................... 15 AGITACIÓN ................................................................................................................. 16 FERMENTACIÓN ........................................................................................................ 17 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ................................................................................ 19 LEVADURAS ............................................................................................................... 20 SACCHAROMYCES CEREVISIAE .............................................................................. 21 SIDRA .......................................................................................................................... 22 Fuente de nutrientes y sustancias no nutritivas ............................................................ 23 Valoración nutricional ................................................................................................... 23 ºBrix ................................................................................................................................ 23 Metodología medición de grados Brix ...................................................................... 23 pH.................................................................................................................................... 23 Metodología medición de pH ..................................................................................... 23 Cámara de Neubauer ..................................................................................................... 24 Metodología cámara de Neubauer ............................................................................ 24 Tipos de conteo .......................................................................................................... 25 Curva de McFarland....................................................................................................... 25 2

Metodología curva de McFarland .............................................................................. 26 NMX-V-011-1992. BEBIDAS ALCOHÓLICAS. SIDRA GASIFICADA. ESPECIFICACIONES. ..................................................................................................... 26 NORMA Oficial Mexicana NOM-199-SCFI-2017, Bebidas alcohólicas-Denominación, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y métodos de prueba....... 27 SIMULACIÓN EN SUPERPRO DESIGNER .................................................................... 29 MATERIALES Y EQUIPOS ............................................................................................. 35 EQUIPO........................................................................................................................... 35 PROCEDIMIENTO .......................................................................................................... 36 RESULTADOS ................................................................................................................ 39 CÁLCULOS ..................................................................................................................... 39 N° Células Mc Farland ................................................................................................. 39 N° Células Neubauer.................................................................................................... 41 CURVA DE MC FARLAND .......................................................................................... 43 ANALISIS DE RESULTADOS ......................................................................................... 44 CONCLUSIÓN................................................................................................................. 44 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 47 ANEXOS ......................................................................................................................... 48

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INTRODUCCIÓN Un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaerobio. Los biorreactores industriales usualmente emplean bacterias u otros organismos simples que pueden resistir la fuerza de agitación. También son fáciles de mantener ya que requieren solo soluciones simples de nutrientes y pueden crecer a grandes velocidades. La fermentación es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidación incompleta, típico de los organismos anaeróbicos. Se realiza, pues, sin la intervención del oxígeno. El objetivo de dicha fermentación es proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello descomponen las moléculas de glucosa y obtienen la energía para sobrevivir, producir el alcohol y CO2. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos que están en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico. Entre las fermentaciones mas comunes se encuentra la que lleva a cabo las levaduras en la transformación del azúcar en alcohol y anhídrido carbónico; el alcohol, a su vez, por intervención de otros microorganismos, puede ser transformado en ácido acético. También es común la fermentación láctica, que transforma la glucosa en ácido láctico. Otro tipo de fermentación es la bebida a la acción de algunos microorganismos sobre sustancias orgánicas en putrefacción, con liberación de amoniaco.

OBJETIVO GENERAL Automatizar un biorreactor para el crecimiento óptimo de células, para la obtención de sidra utilizando como materia prima jugo de manzana, por medio de la Fermentación alcohólica.

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PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA Un biorreactor es un sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo, el cual controla ciertas condiciones de pH, temperatura, concentración de oxígeno, las cuales propician el crecimiento apto de células necesarias para la obtención del producto deseado. Por lo antes expuesto nos vemos a la necesidad de automatizar el biorreactor de Batch del Tecnológico de Acapulco, para controlar las condiciones de pH, temperatura y RPM, para el correcto crecimiento de las células de levadura del género Saccharomyces cerevisiae para la producción de sidra de manzana a partir de la fermentación alcohólica.

HIPOTESIS Hipótesis de investigación

Hipótesis nula

Hipótesis alternativa

•La automatizacion del Biorractor para el control de pH, temperatura y RPM permitio el correcto crecimiento de Saccharomyces c. obteniendo fermentacion alcoholica para la produccion de sidra de manzana.

• Solo fue posible automatizar el Biorreactor para el control de las RPM creando un ambiente no apto para el crecimiento de levaduras Saccharomyces c.sin obtener productos de la fermentacion.

•Solo fue posible la autimatizacion del Biorreactor para le control de temperatura y RPM creando asi,un ambiente no solo apto para el crecimiento de levaduras Saccharomyces C. si no tambiel para el crecimiento de otros microorganismos obteniendo diferentes productos de la fermentacion.

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MARCO TEÓRICO BIORREACTOR Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaerobio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxigeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. El diseño de los biorreactores es una tarea de ingeniería relativamente compleja y difícil. Los microorganismos o células son capaces de realizar su función deseada con gran eficiencia bajo condiciones optimas. Las condiciones ambientales de un biorreactor tales como flujo de gases (por ejemplo, oxigeno, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.), temperatura, pH, oxigeno disuelto y velocidad de agitación o circulación, deben ser cuidadosamente monitoreadas y controladas. La mayoría de los fabricantes de biorreactores usan recipientes, sensores, controladores y un sistema de control interconectados para su funcionamiento en el sistema de biorreacción. Se requiere de un intercambiador de calor para mantener el bioproceso a temperatura constante. La fermentación biológica es una fuente importante de calor, por lo que en la mayor parte de los casos, los biorreactores requieren de agua de enfriamiento. Pueden ser refrigerados con una chaqueta externa o, para recipientes sumamente grandes, con serpentines internos. En un proceso de aeróbico, la transferencia optima de oxigeno es tal vez la tarea más difícil de lograr. El oxigeno se disuelve poco en agua (y aun menos en caldos fermentados) y es relativamente escaso en el aire (20,8 %). La transferencia de oxigeno usualmente se facilita por la agitación que se requiere también para mezclar los nutrientes y mantener la fermentación homogénea. Sin embargo, existen límites para la velocidad de agitación, debidos tanto al alto consumo de energía (que es proporcional al cubo de la velocidad del motor) como al daño ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo de corte excesivo.

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Los biorreactores industriales usualmente emplean bacterias u otros organismos simples que pueden resistir la fuerza de agitación. También son fáciles de mantener ya que requieren solo soluciones simples de nutrientes y pueden crecer a grandes velocidades. El diseno ̃ en bioingeniería no es solo la aplicación de conceptos básicos y teóricos que conlleven a lograr un prototipo; para la realización integra de un modelo, otra gran parte, trata de la adaptación creativa y de la utilización del ingenio propio para lograr el objetivo de conjuntar el ambiente biológico de un cultivo vivo con el ambiente artificial de un dispositivo controlado; este es el resultado denominado biorreactor o reactor biológico. Un biorreactor es por tanto un dispositivo biotecnológico que debe proveer internamente un ambiente controlado que garantice y maximice la producción y el crecimiento de un cultivo vivo; esa es la parte biológica. Externamente el biorreactor es la frontera que protege ese cultivo del ambiente externo: contaminado y no controlado. El biorreactor debe por tanto suministrar los controles necesarios para que la operación o proceso (bioproceso) se lleve a cabo con economía, alto rendimiento (productividad) y en el menor tiempo posible; esa es la parte tecnológica.

REACTOR BIOLÓGICO Y SU DISEÑ O Lo primero que hay que entender en el diseño de reactores biológicos es que contrario a los quim ́ icos, su cinética no está determinada exclusivamente por la velocidad de reacción y las variables que la determinan. Aunque se puede describir de manera similar a la quim ́ ica, la cinética biológica también depende de caracteriś ticas intrin ́ secas del organismo o cultivo tales como crecimiento y tasa de división celular, así como del tipo de operación que se lleve a cabo. Por eso, lo primero que se define en el diseño de un biorreactor es el propósito de utilización; es decir, qué tipo de cultivo se va a utilizar, el modo de operar y/o el proceso de cultivo. El conjunto biorreactor- sistema de cultivo debe cumplir con los siguientes objetivos:

1. Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo. 2. Mantener constante y homogénea la temperatura. 3. Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes. 4. Prevenir la sedimentación y la floculación. 5. Permitir la difusión de gases nutrientes a la velocidad requerida por el cultivo. 6. Mantener el cultivo puro. 7. Mantener un ambiente aséptico. 8. Maximizar el rendimiento y la producción. 9. Minimizar el gasto y los costos de producción. 10. Reducir al máximo el tiempo. 7

CLASIFICACIÓN 

Clasificación operativa

Tanto biorreactores como fermentadores se clasifican primeramente de acuerdo al modo de operación: discontinuo, semicontinuo, continuo. Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico (biorreactor). En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesal-productiva del bioproceso (cultivo). Al operar un biorreactor en una determinada categoria ́ (discontinuo, semicontinuo, continuo), automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el proceso productivo del sistema. 

Clasificación biológica

Los sistemas biológicos deben interaccionar con el ambiente externo para poder crecer y desarrollarse; es por eso que los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al metabolismo procesal del sistema de cultivo: anaeróbico, facultativo, aeróbico. Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas-biológicas de diseño y de operación del biorreactor. Estas caracteriś ticas son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo; por lo que, definen la clasificación biológica- procesal del sistema de cultivo. 

Clasificación biológica-operativa

Ambas clasificaciones; la biológica y la operativa, son procesalmente interdependientes y en su conjunto afectan el diseno ̃ final del biorreactor. Al conjuntarse ambas clasificaciones, se conjuntan también la función operativa y la biológica para establecer entre ambas un propósito de utilización, el modo de cultivo y el bioproceso. Siendo el propósito de utilización, el destino de cultivo del biorreactor; para qué tipo de cultivo va a ser utilizado el biorreactor; el modo de cultivo es sinónimo de sistema de cultivo y el bioproceso es en si,́ todo el proceso. para la historia

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MODO DE OPERACIÓN Y SISTEMAS DE CULTIVO El modo de operación de un sistema de cultivo, es sinónimo del modo de operar del biorreactor o fermentador. Éste no solo influye en el diseño propio del reactor, también, en el modelo cinético de crecimiento del cultivo y en el proceso de producción. Existen tres modos de cultivo aunados a tres modos básicos de operación: 

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

Discontinuo(batch): por lotes o tandas, sin alimentación (F); se coloca dentro del biorreactor la carga total de cada proceso (tanda o lote) de cultivo o fermentación y se dejar que se lleve a cabo el proceso productivo o la fermentación por el tiempo que sea necesario; el cuál se denomina tiempo de retención. Semicontinuo (fed-batch): por lotes alimentados, con alimentación de entrada (F1); se alimenta una línea de entrada o alimentación (F1) para que el sistema de cultivo tenga un producto (biomasa) con máximo de crecimiento (exponencial) y aumente la productividad. Continuo (continuos): por quimioestato, se alimenta una línea de entrada F1 o alimentación y se drena una línea de salida F2 o lavado; de manera que los flujos o caudales de ambas lin ́ eas sean iguales y la producción sea continua.

CLASES, Y CARACTERÍSTICAS El análisis de las reacciones químicas y biológicas que ocurren en el ambiente receptor y en los sistemas de tratamiento es complejo por las muchas interacciones que interfieren en la interpretación de los resultados estadiś ticos. Para entender la naturaleza de los mecanismos que operan, se han desarrollado modelos para los procesos de transformación y tratamiento de los constituyentes de las aguas residuales. Estos modelos se basan en el análisis del sistema de flujo en el cual ocurren las reacciones. A continuación se describen las clases de reactores empleados en el tratamiento de aguas residuales, se definen sus características hidráulicas y las aplicaciones más comunes.

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CLASES DE REACTORES En el tratamiento de las aguas residuales se emplean reacciones químicas y biológicas que transcurren bajo condiciones controladas en el interior de unidades o tanques llamados reactores. Las principales clases de reactores actualmente empleados son: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Reactor de flujo intermitente, también llamado reactor batch o de cochada Reactor de flujo pistón, conocido también como reactor de flujo tubular. Reactor de mezcla completa o reactor de tanque agitado con flujo continuo Reactores de mezcla completa conectados en serie Reactor de lecho empacado Reactor de lecho fluidizado; y Reactor de manto de lodos con flujo ascendente.

Las reacciones homogéneas se desarrollan usualmente en los cuatro primeros reactores; mientras que las heterogéneas suelen hacerlo en las tres últimas clases de reactores. Los biorreactores comúnmente tienen las siguientes caracteriś ticas:      

El diseño de los biorreactores es cilin ́ drico Los biorreactores varia n de taman o ́ ̃ s milimétricos hasta llegar a los metros cúbicos La mayoria ́ de los biorreactores son de acero inoxidable. Los biorreactores mantienen condiciones ambientales en un mismo estado Mantienen las células de un cultivo uniformemente distribuidas Los biorreactores previenen la sedimentación y la floculación.

APLICACIONES DE LOS BIORREACTORES

Las principales aplicaciones de los biorreactores son: 1. Producción de enzimas, protein ́ as y anticuerpos Para la producción de medicamentos a menudo se utiliza el cultivo de células o microorganismos en biorreactores. Se trata principalmente de procesos por lotes, en los que se llena el reactor por completo, y tras el transcurso del tiempo de reacción o de crecimiento, se vuelve a vaciar. La presión y el nivel deben monitorizarse continuamente para poder obtener un producto final de alta calidad.

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2. Tratamiento de aire contaminado (biodepuración)

En la contaminación del aire, la biorreacion simplemente es el uso de microbios para consumir contaminantes de una corriente de aire contaminado. Casi cualquier sustancia, con la ayuda de microbios, se descompondrá (desintegrará), dado el medio ambiente apropiado. Esto es especialmente cierto para los compuestos orgánicos. Sin embargo, ciertos microbios también pueden consumir compuestos inorgánicos, tales como el sulfuro de hidrógeno y los óxidos de nitrógeno. 3. Depuración de aguas residuales Las principales áreas de aplicación e investigación para los biorreactores en la depuración de aguas residuales son a la fecha seis: revisiones críticas, aspectos fundamentales, tratamiento de aguas residuales municipales y domésticas, aguas residuales industriales, tratamiento para purificación de agua y otras, las cuales incluyen la remoción de gas, el tratamiento de lodos y la producción de hidrógeno. Con lo anterior, se puede observar que la aplicación e investigación en este campo está cobrando una importancia extraordinaria ya que la profundización en los fundamentos de la tecnología es básica para lograr un óptimo rendimiento de los biorreactores. La aplicación de estas tecnologías permite la separación del fango y el liq ́ uido mediante membranas, obteniendo ventajas importantes frente a la separación en los tradicionales decantadores secundarios. El aumento de la demanda de agua ha impulsado la implantación de estos sistemas a escala real, especialmente en aquellos casos en que se plantea la posibilidad de reutilización de agua.    

Biolixiviación de minerales Los biorreactores generalmente son utilizados para el cultivo de las células Los biorreactores ayudan a acelerar los cultivos celulares Los biorreactores son útiles en ingenieria ́ s de tejidos

COMPONENTES DE UN SISTEMA DE AGITACIÓN    

Tanque con fondo redondeado para evitar regiones estancadas. Impulsores (impeler o rodetes). Pantallas deflectoras (Baffles). Eje de rotación. Transmite la potencia del motor al impulsores, diámetros ¾” – ½” y de acero inoxidable. 11



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Motor Impulsor, debe ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la potencia teórica requerida para agitar el fluido y el cultivo a Re≥3000. Sello Mecánico: Evita la contaminación, mantiene hermético el sistema, sirve de amortiguador de fricción, permitir la esterilizar in situ del biorreactor, mediante una línea de vapor sobrecalentado.

Sistemas de operación Las distintas operaciones con biorreactores se clasifican de la siguiente forma: Sistema continuo

En el sistema de fermentación continuo se añade al biorreactor una disolución rica en nutrientes y se inoculan (se añade levadura al sustrato) una cantidad inicial determinada de microorganismos. Una vez hemos realizado el proceso de inoculación, se suministra un flujo continuo de alimentación al primer biorreactor. Un sistema continuo puede trabajar en serie, donde se conectan los biorreactores entre ellos, y se especifica un flujo saliente del reactor (que es el flujo de entrada del siguiente reactor y un tiempo de residencia). Así pues, se realiza la misma operación para cada uno de los siguientes reactores que se suceden, obteniendo como último flujo de salida el producto deseado. Si las condiciones son uniformes y el mezclado es correcto, se alcanza el estado estacionario esporádicamente (estado de equilibrio dinámico). En este estado varios parámetros permanecen constantes a través del tiempo como el tiempo de residencia, concentraciones y propiedades del producto. Este tipo de biorreactores tiene las siguientes ventajas: Poca fluctuación en varios parámetros como la concentración del sustrato, concentración de microorganismos y producto. 

El método permite a los microorganismos crecer en condiciones de estado estacionario donde el crecimiento ocurre a una velocidad constante y controlada. Por lo contrario, los inconvenientes de este tipo de biorreactores son:  Hay una mayor probabilidad de contaminación en la alimentación en comparación a otros tipos de sistemas, si no se toman las medidas preventivas oportunas. En dicho caso, se tendría que parar el proceso y de nuevo alcanzar el estado estacionario con el correspondiente coste económico asociado.  Los microorganismos mutan durante su crecimiento celular y estos no satisfacen la calidad deseada. Este suceso es debido al almacenamiento 12

prolongado.  El coste de inversión es elevado en estos equipos y no se puede dar una fermentación de diferentes productos. Sistema discontinuo o batch

En este tipo de sistema, se añade inicialmente al biorreactor una solución con todos los nutrientes necesarios para que los microorganismos puedan llevar a cabo la fermentación. En esta primera fase también se añade una determinada cantidad de microorganismos para alcanzar una concentración inicial conocida y que permita controlar el desarrollo de la reacción. En este proceso, a medida que avanza la reacción nos encontramos ante un sistema transitorio donde la concentración de microorganismos, sustrato de nutrientes y producto va alcanzando distintos valores a medida que evoluciona el transcurso de la reacción. Al ser un régimen transitorio, se pueden distinguir las siguientes fases: 

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

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Lag. En esta fase no hay división celular de los microorganismos. Las células se adaptan al nuevo medio y usan la energía producida para sintetizar las enzimas necesarias para subsistir en el nuevo medio. Crecimiento. Se da una formación de nuevas células siguiendo una ley exponencial. Esta división celular empieza a decrecer a causa del agotamiento de nutrientes, cambios en el medio de reacción o elevada concentración de productos tóxicos como resultado de la fermentación. Estacionaria. La proporción de nutrientes y biomasa se encuentra en equilibrio. Se detiene la división celular. El punto de inflexión lo encontraremos cuando se alcance la concentración máxima de biomasa. Sin embargo, llega un punto determinado en que la división celular se detiene por causa de dos motivos principales: escasez o agotamiento de nutrientes o que algunos productos de reacción sean tóxicos para dicho microorganismo en concentraciones elevadas.

Respiración endógena. El número de muertes celulares supera el de nuevas células. Esta fase se extiende hasta alcanzar la zona de respiración endógena(los microorganismos empiezan una autooxidación de su materia celular para subsistir) o hasta que todas las células han muerto.

Finalmente, una vez que se ha alcanzado la cantidad y calidad de producto deseado, el biorreactor se vacía. Posteriormente, el interior del reactor se lava y esteriliza antes de proceder con la siguiente carga a producir. Este tipo de biorreactores tiene las siguientes ventajas: 13

     

Nivel bajo de riesgo de contaminación (no hay entrada continua de alimentación y se aplican medidas higiénicas al finalizar cada carga). Flexibilidad operacional cuando en el mismo equipo se desea producir diferentes productos. Costes de operación bajos. Por lo contrario, los inconvenientes de este tipo de biorreactores son: Tiempos muertos largos inherentes al proceso para asegurar la esterilidad y ausencia de contaminantes en el proceso. Se necesita mano de obra que aumenta los costes fijos del proceso. La optimización del proceso se vuelve complicada si se requiere producir muchos tipos diferentes de productos con distinta productividad.

Sistema semi-discontinuo

En un sistema semi-discontinuo, al inicio se opera de una manera similar a un proceso batch. Así pues, en el biorreactor se añade una disolución rica en nutrientes y posteriormente se inocula con levadura. Tal y como comentamos en el proceso de fermentación en un reactor batch, al principio del proceso hay un determinado tiempo “lag” en el que no se desarrolla la fermentación. Así pues, la operativa a seguir es dejar transcurrir el tiempo lag. Una vez se ha alcanzado este tiempo, se reemplaza un volumen determinado del reactor (se traslada a otro reactor llamado “purga”) y se sustituye por otro con la misma concentración de nutrientes inicial. De esta forma, partimos des de la fase de crecimiento exponencial de células y enriquecemos el medio con nutrientes que han sido consumidos anteriormente durante la fase lag. Por tanto, aumentamos la velocidad de obtención de producto ya que dispondremos de mejores condiciones de la fermentación. El objetivo es enriquecer el medio con presencia de nutrientes. Los procesos de alimentación y de purga se suceden periódicamente a intervalos de tiempo constantes.

Este tipo de biorreactores tiene las siguientes ventajas:  El uso de este sistema permite eliminar los tiempos muertos en la línea de producción. El objetivo de esta sistema es que los tiempos “lag” se reducen considerablemente porque partimos de un medio dónde las células se encuentran en la fase de crecimiento. Por tanto, sólo deben adaptarse a un entorno dónde las condiciones de división celular son buenas. Este tipo de biorreactores tiene las siguientes desventajas:  El sistema es más caro de operar y de instalar. 14

 Puede producirse contaminación durante los procesos de alimentación y purga.  Mutaciones celulares por sobreuso de la misma cepa durante largos períodos de tiempo. Material y elementos del biorreactor

La función principal de un fermentador es la de proporcionar un medio controlado que permita el crecimiento eficaz de las células y la formación de producto. Por ese motivo el biorreactor consta de los siguientes elementos. 1. Recipiente o cuerpo del biorreactor. El cuerpo del biorreactor es la frontera física entre el ambiente externo y contaminado y el ambiente interno controlado. La función del recipiente es la de albergar el cultivo. El material usado es el acero inoxidable austenítico (en la industria cervecera se suele usar los aceros de las series). Se usa este acero puesto que el biorreactor necesita un material que se pueda ser esterilizado con vapor a presión, resistente a la corrosión química y con materiales no tóxicos para el organismo 2. Sistema de agitación. Su función consiste en generar potencia necesaria para producir una mezcla perfecta para el sistema de cultivo y así crear un régimen de agitación idóneo. De esta forma, se optimiza los fenómenos de transferencia de calor y masa. Este sistema consta de diferentes elementos para su funcionamiento.  Motor impulsor. Se trata de un motor de inducción de corriente alterna(A.C). Este mantiene periodos largos de operación continua y de trabajo duro. Además debe ser acorazado y de acero inoxidable.  Eje transmisor de potencia. Es una barra cilíndrica de acero inoxidable 316L y por lo general se diseña en diámetros estándar de ¾”, ½”, para mayor facilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. Su longitud depende de la profundidad del contenedor. Este transmite la potencia del motor al impulsor a través de las hojas de agitación.  Puerto de entrada del biorreactor. Es la superficie física sobre el cual se instala un dispositivo de entrada o salida al biorreactor.  Sello mecánico. Tiene como función evitar la contaminación, mantener hermético el sistema y servir de amortiguador de fricción. Además debe permitir la esterilización in situ del biorreactor, mediante una línea de vapor sobrecalentado.  Turbina. Impulsor de flujo axial el cual opera como una centrifuga que distribuye el flujo de líquido a través de hojas planas a todo el volumen de fluido. 15

3. Sistema de control de la temperatura. El termómetro elegido es uno convencional de laboratorio, digital y que es lo suficientemente largo como para estar en contacto con la disolución. 4. Sistema de control del PH. El sensor es altamente resistente a temperatura, líquidos y evitamos el problema que el cristal se rompa durante el proceso de fermentación. Además es suficientemente largo para estar en constante contacto con la disolución.

AGITACIÓN El proceso de agitación en un biorreactor es de gran importancia. La agitación tiene como finalidad transferir un trabajo al medio de reacción por medio de un par aplicado por un motor conectado a un eje con una turbina. De esta manera, se asegura que la mezcla sea continua y lo más homogénea posible. El biorreactor de tipo tanque con agitación convencional incluye un sistema de agitación mecánico, que consiste en un eje vertical con varios agitadores. La mayoría de los biorreactores de platos (Rushton) están equipados con turbinas de discos localizadas a lo largo del eje y con dimensiones controladas para conseguir un buen mezclado y una buena dispersión a través del medio. Además disponen de varios deflectores (usualmente entre 4 y 6) cuya anchura representa el 10% del diámetro del recipiente, localizado a lo largo del perímetro del reactor con objeto de incrementar la turbulencia. El aire estéril se introduce por la base del tanque. Para diseñar el sistema de agitación se deben fijar las siguientes variables:  Geometría del tanque.  Tipo de agitador.  Existencia de deflectores.  Densidad del medio de cultivo.  Caudal de aireación (volúmenes de aire/volumen del fermentador y minuto).  Velocidad de agitación. En primer lugar se debe escoger el tipo de rodete adecuado entre las alternativas:

Ilustración 1 Diferentes tipos de rodetes: a) Rushton, b) paletas y c) hélice

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La turbina de disco o Rushton con seis o cuatro hojas requiere mucha potencia aunque es sencilla y fácilmente intercambiable. El ángulo de la paleta puede variar. La de tipo hélice es la más usada para el cultivo de células vegetales y animales ya que no crea un efecto alto de cizalla. El agitador más efectivo es uno de turbina con deflectores. Combinando así las ventajas de uno y otro.

FERMENTACIÓN La fermentación es un proceso de tipo catabólico, es decir, de transformación de moléculas complejas, en moléculas simples, dentro del metabolismo. Así la fermentación es un proceso catabólico de oxidación que tiene lugar de forma incompleta, siendo además un proceso totalmente anaeróbico (sin presencia de oxígeno), dando como producto final un compuesto de tipo orgánico, el cual caracteriza por lo general, a los distintos tipos de fermentaciones existentes, pudiendo así realizar una clasificación y una diferenciación. La fermentación fue descubierta por el químico francés, Louis Pasteur, el cual, en un principio, se refirió al proceso con la frase “la vie sans l’air”, es decir, la vida sin aire. Anteriormente se creía que las fermentaciones eran procesos químicos, donde no se necesitaba la presencia o intervención de ningún microorganismo. Fue Pasteur, quien desmintió esta creencia, gracias a la ayuda del microscopio, pudiendo identificar a los microorganismos que participaban en los procesos de fermentación, e incluso destacando a dos tipos diferentes de levaduras, las cuales jugaban un papel clave en dicho proceso. Una de las levaduras producía alcohol, y la otra daba ácido láctico, el cual estropeaba el vino, dándole un sabor agrio, siendo precisamente los estudios del vino encargados por una fábrica, que quería resolver el problema del vino, lo que llevó a Louis Pasteur a dar con la clave de la fermentación. En las fermentaciones (del latín “fermentare”, es decir, hacer que fermente o suba), los sustratos energéticos son oxidados y degradados sin que participe en dicho proceso ningún aceptor de electrones externo. Generalmente, la vía catabólica fabrica compuestos de tipo intermedios, como por ejemplo, el piruvato, el cual actúa como un aceptor de electrones. Las fermentaciones habitualmente, se dan en condiciones anaeróbicas, a pesar de que en ciertas ocasiones, el oxígeno puede encontrarse presente. Sin respiración aerobia o anaerobia, el NADH (nicotinamida adenina dinucleótido), no se encuentra oxidado por la cadena que transporta electrones porque no se encuentra disponible ningún aceptor de electrones externo. Además el NADH, que se ha producido en la vía glucolítica mientras se oxidaba el gliceraldehído 3fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato, aún debe de ser oxidado otra vez a NAD+. Sin en el proceso el NAD+ no es regenerado, la oxidación del gliceraldehído 3-fosfato terminará y así, la glucólisis se parará. Son numerosos los microorganismos que solucionan dicho problema haciendo más lenta o incluso deteniendo del todo la actividad realizada por e piruvato deshidrogenasa, y usando el piruvato o alguno de sus derivados como aceptor de 17

electrones además de hidrógeno en la reoxidación del NADH. Esto suele producir más ATP, siendo un proceso tan efectivo que a menudo algunos organismos quimioorganotrofos no hacen una respiración ni siquiera en presencia de oxígeno o alguno otro aceptor de electrones de tipo exógeno. Existen numerosas clases de fermentación, que por lo general suelen ser características de grupos de organismos específicos. Cuando consideramos las fermentaciones de microorganismos deben de considerarse dos aspectos importantes que son por un lado la NADH que se oxida a NAD +, y por otra parte, se encuentra el aceptor de electrones, que es el piruvato o algún derivado de éste. En las fermentaciones, los sustratos son oxidados de forma parcial, formándose el ATPsolamente por fosforilación en el nivel del sustrato, no necesitando oxígeno. Son numerosos los hongos, bacterias, protozoos, y algas que fermentan los azúcares, transformándolos en etanol más CO2, en procesos conocidos como fermentaciones alcohólicas. Donde el piruvato se descarboxilado, pasando a formarse el acetaldehído, el cual a la misma vez se reduce a etanol gracias a la alcohol deshidrogenasa, utilizando en dicho proceso al NADH como dador de electrones. Por otro lado, la fermentación conocida como, fermentación acidoláctica, que consiste en la reducción del piruvato a lactato, es aún más habitual que la anterior. Este tipo de fermentación se da en bacterias (Bacillus), algas (como la Chlorella), mohos, algunos protozoos, y como curiosidad, se da incluso en el músculo esquelético de animales. Los fermentadores de este tipo se pueden separar en dos grupos que son, los fermentadores homolácticos, las cuales usan la vía glucolítica, reduciendo de forma directa a todo o casi todo el piruvato, pasando este a lactato, gracias a la enzima lactato deshidrogenada. Por otro lado, tenemos el grupo de los fermentadores heterolácticos, los cuales forman grandes cantidades de productos distintos del lactato, algunos fabrican lactato, CO2 y etanol, siendo el CO2, a través de la vía de la fosfocetolasa. Ambas fermentaciones, la fermentación de tipo láctica, y la fermentación de tipo alcohólica, son de gran utilidad para el hombre, pues por ejemplo, la fermentación alcohólica se realiza a partir de levaduras para dar lugar a la producción de bebidas alcohólicas; de donde el CO2 que se produce el efecto que hace que crezca el pan por ejemplo, o en el caso de la fermentación láctica, a pesar de poder estropear algunos alimentos, también puede ser usada para fabricar yogures, o algunas conservas. En general, el papel que juegan las fermentaciones en la producción de alimentos es sumamente importante.

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FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA La fermentación alcohólica es una bioreacción que permite degradar azúcares en alcohol y dióxido de carbono. La conversión se representa mediante la ecuación: C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2 Las principales responsables de esta transformación son las levaduras. La Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con más frecuencia. Por supuesto que existen estudios para producir alcohol con otros hongos y bacterias, como la Zymomonas mobilis, pero la explotación a nivel industrial es mínimo. A pesar de parecer, a nivel estequiométrico, una transformación simple, la secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos moléculas de alcohol y dos moléculas de bióxido de carbono es un proceso muy complejo, pues al mismo tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes adicionales para reproducirse. Para evaluar esta transformación, se usa el rendimiento biomasa/producto y el rendimiento producto/ substrato. - Rendimiento biomasa/substrato (Yx/s): es la cantidad de levadura producida por cantidad de substrato consumido. - Rendimiento substrato/producto (Yp/s): es la cantidad de producto sintetizado por cantidad de substrato consumido. El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difícil lograr este rendimiento, porque como se señaló anteriormente, la levadura utiliza la glucosa para la producción de otros metabolitos. El rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico, es decir, de 0.469 a 0.485 g/g. Los rendimientos en la industria varían entre 87 y 93% del rendimiento teórico (Boudarel, 1984). Otro parámetro importante es la productividad (g/h/l), la cual se define como la cantidad de etanol producido por unidad de tiempo y de volumen. Los parámetros aquí mencionados se definen con relación a la fase y al modo de funcionamiento del biorreactor o fermentador. Por lo general, un biorreactor es un recipiente cilíndrico de doble pared, de vidrio o de acero inoxidable (para el control de la temperatura y esterilización en línea), cubierto de una platina de acero inoxidable. La platina está dotada de entradas y salidas que permiten agregar substratos, nutrientes y substancias como ácidos o bases, extraer productos, o bien, hacer mediciones en línea. La platina permite acoplar un sistema de agitación para mantener la homogeneidad y facilitar, en su caso, la transferencia de oxígeno y nutrientes. El Biorreactor es el elemento central para la realización de la fermentación alcohólica. Existen diversas opciones para disponer de esta tecnología; por 19

ejemplo, construir una instalación simple (Make your own fuel, 2006), hasta la adquisición de una instalación completa con especificaciones técnicas adecuadas a las características concretas del proceso. Entre estas dos opciones existen múltiples posibilidades caracterizadas por diferentes precios, volúmenes, tecnologías, modos de funcionamiento (discontinuo, fed batch, continuo, cascada), etc. (Monte et al., 2003), (Bailey, 1986). La elección depende de los recursos económicos disponibles y del interés por desarrollar una tecnología propia. A continuación, se expone una breve descripción del proceso de fermentación alcohólica diseñado en la Plataforma de Predesarrollo en Biotecnología (PPB) en Dijon, Francia.

LEVADURAS Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras "verdaderas" pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes. A veces suelen estar unidos entre sí formando cadenas. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares. Una de las levaduras más conocidas es la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia realizando fermentación alcohólica. Por esta razón se emplea en muchos procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura química, por ejemplo en la producción de cerveza, vino, hidromiel, aguol, pan, antibióticos, etc.

Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproducción asexual, una nueva yema surge de la levadura madre cuando se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa de la madre al alcanzar un tamaño adulto. En condiciones de escasez de nutrientes las levaduras que son capaces de reproducirse sexualmente formarán ascosporas. Las levaduras que no son capaces de recorrer el ciclo sexual completo se clasifican dentro del género Candida.

La levadura es la primera célula eucariota en la que se ha intentado expresar proteínas recombinantes debido a que es de fácil uso industrial: es barata, cultivarla es sencillo y se duplica cada 90 minutos en condiciones nutritivas favorables. Además, es un organismo fácil de modificar genéticamente lo que 20

permite realizar experimentos en varios días o semanas. Sin embargo, las levaduras poseen un mecanismo de glicosilación diferente al que se encuentra en células humanas, por lo que los productos son inmunogénicos. SACCHAROMYCES CEREVISIAE La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae ) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. En su ciclo de vida alternan dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb). Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y estudios a escala genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica, localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma. La maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada tanto en levaduras como en plantas y en mamíferos. Esto se ilustra con el hecho de que rutinariamente se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de su función. Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala de análisis de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían muy complicados o costosos en organismos multicelulares.

21

SIDRA La sidra es una bebida alcohólica de baja graduación (menos de 3º en el caso del francés Cidre Doux, una sidra dulce, hasta un máximo de 8º) fabricada con el zumo fermentado de la manzana. Se trata de una bebida muy extendida por todo el mundo, así en Europa se encuentra en numerosos países: Alemania, Francia (Calvados), España (Asturias, Cantabria, Galicia y País Vasco, así como varias comarcas de Castilla y León), Italia (Piemonte), Irlanda, Escocia e Inglaterra. En América, se encuentra en zonas de distintos países, probablemente debido a la influencia de la inmigración española del siglo pasado: por ejemplo en México se produce en las ciudades de Huejotzingo y Zacatlán, en el estado de Puebla. En Argentina la sidra se localiza sobre todo en las provincias de Rio Negro, San Juan y Santa Fe. En Estados Unidos se produce principalmente en Nueva Inglaterra y el estado de Nueva York. Por su singularidad hay que diferenciar la sidra natural de la espumosa. En general, mientras en el norte de España se consume mayoritariamente la sidra natural, en el resto el mundo se acostumbra a consumir la sidra espumosa (que asemeja más al champagne o a la cerveza). El origen de la palabra sidra, viene de griego sikera. Al latín pasa como sicera y en asturiano se empezará a pronunciar sizra y luego finalmente sidra. Son muy numerosos los documentos a lo largo de la historia que nombran la sidra y los pomares (plantaciones de manzanos). Existen diferentes tipos de sidra:  Sidra dulce: zumo que sale de exprimir la manzana y que habitualmente se hace después de la recolección de la manzana en octubre.  Sidra natural: sidra tradicional que se consume escanciada y se trata de sidra dulce fermentada sin azúcares añadidos.  Sidra de nueva expresión: sidra natural con un perfil organoléptico diferente creada con vistas a la expansión a nuevos mercados.  Sidra de hielo: se obtiene de la fermentación del zumo de manzana congelada naturalmente. De este modo se consigue una mayor concentración de azúcares y se obtiene una bebida de mayor graduación. El uso del mosto de manzana debe remontarse a la antigüedad prehistórica; el de la sidra debió ser posterior ya que parece ser que en aquellas épocas las manzanas no tenían azúcar suficiente para que su mosto fuera utilizado en la producción de bebidas fermentadas. Algunos autores aseguran que la sidra ya era conocida por los hebreos, los egipcios y los griegos, aunque en realidad no se puede probar documentalmente esta circunstancia a no ser en base a lo escrito por autores latinos: Plinio (23-79 d.C.) habla de bebidas hechas con peras y manzanas, cita el vino de manzana y dice que «…es la bebida típica del territorio…»; Estrabón, unos sesenta años antes de Cristo, escribe que los astures también usan sidra, pues tienen poco vino. Palladius nos enseña que en el siglo III los romanos preparaban vino de peras e incluso da detalles de su fabricación. En 22

cuanto a la península Ibérica, la sidra era conocida desde muy antiguo, casi desde tiempo inmemorial. En la Alta Edad Media, en los siglos VIII y IX disponemos de bastantes documentos que nombran la sidra y las pomaradas.

Fuente de nutrientes y sustancias no nutritivas Agua y azúcares.

Valoración nutricional Destaca su contenido en agua y azúcares. Su contenido energético proviene del alcohol y los azúcares y es de 43 kcal/100 g de bebida. La sidra tiene que servirse fresca, nunca fría, en torno a los 10-12º de temperatura.

ºBrix El principio de medición se basa en la refracción de la luz creada por la naturaleza y la concentración de los solutos. Es por esto por lo que un refractómetro mide indirectamente la densidad de los líquidos. (A.Krüss)

Metodología medición de grados Brix 1. Para efectuar una medición se agrega al prisma una pequeña gota de zumo utilizando una pipeta o, con muestras altamente viscosas, utilizando una espátula. 2. Observando a través de ocular del dispositivo se puede leer los grados Brix. 3. Al comienzo de cada serie de mediciones, se recomienda realizar una medición de control con agua. (NMX-F, 1965).

pH El pH puede definirse como una medida que expresa el grado de acidez o basicidad de una solución en una escala que varía entre 0 y 14; este valor representa el menos logaritmo en base diez de la concentración de iones hidrógeno [H+]. Como la escala es logarítmica, la caída en una unidad de pH es equivalente a un aumento de 10 veces en la concentración de H+. (Goyenola, 2007). Metodología medición de pH 1. Calibrar el potenciómetro con las soluciones reguladoras de pH 4, pH 7 y pH 10 según la acidez del producto. 2. Tomar una porción de la muestra ya preparada, mezclarla bien por medio de un agitador y ajustar su temperatura a 20°C ± 0.5°C. 3. Sumergir él y/o los electrodos en la muestra de manera que los cubra perfectamente. Hacer la medición del pH. Sacar el y/o los electrodos y lavarlo (s) con agua. 4. El valor del pH de la muestra se lee directamente en la escala del potenciómetro. (Normas, NMX-F-317-S-1978. DETERMINACIÓN DE pH EN ALIMENTOS, 1978). 23

Cámara de Neubauer Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de grosor; En una cámara simple, la porción central, que es donde se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. En la parte central se encuentra grabada una retícula cuadrangular. En el caso de cámara dobles, que son las más comunes, existen 2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cámara. El cuadrado central es el destinado al recuento de hematíes y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeños. El cuadrado central está por tanto formado por 400 cuadrados pequeños. (Martínez, 2012) Metodología cámara de Neubauer 1. Preparación de la muestra. Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habrá de prepararse una muestra con una concentración apta para su recuento; la concentración óptima para el conteo es de 1 millón de células por ml = 106 células/mL 2. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer Se toman 10 µL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta. Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubauer, dejando que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad. 3. Preparación y enfoque del microscopio. Colocar la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio; buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo vamos a contar 5 cuadros grandes de una cámara de Neubauer Improved de 0,1mm de profundidad. 4. Cálculo de la concentración Aplicamos la fórmula del cálculo de concentración celular. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑐𝑒𝑙 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 𝑚𝐿 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑛 𝑚𝐿

24

En el caso de que hayamos aplicado una dilución, deberemos trasformar la concentración obtenida durante el recuento celular en la concentración de la muestra original; es decir tendremos que dividir el resultado por la dilución aplicada. (Bastidas)

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑐𝑒𝑙 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑥 10.000 = 𝑚𝐿 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 𝑥 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

Tipos de conteo

Ilustración 3 Conteo 5 Cuadros

Ilustración 4 Conteo de un cuadro grande

Ilustración 2 Conteo Zig-Zag muestra saturada

Anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer cuadro; Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando el resultado de cada uno de ellos. Cuantos más cuadros contemos, más precisión obtendremos en nuestra medida. (Bastidas).

Curva de McFarland En Microbiología, los estándares de McFarland son usados como una referencia para ajustar la turbidez de suspensiones bacterianas hasta que el número de bacterias llegue al rango establecido, específicamente para identificación y pruebas de susceptibilidad. Estos estándares son comparados visualmente con una suspensión de bacterias en solución salina o caldo nutritivo. Si la suspensión bacteriana es más turbia, se puede diluir con más diluyente (solución salina o caldo nutritivo). Si la suspensión no tiene la suficiente turbidez, puede adicionarse más cantidad de colonias. El patrón de McFarland más utilizado es al 0.5% y corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de 1.5 x 108 células bacterianas por ml. (MDM)

25

Ilustración 5 Turbidez estándar de MCFarland

Metodología curva de McFarland 1. Prepare una turbidez estándar 0,5 de la escala de McFarland; añadiendo 0.5mL de cloruro de bario al 1.175% en 99.5mL de ácido sulfúrico al 1%. 2. Prepare una suspensión de un microorganismo de prueba, para enfrentar la densidad de la turbidez de McFarland. 3. Haga diluciones seriadas, diluya 10 veces la suspensión anterior. 4. Llenar una cubeta con estándar 0.5 y someterla a espectrofotometría 5. Llenar una cubeta con cada una de las diluciones realizadas de la suspensión y rectificar la turbidez con ayuda de un espectrofotómetro. 6. Realizar cálculos pertinentes (Antoquia, 2009).

NMX-V-011-1992. BEBIDAS ALCOHÓLICAS. SIDRA GASIFICADA. ESPECIFICACIONES. Esta Norma define a la sidra como bebida alcohólica que resulta de la fermentación, principalmente etílica de los azúcares propios del mosto de manzana. (Normas, NMX-V-011-1992. BEBIDAS ALCOHÓLICAS. SIDRA GASIFICADA., 1992) Clasificándola por su contenido de azúcar.  TIPO I Seca La que contiene menos de 10g/l de azúcares reductores totales.  TIPO II Semidulce La que contiene no menos de 10g/l ni más de 40g/l de azúcares reductores totales.  TIPO III Dulce La que contiene no menos de 40.1g/l ni más de 90g/l de azúcares reductores totales. Por su Color

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 TIPO IV Ámbar La sidra que resulta de la fermentación de los mostos a que se refiere el Tipo II o mezcla de ellos.  TIPO V ROSADA La sidra que resulta de la fermentación de los mostos a que se refiere el Tipo II o mezcla de ellos, adicionada de: mosto de uva (concentrado o no), no más del 15% de vino tinto, o enocianina, hasta obtener una transmitancia no menor de 20% a la longitud de onda de 520nm o su equivalente en absorbancia de 0.7%.

NORMA Oficial Mexicana NOM-199-SCFI-2017, Bebidas alcohólicas-Denominación, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y métodos de prueba. Sidra Natural Es la bebida alcohólica que resulta de la fermentación de mostos preparados a partir del jugo o concentrado de manzanas, peras, o mezclas de estos sin la adición de otros azúcares y prohibiéndose la adición de alcohol, pudiendo ser gasificada con CO2. Su contenido alcohólico es de 3% a 6% Alc. Vol. (SEGOB, 2017) La sidra natural por su color se categoriza en: i.

Ámbar

La sidra cuyo color resulta de la fermentación de mostos, pudiendo ser adicionada de color caramelo. ii. Rosada La sidra cuyo color resulta de la fermentación de mostos, adicionada de: mosto de uva (concentrado o no) o no más del 15% de vino tinto o antocianina. La sidra natural se clasifica por su contenido de azúcares de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla 1 Clasificación de la sidra por el contenido de azúcares CLASE

CONTENIDO DE AZÚCARES o AZÚCARES REDUCTORES TOTALES (g/l)

Seca

Hasta 10

Semi-dulce

10,1 a 40

Dulce

40,1 a 90

Tabla 2 Especificaciones de la sidra natural ESPECIFICACIONES

LÍMITES Mínimo

Máximo

Contenido de alcohol a (20°C) (% Alc. Vol.)

3

6

Extracto Seco (g/L)

12

_

Cenizas (g/l)

1

_

27

Azúcares o Azúcares Reductores Totales (g/l)

_

90

Metanol (mg/100ml de alcohol anhidro)

-

300

Acidez Total (como ácido málico en g/l)

3,5

7,5

Acidez Volátil (como ácido acético en g/l)

_

1,2

Densidad Relativa a 20°C

1,01

1,045

Bióxido de Azufre Libre (mg/l)

_

100

Bióxido de Azufre Total (mg/l)

_

300

Presión de CO2 a 293 K (20°C) (kPa)

_

294

Volúmenes de CO2 disueltos (Vol. de CO2/vol. Del líquido)

_

5

13CVPDB

-29

-26

Sidra y Sidra gasificada Bebida alcohólica que resulta de la fermentación de mostos preparados a partir del jugo o concentrados de manzanas, peras o mezclas de estos, con un contenido no menor del 50% de sus azúcares y adicionado de un máximo de 85 gramos por litro de otros azúcares y aditivos permitidos en el Acuerdo correspondiente de la Secretaría de Salud (Ver 2.32) prohibiéndose la adición de alcohol. Su contenido alcohólico es de 3% a 6% Alc. Vol., en el caso de la Sidra-Gasificada se adiciona CO2. La sidra y sidra gasificada por su color se categorizan en: I.

Ámbar

La sidra cuyo color resulta de la fermentación de mostos, pudiendo ser adicionada de color caramelo. II.

Rosada

La sidra cuyo color resulta de la fermentación de mostos, adicionada de: mosto de uva (concentrado o no) o no más del 15% de vino tinto o antocianina. La sidra y sidra gasificada se clasifica por su contenido de azúcares de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla 3 Clasificación de la sidra y sidra gasificada por el contenido de azúcares CLASE

CONTENIDO DE AZÚCARES o AZÚCARES REDUCTORES TOTALES (g/L)

Seca

Hasta 10

Semi-dulce

10,1 a 40

Dulce

40,1 a 90

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Tabla 4 Especificaciones de la sidra y sidra gasificada ESPECIFICACIONES

LÍMITES Mínimo

Máximo

Contenido de alcohol a (20°C) (% Alc. Vol.)

3

6

Extracto Seco (g/l)

12

_

Cenizas (g/l)

1

_

Azúcares o Azúcares Reductores Totales (g/l)

_

90

Metanol (mg/100ml de alcohol anhidro)

-

300

Acidez Total (como ácido málico en g/l)

3,5

7,5

Acidez Volátil (como ácido acético en g/l)

_

1,2

Densidad Relativa a 20°C

1,01

1,045

Bióxido de Azufre Libre (mg/l)

_

100

Bióxido de Azufre Total (mg/l)

_

300

Presión de CO2 a 293 K (20°C) (kPa)

_

294

Volúmenes de CO2 disueltos (Vol. de CO2/vol. del líquido)

_

5

13CVPDB

-29

-19

SIMULACIÓN EN SUPERPRO DESIGNER SuperPro Designer es un programa computacional para realizar simulación de procesos en estado estacionario. El problema matemático que surge como consecuencia de una simulación corresponde a la solución de un conjunto de ecuaciones algebraicas no lineales del tipo:

f(x) = 0 donde: x: vector real de dimensión n. f: conjunto de funciones reales de dimensión m, con m ≤ n. La función f representa el modelo matemático del proceso. La simulación permite predecir la operación de un proceso cuando se han alcanzado condiciones de estacionalidad, esto facilita el estudio de la sensibilidad del sistema frente a cambios en los distintos parámetros y variables de operación. De esta manera éstos pueden ser ajustados usando técnicas de optimización para determinar las mejores condiciones operacionales. SuperPro Designer es una herramienta computacional amigable, especialmente formulada para funcionar en ambiente Windows. SuperPro Designer, cuenta con modelos matemáticos para las siguientes 17 operaciones unitarias: 29

                

Reacción estequiométrica. Reacción cinética. Reacción ambiental. Rompimiento celular. Sedimentación. Secado. Cambio de fase. Absorción/Adsorción. Almacenamiento. Cromatografía. Filtración. Centrifugación. Destilación. Extracción. Intercambio de calor. Cambio de presión. Mezcla y separación de corrientes.

Cada operación unitaria cuenta con una serie de equipos, los más representativos de dicha operación, los cuales se encuentran representados por un ícono especial y único, los equipos disponibles son los siguiente: 1. Reacción estequiométrica.     

Well Mixed Reactor Fermentor Seed Fermentor Air Lift Fermentor Plug Flow Reactor

2. Reacción cinética.      

Continuously Stirred Reactor Batch Reactor. Plug Flow Reactor Equilibrium Reactor Batch Fermentor Continuous Fermentor

3. Rompimiento celular.  Homogenizer  Bead Mill 4. Sedimentación.

30

    

Decanter Clarifier Thickener Flotation Tank Oil Separator

5. Secado       

Spray Dryer Fluid Bed Dryer Freeze Dryer Tray Dryer Drum Dryer Rotary Dryer Sludge Dryer

6. Cambio de fase.  Condenser  Crystallizer  Evaporator 7. Absorción/Adsorción.  Absorber  Stripper  Adsorber 8. Almacenamiento.       

Blending Tank Horizontal Tank Vertical on Legs Tank Flat Bottom Tank Receiver Tank Equalizer Junction Box

9. Cromatografía.     

Gel Filtration Ion Exchanger Multi-Step Ion Exchanger Affinity Column Multi-Step Affinity Column

10. Filtración.  Microfilter 31

           

Ultrafilter Diafilter Reverse Osmosis Filter Rotary Vacuum Filter Plate & Frame Filter Nutsche Filter/Dryer Dead End Filter Air Filter Belt Filter Granular Media Filter Baghouse Filter Electrostatic Precipitator

11. Centrifugación.       

Disk Stack Centrifuge Decanter Centrifuge Bowl Centrifuge Basket Filter Centrifuge Centritech Centrifuge Hidrocyclone Cyclone

12. Destilación.  Short Cut Distillation  Batch Distillation  Flash Drum 13. Extracción.  Centrifugal Extractor  Mixer Settler Extractor  Differential Extractor 14. Intercambio de calor.  Heater  Cooler  Heat Sterilizer 15. Cambio de presión.  Pump  Compressor  Fan 16. Reacción ambiental. 32

       

Neutralizer Wet Air Oxidation Reactor Incinerator Aeration Basin Plug Flow Aeration Basin Anaerobic Digester Trickling Filter Anoxic Reactor

17. Mezcla y división de corrientes.     

n-Stream Mixer n-Stream Flow Splitter n-Stream Component Splitter Custom Mixer Custom Splitter

Además de las operaciones mencionadas, el programa cuenta con una biblioteca (base de propiedades) de aproximadamente 370 componentes, la que puede ser complementada mediante el ingreso, por parte del usuario, de nuevas especies químicas y sus respectivas propiedades. Gracias a lo anterior, es posible el cálculo de los balances de masa y energía, y con ello el dimensionamiento de los equipos. Además, posee bases de datos con materiales de construcción y agentes de transferencia de calor. Los resultados son entregados en forma de reportes, los que pueden imprimirse directamente o ser exportados a Microsoft Excel. A su vez, los diagramas de flujos pueden imprimirse directamente o ser exportados a AutoCad, donde es posible mejorarlos, incorporando alguna gráfica no existente en el programa. El programa también cuenta con una biblioteca de ejemplos, los que permiten una rápida familiarización con el sistema. El programa también permite realizar evaluación de costos, evaluación de impacto ambiental y calcular propiedades termodinámicas. Las características anteriores hacen que este software sea muy utilizado en el mundo por universidades y compañías principalmente de la industria de procesos bioquímicos, farmacéuticos, químicos, alimentos, tratamiento y purificación de agua, entre otras.

Para fines de este proyecto el simulador se utilizó principalmente para representar el proceso realizado a nivel laboratorio, así como la obtención de nuestro producto terminado. 33

SuperoPro Designer es una herramienta que nos permitiría una amplia previsión de resultados lo cual nos evitaría generar gastos económicos y de material, así como tiempo empleado cuando las condiciones de trabajo no son del todo precisas. Debido a que en nuestro proceso de fermentación hubo mezclas con procesos artesanales es difícil calcular rendimientos reales ya que SuperPro Designer no cuenta en su base datos con las características físicas y químicas de las materias utilizadas para inoculación como son el Azúcar, la canela o la miel. La materia del jugo de manzana puede ser representada como una biomasa y asignarle sus propiedades de manera externa mientras que en el caso de la levadura (Yeast) si cuenta con registros en sus bases de datos.

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MATERIALES Y EQUIPOS                  

Canela. Azúcar Levadura fresca. Miel. Jugo pasteurizado. Pipetas Matraces Erlenmeyer de 250 ml. Vidrio de reloj. Espátula. Olla de presión. Guantes, cubre-boca y cofia. Papel aluminio. Papel de traza. Alcohol. Gasas. Algodón. Pizeta. Agua destilada.

EQUIPO.      

Autoclave. Refractómetro. Microscopio. Cámara de Neubauer. Espectrofotómetro. P H-metro.

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PROCEDIMIENTO 1. Programación y diseño para el control del equipo del biorreactor. 2. Esterilización del equipo y material para equipamiento del biorreactor. 3. Calibración de los equipos potenciómetro, balanza analítica, refractómetro y espectrofotómetro. Balanza analítica OHAUS PIONEER      

Conectar a voltaje de 110 V. Computadora y aire acondicionado. Encender la balanza con la tecla de encendido. Sacudir restos de polvo o material que haya quedado en la balanza. Presionar la tecla tarar. Colocar las muestras y pesar.

Refractómetro LAXCO   

 

Asegúrese que el refractómetro este totalmente limpio. Se coloca agua destila sobre el prisma; suficiente para cubrir el prisma completamente. Cierre el cubre objetos y gire el tornillo de ajuste de manera que el limite claro / oscuro, se alinea con la línea de cero. Se limpia el agua destilada con un pañuelo para lentes o paño suave. Coloque una gota de la muestra y lea.

Potenciómetro ( PH-metro).   



Conectar a la corriente el Potenciometro Vernier. Retire la botella de almacenamiento del electrodo destornillando la tapa y retirando la botella y la tapa. Enjuague bien la sección inferior de la sonda, especialmente alrededor de la punta en forma de bulbo, utilizando agua destilada o desionizada. Conecte el sensor y enciéndalo. 36



 



Colocar el electrodo dentro de una disolución buffer de pH=10 o pH=4 (es indistinto), No volver a oprimir “CAL”, oprimir el botón de “HOLD” hasta que aparezca el valor de pH del buffer empleado. Posteriormente repetimos el mismo paso con la otra disolución buffer. Cuando haya terminado de realizar las mediciones, enjuague el electrodo con agua destilada. Deslice la tapa en el cuerpo del electrodo y luego atornille la tapa en la botella de almacenamiento de modo que la punta del electrodo se sumerja en la solución de almacenamiento.

Espectrofotómetro.   

Se conecta y se deja 20 minutos para calibrar automáticamente. 2.- Se coloca una cubeta con la muestra blanco para el término de la calibración. 3.- Se coloca la muestra analizar a 625 nm.

4. Toma de muestra del jugo de manzana para analizar el p H y °Brix. 5. Pesado en una balanza analítica de los ingredientes: pesando 175gr de azúcar, 52.5gr de canela, 350 ml miel y 17.5gr de levadura para 7Lt de jugo de manzana ya pasteurizado. 6. Preparación del inoculo añadiendo primeramente el azúcar, después la levadura y por lo último la canela y miel. 7. Estando los 4 ingredientes junto, dejar la agitación a una revolución por segundo hasta que todo este homogéneo, a una temperatura de 28°c por 3 días. 8. Toma de muestra cada 3 h, tomando en cuenta los siguientes factores: p H, °brix, Acidez, células por la cámara de Niubauer, células por Mcfarlad y temperatura. 9. Después de 72 horas, se filtra, se embotella cuidando la inocuidad. 10. Clarificación de la sidra.

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7

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RESULTADOS Horario Fecha

13:00 07:00 10:00 13:00 15:00 07:00 10:00 13:00

pH

T °C ° Brix

Viabilidad N° Cel. (%) Mcfarland (UFC) 99 1.52 𝑥109 96 1.125 𝑥109 96.03 1.301𝑥109 96 7.6 𝑥108 90.6 9.59𝑥 109 70.83 9.97 𝑥1010 89 7.91 𝑥 1010 88 1.0858 𝑥1011

04|12|18 3.76 26 16.1 05|12|18 3.65 28 13 05|12|18 3.20 29 13* 05|12|18 3.75 28 13* 05|12|18 3.60 25.4 13.8 06|12|18 3.61 25.5 13 06|12|18 3.62 28 14 06|12|18 3.6 28 14 *Adición de Sustrato (azúcar). *Disminución en N°Cel. Mcfarland. *Aumento en N° Cel. Neubauer.

N° Cel. Neubauer (Cel/ mL) 108, 000 16, 000, 000 15, 400, 000* 17, 120, 000* 44, 400, 000 42, 800, 000 40,800,000 40,200,000

CÁLCULOS N° Células Mc Farland

04|12|2018 13:00 h Disolución: Absorbancia = 0.8938 UFC = 1, 520, 000, 000 = 1.52𝑥109

0.8938 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

05|12|2018 07:00 h Disolución: Absorbancia = 0.698 UFC = 1, 125, 000, 000 = 1.125𝑥109

0.698 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

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10:00 h Disolución: Absorbancia = 0.786 UFC = 1, 301, 000, 000 = 1.301𝑥109

0.786 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

13:00 h Disolución Absorbancia = 0.520 UFC = 769, 000, 000 = 7.69𝑥108

0.520 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10 15:00 h Disolución: 0.1 Absorbancia = 0.615

UFC = 959, 000, 000 = 9.59𝑥108

0.615 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

06|12|2018 07:00 h Disolución: 0.01 Absorbancia = 0.634 UFC = 997, 000, 000 = 9.97𝑥108 UFC = 997, 000, 000x 100 = 9.97x1010

0.634 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

10:00 h Disolución: 0.01 Absorbancia = 0.531 UFC = 791,000,000 = 7.91𝑥108 UFC = 791, 000, 000x 100 = 7.91x1010

0.531 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

13:00 h

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Disolución: 0.01 Absorbancia = 0.6789 UFC = 1,085,800, 000 = 1.0858𝑥109 UFC = 1,085,800,000x 100 = 9.97x1010

0.6789 − 0.1355 UFC = 5𝑥10−10

N° Células Neubauer

04|12|2018 13:00 h Directa N° de células= 54 54 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 108, 000

05|12|2018 07:00 h Dilución 10-1 N° de células= 840 840 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ = 𝑚𝐿 5 (10−1 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 16000000

10:00 h Dilución 10-2 N° de células= 77 77 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5(10−2 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 15400000

13:00 h Dilución 10-1 N° de células= 856 856 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5(10−1 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 17120000

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15:00 h Dilución 10-1 N° de células= 222 222 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ = 𝑚𝐿 5(10−2 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 44400000

06|12|2018 07:00 h Dilución 10-2 N° de células= 214 214 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5(10−2 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 42800000

10:00 h Dilución 10-2 N° de células= 204 204 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5(10−2 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 40800 000

13:00 h Dilución 10-2 N° de células= 201 201 𝑥 10000 𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 5(10−2 )

𝑐𝑒𝑙⁄ 𝑚𝐿 = 40200000

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CURVA DE MC FARLAND

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ANALISIS DE RESULTADOS Para determinar el grado de cumplimiento de los objetivos propuestos en este proyecto, se han analizado los resultados. Al realizarse las distintas pruebas tales como la absorbancia, n° de células en la cámara de Neubauer medición de temperatura, pH y brix se pudo determinar en un tiempo de 3 días. Se observó que los grados brix iniciales fueron de 16°Brix y bajó durante 2 días a 13°, lo que significa que las células estaban consumiendo el azúcar que se añadió inicialmente, lo cual nos lleva a una producción de alcohol. Así mismo el pH se mantuvo en el rango de 3 a 4 que es el indicado para la elaboración de sidra de manzana. El número de células por la cámara de Neubauer nos indicó que hubo una diferencia de 53, 492,000 cel. Encontradas desde el día de inicio hasta el día final, lo cual fue favorecedor debido a que se determinó el crecimiento de células en el medio. La viabilidad se mantuvo en un rango de 90 al 88% ya que los parámetros del medio como son temperatura, pH y brix fueron favorecedores lo que ayudó a aumentar la producción de células evitando que en su mayoría murieran. Estos datos indican que todos estos parámetros se mantuvieron en su mayoría constantes los cuales hicieron que nuestro producto final estuviera en las mejores condiciones.

CONCLUSIÓN En procesos de producción es habitual implementar equipos tecnológicos como los son los biorreactores, en los que se pueden desarrollar diversos métodos biológicos que son aplicados actualmente en la industria principalmente en el área de alimentos, aunque existen aplicaciones para otras áreas como la farmacéutica, ingeniería en tejidos, entre otras. Estos procesos son multidisciplinarios pues en el diseño, ensamblado y automatización de estos, requieren el conocimiento, técnica y experiencia de diversas áreas, como en este caso que fue solicitado el apoyo de la carrera de ingeniería en sistemas computacionales para llevar a cabo la sistematización y optimalización, así como para el proceso biológico que fue implementado, puesto que es necesario la adecuada intervención del área de ingeniería bioquímica, biotecnología, procesos químicos, etc. Cabe mencionar que un biorreactor puede referirse a cualquier contenedor en el que se vea involucrado un proceso biológicamente activo o bioquímico, sin necesidad de que sea un equipo de diseño sofisticado. Pero actualmente debido al crecimiento poblacional y la demanda en productos de consumo habitual se ha 44

optado por generar procesos mediante la implementación de equipos que aceleren dichos procesos y que además cuente con innovaciones que permita al operador estimar parámetros que se ven involucrados en cualquiera de los usos para lo que fuese empleado. Como ya se mencionó el biorreactor puede ser empleado para diversos procesos, en este caso en específico, se cumplió con el objetivo principal puesto que fue posible restablecer el equipo con el que ya se contaba, adaptándole mejoras, como los sensores de temperatura y pH, sistematización, control del proceso mediante la implementación de un software específico que fuese capaz de controlar la agitación del biorreactor tipo Batch y con ello llevar a cabo un óptimo proceso de fermentación para la obtención de sidra de manzana. El diseño o mejoramiento de un biorreactor puede resultar una labor bastante compleja, ya que de acuerdo al proceso que va ser implementado debe analizarse las posibles interferencias o problemática que pudiesen surgir, pues como sabemos en él se ven involucrados microorganismos o células capaces de llevar a cabo su función deseada con optima eficiencia siempre y cuando se cuente con las condiciones óptimas de proceso. Las principales condiciones ambientales que deben considerarse para el manejo de un proceso en un biorreactor son: Parámetros de pH, temperatura condiciones de esterilidad, velocidad de agitación, flujo de gases etc., las cuales deben ser cuidadosamente controladas y monitoreadas para que el proceso de fermentación pueda ser el adecuado.

En todas las formas de fermentación el propósito principal es asegurar que todas las partes del sistema se someten a las mismas condiciones. Dentro del biorreactor los microorganismos se encuentran suspendidos en un medio especifico que contiene los sustratos necesarios para el crecimiento del microorganismo y la formación del producto requerido. Todos los componentes, incluyendo el oxígeno, deben ser proporcionados para que se difundan dentro de cada célula y los productos de desecho tales como el calor, CO2 y metabolitos de desecho deben ser eliminados. Retomando el proceso para la obtención de sidra de manzana, fue indispensable primeramente basarse de un método artesanal que permitiera llevar a cabo un proceso de escalamiento inicial, para estimar las posibles alteraciones, y determinar la concentración especifica que tendría el inoculo. Ya que la afinidad que presenta el microorganismo empleado Saccharomyces cerevisiae puede variar de acuerdo al medio en el que se desarrolla y las condiciones a las que se lleva a cabo el proceso. Gracias al primer método empleado en escala de matraz fue posible que una vez adecuado el biorreactor tipo Batch que se emplearía, se realizara el inoculo adecuado en el equipo y se modificaran o solucionaran alteraciones que fueron 45

identificadas con la primera técnica y durante todo el proceso que duro 4 días se controlaran parámetros específicos que pudieran modificar el producto, como los grados brix, pH y la temperatura. En comparación con procesos artesanales el producto fue logrado rápidamente, pues desde la inoculación del microorganismo con el jugo empezó la fermentación en la que pasado solo unas horas las variaciones de parámetro cuantificables empezaron hacer modificados esto debido a la afinidad que se tuvo por el sustrato, donde primero se presentó la fermentación alcohólica, en la que los azúcares se convierten en alcohol principalmente. Una vez terminada esta o al final de esta fermentación comienza la transformación maloláctica, en donde se transforma el ácido málico en ácido láctico. De acuerdo a las técnicas empleadas y con base a los datos obtenidos diariamente con los métodos establecidos como la determinación de grados Brix, Viabilidad, pH, Temperatura, Determinación de células de Mc Farland, Recuento de células por el método de Neubauer, estimados diariamente en intervalos de tiempo desde que inició el proceso, se pudo estimar que el proceso se aceleraba progresivamente y determinar el momento en el que este debía ser culminado y pasar el producto al embotellado, cerciorándose que el sabor fuera agradable, apariencia adecuada y que claramente estuviera presente un porcentaje de alcohol propio del producto obtenido gracias a esta fermentación. Con todo lo presentado y con base al conocimiento adquirido en la asignatura de ingeniería en biorreactores concluimos que el diseño de un biorreactor de cualquier tipo, en la actualidad es de suma importancia para muchos entes industriales en las que se desarrollan procesos productivos, y que un ingeniero bioquímico debe estar inmerso en las actualizaciones que se van presentando en esta área, así como conocer el funcionamiento, composición, manejo, materiales óptimos con los que pueda construirse y que no perjudique a la materia prima que va ser empleada en el proceso, entre muchas cosas más, para que el momento que se presente un problema de este tipo, el ingeniero bioquímico pueda solucionarlo o sea proactivo y anticipe algún tipo de interferencia que pueda presentarse, evitando el daño del proceso, que para la industria se refleja como pérdida económica, sea capaz de llevar a cabo un proceso adecuado para la obtención de un producto final, empleando este tipo de equipos, en el que comprenda la cinética química y biológica que se está llevando a cabo y que logre de manera óptima lo anticipado previamente como fue en este caso con la obtención de sidra de manzana mediante un proceso de fermentación empleando un biorreactor tipo batch.

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 SEGOB. (2017). NOM-199-SCFI-2017, Bebidas alcohólicas-Denominación, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y métodos de prueba. México D.F.

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ANEXOS MACFARLAND Trabajo de titulación, modalidad Proyecto de Investigación, previa a la obtención de título de Ingeniera Bioquímica, otorgado por la Universidad Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos . MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 Evaluación de la influencia del reactivo en exceso en la preparación de la escala McFarland. El principio de la escala McFarland es reaccionar iones sulfato con iones bario para dar como producto un precipitado de Sulfato de Bario; estequeométricamente se determinó que el reactivo en exceso es el portador del ion sulfato. Para la preparación de la escala McFarland se utilizó Ácido Sulfúrico (H2SO4) y Sulfato de Sodio (Na2SO4) como reactivos portadores del ion Sulfato. Para determinar la influencia del reactivo en exceso se preparó una escala con solución de ácido sulfúrico (0,18M) y otra con solución de sulfato de sodio (0,18 M), adicionando cantidades que provocan un exceso de iones sulfatos de acuerdo a la forma tradicional. Además, partiendo de la concentración de iones Bario que es el reactivo limitante se preparó varias soluciones que contienen las concentraciones adecuadas de iones sulfatos para evitar el exceso del mismo en cada punto de la escala (Tabla 1). Se mantuvo el uso de Cloruro de Bario (0,048M) como reactivo portador del ion Bario y se procedió a preparar las escalas en una relación de volúmenes detallada en la Tabla 1 por triplicado. Finalmente, se compararon las escalas preparadas utilizando un espectrofotómetro Hach Modelo DR 5000 UV-Vis a 600 nm (Alemania). Tabla 1. Concentraciones de Ácido Sulfúrico y Sulfato de Sodio para cada punto de la escala. 3.2 Preparación de la Escala McFarland utilizando Ácido Sulfúrico y Sulfato de Sodio. A partir de las varias soluciones de ácido sulfúrico y sulfato de sodio, realizadas en el apartado 3.1.1 se prepararon escalas por triplicado; los volúmenes que se mezclaron para cada estándar se observa en la Tabla 2. Luego se midió la turbidez de las escalas en el espectrofotómetro Hach Modelo DR 5000 UV-Vis a 600 nm y se compararon las diferencias entre reactivos. Escala Propuesta Para optimizar el tiempo y facilitar el uso de la escala se preparó una Escala de Turbiedad con 4 puntos con un punto inicial de 10 x 108 UFC/ml y 48

un punto máximo de 40 x 108 UFC/ml, éste se calculó a partir de la concentración del producto Sulfato de Bario. En la tabla 3 se observan los volúmenes necesarios para cada punto y las concentraciones de los mismo; se realizaron 3 réplicas. Los estándares de la escala fueron medidos en el espectrofotómetro a 600 nm y en el turbidímetro Lovibond TB310 IR a 860 nm (Alemania). 3.5 Activación de Escherichia coli Se utilizó la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922 de los microorganismos disponibles en la Unidad Operativa de Investigación y desarrollo (UODIDE-ICIA). El medio de cultivo empleado fue caldo BHI (Brain Heart Infusion) (Becton Dickinson and Company, Francia), se colocaron 5 ml de caldo en tubos de ensayo; éste fue preparado 1 día antes utilizando un autoclave a 121 oC por 15 minutos. Los hisopos comerciales que contenían el microorganismo liofilizado fueron sumergidos en los tubos que contenían caldo y posteriormente se los incubó a 37 oC por 24 horas. Para comprobar la viabilidad y pureza de la cepa patógena se realizó una estría simple y se la incubó a las condiciones mencionadas anteriormente; una vez que se comprobó la pureza del microorganismo se procedió a criopreservar. Se tomó 1 ml de microorganismo de los tubos y se lo colocó en un criovial; después se colocaron 300μl de glicerol y se vorterizó hasta homogenizar. Los crioviales fueron almacenados a -20 C 3.6 Activación de Escherichia coli a partir de viales. La activación de la cepa patógena se basó en el método de Sánchez and Corrales (2005) modificado. Se retiró el vial congelado y se verificó que estuviese bien cerrado. Se esperó hasta la completa descongelación del vial; en 5 ml de caldo BHI se inoculó una asada del microorganismo descongelado, se vorterizó hasta homogenizar y se lo incubó a 37 oC por 24 horas. Al siguiente día los tubos se almacenaron a 4 oC en refrigeración para su uso posterior, el tiempo máximo de almacenamiento en refrigeración es de 3 meses para no perder la viabilidad de la cepa. 3.7 Determinación del número de exponente de crecimiento bacteriano de Escherichia coli. Se activó el microorganismo almacenado en refrigeración, se inoculó 15 μl de la muestra en 30 ml de caldo BHI, la relación es de 5 μl por cada 10 ml de medio, se vorterizó y se incubó a 37 oC por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se midió la absorbancia a 600 nm y turbidez a 860 nm, utilizando caldo BHI como blanco. A partir de la absorbancia obtenida se calculó la concentración inicial de E. coli mediante la ecuación de la curva McFarland. Después se realizaron diluciones seriadas hasta 108 y utilizando el método de recuento en placa se sembró 100 μl de las diluciones 106 , 107 y 108 en cajas Petri que contenían BHI Agar para determinar el exponente de la concentración de Escherichia coli.

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GRADOS BRIX METODOLOGÍA OBTENIDA DEL ARTICULO CIENTIFICO: RELACIÓN ENTRE LOS AZÚCARES REDUCTORES TOTALES (ART), GRADOS BRIX Y EL 50

CONTENIDO DE SACAROSA EN MEZCLAS DE ALIMENTACIÓN A DESTILERÍAS EN LA PRODUCCIÓN DUAL AZÚCAR –BIOETANOL EN COLOMBIA Se tomaron distintos períodos de tiempo en que se alimentaron diferentes mezclas de materias primas a la destilería de un Ingenio del sector, para determinar una posible relación entre los ART con los grados Brix y el porcentaje de Sacarosa de la mezcla alimentada. Para cada período de tiempo y mezcla de materias primas tomadas se encontró una relación de los ART como función de los grados Brix y el contenido de sacarosa utilizando el método de mínimos cuadrados. Se evaluaron las relaciones entre si para determinar las que menos variabilidad presentaban con los valores de ART medidos por el Ingenio. Las variables medidas fueron ART (%w/w), grado Brix (%w/w) y contenido de sacarosa (%w/w), de acuerdo a la metodología reportada en el manual “Métodos Analíticos para los Procesos de Fermentación y Destilación a partir de materias primas provenientes de la caña”1 , elaborado por PRAJ Industries. La información reportada se tomó como el promedio diario, para el caso del grado Brix, ART y % Sacarosa, y el acumulado diario para el caso de las toneladas de alimento. Adicionalmente, se tomó un histórico y se encontró una correlación para este período y se comparó con las dos relaciones que mejor tendencia presentaban, para ser utilizadas en tiempos y mezclas diferentes en el año y contrastarlas con los valores medidos por el Ingenio. Las mezclas de las corrientes de entrada a las destilerías analizadas son: 1. Miel B 2. Meladura (MD) y Miel B (MB), Relación MD/ MB = 0.23 3. Meladura (MD) y Miel B (MB), Relación MD/ MB = 0.9 4. Meladura (MD) y Miel B (MB), Relación MD/ MB = 1.05 5. Jugo Claro (JC) y Miel B 6. Jugo Claro, Meladura y Miel B.

RESULTADOS La correlación para los ART calculados (ART Calc) se obtuvo utilizando el método de mínimos cuadrados. La expresión es de la forma: ART Calc = a1*(Brix) + a2*(Sac Aparente) + b (1) En la Tabla 1 se muestran los distintos valores de los coeficientes calculados según el tipo de alimento empleado. De las figuras 2 a la 7 se graficaron la variación de los ART y ART Calculados con el Brix y el % Sacarosa con distinta alimentación.

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MÉTODO CÁMARA DE NEUBAUER OBTENIDA DEL ARTICULO CIENTIFICO: Comparación de la observación de leucocitos en el sedimento urinario con el recuento en cámara de Neubauer* Comparison between the observation of white blood cells from centrifuged urine smear and the Neubauer chamber.

Materiales y Métodos: 52

PACIENTES Se incluyeron todos los pacientes menores de 18 años cuyas muestras de orina fueron procesadas en este servicio de Microbiología en forma consecutiva por un período de dos meses. Se excluyeron aquéllos cuyos urocultivos se enviaron para control intratratamiento, aquéllos que presentaban sonda permanente, ureterostomía, vesicostomía o nefrostomía y aquéllos cuyos datos eran insuficientes o que no pudieron estudiarse por ambos métodos. DISEÑO Se comparó el método de observación del sedimento entre porta y cubreobjetos con el recuento en cámara de Neubauer, tomándose a este último como método de referencia. Estos métodos fueron efectuados en forma ciega por distintos operadores. Luego se determinó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo de la observación del sedimento urinario y del recuento en cámara de Neubauer tomando como referencia el desarrollo significativo en los urocultivos. Por razones operativas, este estudio comparativo no pudo realizarse en forma ciega respecto del cultivo. OBSERVACIÓN DEL SEDIMENTO URINARIO Se centrifugaron no menos de 5 mL y no más de 10 mL de cada muestra de orina en tubos de vidrio de 15 mL de capacidad y fondo cónico durante 10 minutos a 2.000 rpm. Se resuspendió el sedimento en aproximadamente 0,5 mL del sobrenadante y se montó una gota entre un porta y un cubreobjetos. La observación microscópica se realizó con un aumento de 400X. Se consideró ≥5 leucocitos por campo como punto de corte para leucocituria significativa a los efectos de establecer la comparación con el recuento en cámara y con el urocultivo (método de referencia). Este punto fue elegido en base a los datos observados en la literatura y a la experiencia previa de los autores OBSERVACIÓN DE LEUCOCITOS EN CÁMARA DE NEUBAUER La observación se efectuó en cinco de los nueve cuadrados grandes de la cámara (5). Se consideró que la presencia de leucocitos era significativa cuando se observaron más de 10 por mm3.

UROCULTIVO Los cultivos se realizaron a partir de muestras de orina recién emitidas o conservadas a 4 °C no más de 24 h. Se emplearon ansas calibradas de 5 µL y con ellas se estriaron las correspondientes placas. Cada muestra se sembró en una placa de agar CLDE (Laboratorios Britania, Buenos Aires, Argentina) y una placa de agar chocolate con base de agar Columbia (Laboratorios Britania, Buenos Aires, Argentina). Se consideraron positivos (bacteriuria significativa) aquellos cultivos que presentaron desarrollos monomicrobianos con recuentos mayores o 53

iguales a 104 unidades formadoras de colonias por mL (ufc/mL). Las muestras que produjeron cultivos polimicrobianos o cultivos monomicrobianos con recuentos menores de 104 ufc/mL sólo se consideraron para comparar el recuento en cámara con la observación del sedimento entre sí, sin sacar conclusiones acerca de su correlación con el cultivo. Sólo las muestras con cultivos polimicrobianos menores a 104 y aquéllas en las que no se obtuvo desarrollo microbiano fueron consideradas negativas a los efectos de este estudio. Resultados En un período de dos meses se realizaron 2.287 urocultivos. Sólo 1.153 resultaron evaluables según los criterios de exclusión y 982 de ellos permitieron correlacionar ambos métodos microscópicos con el resultado de los cultivos. La correlación entre los recuentos en cámara y las observaciones del sedimento urinario fue del 96,4% (Tabla I). De la comparación con los urocultivos, surgió que las sensibilidades de ambos métodos microscópicos fueron del 53,5% y del 55,5% respectivamente para la observación del sedimento y el recuento en cámara. Las especificidades respectivas fueron del 90,7% y 91,4%. Discusión y Conclusiones El recuento en cámara de Neubauer de la orina sin centrifugar ha sido preconizado por algunos autores como el método de elección para valorar la presencia de leucocitos en muestras de pacientes con infecciones urinarias. Su costo operativo fue una traba para que se extendiera su uso en laboratorios que procesaban un gran número de muestras. En el presente trabajo, la correlación entre la observación semiestandarizada entre porta y cubreobjetos y la realizada con la cámara de Neubauer fue del 96,4%. Existen notables diferencias entre ambos métodos en lo que hace a la posibilidad de introducir errores sistemáticos, no obstante los resultados fueron comparables. Este hecho puede explicarse al considerar que el número de muestras con presencia de 3 a 5 leucocitos por campo (cercano al punto de corte) normalmente es bajo (3% en este estudio, resultados no mostrados). En estas circunstancias, las posibilidades de cometer errores en la valoración de la ausencia o presencia significativa de leucocitos resultan escasas. Ambos métodos parecen poco apropiados para poder descartar infecciones urinarias en poblaciones pediátricas similares a la estudiada por los autores. Estos métodos podrían producir resultados falsamente negativos en casi un 50% de los casos positivos por cultivo (S=44,5% - 46,5%) y resultados falsamente positivos en un 9 a 10% (E=90,7 - 91,4%). La negatividad de un sedimento o un recuento en cámara correspondió a más del 85% de las muestras con cultivo negativo (VPN=85,6% - 85,7%). La presencia de una cantidad significativa de leucocitos, tanto en la observación microscópica del sedimento urinario como en el recuento en cámara, correspondió a urocultivos positivos en más del 65% de los casos (VPP=65,6% - 68,9%).

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MEDICIÓN DE pH MÉTODO OBTENIDO DEL ARTICULO CIENTIFICO; pH de los alimentos: ¿una herramienta para el manejo de los pacientes con refl ujo gastroesofágico? Y basado en la Norma Oficial Mexicana NMX-f-317-NORMEX2013. (Alimentos - Determinación de pH en alimentos y bebidas no alcohólicas Método potenciométrico - Método de prueba).

MATERIAL Y MÉTODO 55

Muestreo Se utilizaron dos tipos de productos alimenticios para el análisis del pH: líquidos (leche materna y sucedá- neos de la misma) y sólidos (purés de frutas, verduras, cereales y carnes). Las muestras de leche materna fueron recogidas semana y media después del parto de madres de lactantes a término. Las madres utilizaron extractor de leche materna automático marca Medela y la leche fue almacenada en congelador durante tres días antes de la medición del pH. De los productos sólidos, elegimos los que se proporcionan con más frecuencia a los niños durante el periodo de alimentación complementaria. Asimismo, se midió el pH de alimentos industrializados (purés procesados, cereales molturados y queso de diversas marcas), así como naturales (frutas, verduras y carne sin sal ni azúcar). Preparación de los alimentos Se realizó una hora previa a la medición del pH. Productos naturales: se lavó cada fruto o verdura. Las verduras se sometieron a cocción de forma individual; los frutos se dejaron crudos. Luego, cada alimento fue molido hasta formar una papilla. Las muestras de leche materna fueron descongeladas a baño maría dos horas antes de la medición. Productos industrializados: los purés procesados únicamente se abrieron antes de la medición; los cereales y fórmulas lácteas se homogeneizaron con agua potable según las instrucciones de cada producto; el resto de los alimentos se molieron de forma individual. l. Cuantificación del pH La medición del pH de los productos alimenticios se realizó en el “Laboratorio de Nutrición” de la Universidad Iberoamericana, AC en la Ciudad de México, utilizando equipos electrónicos: potenciómetro. La metodología utilizada fue llevada a cabo por el jefe del Laboratorio 91 Casaubon-Garcín P y cols. pH de alimentos para lactantes Rev Mex Pediatr 2018; 85(3); 89-94 www.medigraphic.org.mx de Nutrición de dicha institución basado en la Norma Oficial Mexicana NMX-f-317-NORMEX-2013. (Alimentos - Determinación de pH en alimentos y bebidas no alcohólicas - Método potenciométrico - Método de prueba). Los alimentos se mantuvieron a una temperatura de 21 oC durante el periodo de prueba. Antes de cada medición se llevaron a cabo los siguientes pasos: 1) El electrodo se calibró a 7.00 sumergiéndolo en una solución buffer de pH 7 (JT Baker) y ajustando el potenciómetro hasta obtener un pH de 7.00. 2) El electrodo se enjuagó con agua destilada y luego se secó. 3) El electrodo se insertó en el alimento hasta que la lectura se estabilizó, para registrar su valor de pH. De cada muestra de leche materna se realizaron dos lecturas y se reportó el promedio de todas las mediciones efectuadas. De los 56

alimentos restantes, igual se llevó a cabo una medida duplicada y se reportó el promedio. Es conveniente mencionar que algunos alimentos fueron de productos con marcas comerciales, las cuales no se mencionan. Cada evaluación se realizó por duplicado; en general, el valor de pH que se reporta es el promedio obtenido de ambas muestras. RESULTADOS Los productos alimenticios que estudiamos se dividieron en tres grupos: alimentos naturales, alimentos industrializados y leches. En las diferentes tablas se reportó el valor promedio del pH obtenido en las mediciones realizadas por cada alimento. El cuadro 1 describe los niveles de pH encontrados en la leche; la leche materna reportó el pH más alcalino (7.24), seguida de las fórmulas de continuación (etapa 2) (7.22). El pH más ácido fue identificado en las fórmulas a base de arroz (6.08) y la leche entera seca (6.57). En el cuadro 2 se muestran los niveles de pH hallados en los alimentos naturales; los productos con pH más ácido fueron los jugos (3.20-4.16), seguidos por los frutos (3.41-5.78) y las verduras (5.55-6.99); los más alcalinos fueron los productos de origen animal (5.89-7.17). En el cuadro 3 se pueden ver los niveles de pH de los alimentos industrializados; el grupo de alimentos más ácidos fue el de los jugos (pH 3.19-3.57), seguido del de los frutos (pH 3.32-4.01), las verduras (4.85- 6.27), los cereales (5.4-7.95) y los productos de origen animal (4.72, 6.18). En el cuadro 4 clasificamos todos los alimentos ácidos, naturales e industrializados, según el contenido ácido. La mayoría fueron de bajo contenido ácido (pH 4.6-6.99). DISCUSIÓN Se encontró un predominio significativo de alimentos ácidos (95%). Sólo cuatro productos alimenticios fueron alcalinos (huevo: 7.17, leche materna: 7.24, fórmulas de seguimiento: 7.22 y galletas de trigo: 7.95). Durante el análisis de los alimentos naturales se observó que los productos de origen animal tenían valores de pH más altos que las frutas, verduras y jugos. Los jugos fueron los productos más ácidos (pH 3.2-pH 4.16); las frutas reportaron niveles de pH inferiores a 5.78, siendo las ciruelas las que tuvieron el pH más ácido (3.41). La lectura de pH más baja en el caso de las verduras fue el camote, con un valor de pH de 5.55 (Cuadro 2). En cuanto a los productos alimenticios industrializados, vale la pena mencionar que los jugos, frutas y verduras tuvieron valores de pH ligeramente más ácidos que los alimentos naturales. Este hecho está quizá relacionado con los métodos de conservación utilizados y la adición de vitaminas. Los cereales registraron valores de pH que oscilaron entre 7.95 (galletas de trigo) y 5.4 (pan blanco) (Cuadro 3).

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Cronograma de actividades.

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