Separacion Purificacion Y Caracterizacion De Principios Activos

18/08/2009

SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACION DE PRINCIPIOS ACTIVOS

Separación y purificación de principios activos Las técnicas utilizadas para separar y purificar los compuestos químicos presentes en las plantas medicinales son los mismos que se emplean comúnmente en química orgánica: •Extracción separativa. •Cromatografía (de reparto, de absorción, de gases, etc.). •Destilación (simple, fraccionada, a vacío, con arrastre de vapor). •Cristalización / recristalización. •Extracción liquido-liquido. •Etc.

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Cromatografía La cromatografía es una técnica de separación versátil que presenta distintas variantes.

En toda separación cromatográfica hay dos fases: una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo.

La muestra se disuelve en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil.

Cromatografía Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación.

Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

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Tipos de Cromatografía tipo

fase estacionaria

fase movil

líquido--sólido líquido

sólido inerte como gel de sílice o alúmina

disolventes

resina cambiadora

soluciones acuosas

intercambio iónico

líquido--líquido líquido adsorbido en un líquido soporte sólido

gas--líquido gas

película de líquido adsorbida sobre un soporte sólido

líquido

gas

Cromatografía en columna Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias. Como fase estacionaria se usa gel de sílice o alúmina dentro de una columna de vidrio. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad. Se empaca la columna con la fase estacionaria y a continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo

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Cromatografía en capa fina La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más comunes empleadas en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite: • Determinar el grado de pureza de un compuesto. •Identificar un compuesto químico. • Comparar muestras. • Realizar el seguimiento de una reacción. • Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna.

La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un sólido como gel de sílice o alúmina conteniendo algún fijador que hace que se mantenga la fase estacionaria sobre un soporte tal y como placas de vidrio, aluminio e incluso materiales plásticos. Las placas pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en el mercado. Para realizar una cromatografía en capa fina se procede de la siguiente manera:

1) Preparar o cortar, en su caso, una placa de tamaño adecuado.

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2) Disolver una pequeña cantidad de la muestra y, mediante un capilar de vidrio, la muestra se aplica en la parte inferior de la placa a cierta distancia del borde.

3) Introducir la placa en un recipiente con el disolvente adecuado. Dicho recipiente debe presentar una atmósfera saturada en el vapor del disolvente por lo que se pone trozo de papel de filtro en la parte posterior y se tapa.

4. Cerrar el recipiente y dejar que el líquido ascienda por capilaridad.

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5) Revelar la placa para poner de manifiesto donde se encuentran los puntos .

6) Determinar las posiciones relativas de los puntos mediante el cálculo del Rf.

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Cromatografía de gases La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en el inicio de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas de las sustancias a separar; su única función es la de transportar los compuestos a través de la columna. Esta técnica cromatográfica se emplea para separar mezclas de sustancias volátiles o con puntos de fusión relativamente bajos.

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6 2

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5 3

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Depósito de Gas y Controles de flujo / Presión. Inyector (Vaporizador) de la muestra. Columna Cromatográfica y Horno de la Columna. Detector. Amplificador de Señal. Registro de la Señal (Registrador o Computador).

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Cristalización / recristalización La cristalización es una técnica utilizada para la purificación de sustancias sólidas, basada en general en la mayor solubilidad que suelen presentar los sólidos en un disolvente en caliente que en frío El modo más frecuente es preparar una disolución saturada en caliente del sólido a purificar, utilizando un disolvente adecuado; filtrar para eliminar las impurezas insolubles que se hallen presentes y dejar que se separe por enfriamiento la sustancia que estaba disuelta, cristalizada y en un mayor estado de pureza.

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DISOLVENTE

COMPUESTO DE INTERES

IMPUREZA MEZCLA INSOLUBLE EN EL DISOLVENTE FRIO

CALENTAR A EBULLICION

MEZCLA INSOLUBLE EN EL DISOLVENTE FRIO

MEZCLA SOLUBLE EN EL DISOLVENTE CALIENTE

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ENFRIAR

MEZCLA SOLUBLE EN EL DISOLVENTE CALIENTE

FILTRAR Y SECAR

LAS MOLECULAS SE REACOMODAN FORMANDO UN CRISTAL PURO Y LAS IMPUREZAS QUEDAN DISUELTAS EN EL DISOLVENTE

PROCESO DE RECRISTALIZACION

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MUESTRA + DISOLVENTE

INSOLUBLE A T.A.

SOLUBLE A T.A.

CALENTAR A EBULLICION

DESCARTAR

DISOLUCION PARCIAL

DISOLUCION TOTAL

AGREGAR MAS DISOLVENTE

ENFRIAR HASTA RECRISTALIZAR

SI, SE ELIGE.

INSOLUBLE

NO, SE DESCARTA.

BUSCAR NUEVOS DISOLVENTES

Caracterización de los compuestos. Una vez aislado y purificado el compuesto se deberá caracterizar tanto por sus propiedades físicas como por métodos químicos y espectroscópicos; así en la CARACTERIZACIÓN FISICA, se determinan: •Propiedades organolépticas. •Punto de fusión (si el producto es sólido). •Punto de ebullición (si es líquido). •Densidad. •Índice de refracción. •Rotación óptica (si el producto es de origen natural). •Etc.

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En la CARACTERIZACIÓN QUÍMICA, se considera:

•Análisis elemental cualitativo y cuantitativo. •Clasificación por solubilidad •Determinación de acidez o basicidad. •Determinación de su constante de ionización. •Determinación del coeficiente de reparto. •Ensayos químicos preliminares.

Análisis espectroscópico. Las técnicas espectroscópicas tienen por objeto lograr la completa determinación estructural de una sustancia. De una manera general, los objetivos que se persiguen en un análisis espectroscópico completo son: •Fórmula molecular y peso molecular. •Presencia de insaturaciones. •Identidad de los grupos funcionales. •Posicionamiento de los sustituyentes y/o los grupos funcionales sobre el esqueleto carbonado. •Propiedades estereoquímicas.

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Técnicas espectroscópicas. TECNICA

INFORMACIÓN OBTENIDA

Espectrometría de masas

Formula y peso molecular, así como subestructuras a partir de los iones observados. observados.

Ultravioleta--Visible Ultravioleta

Existencia de cromóforos y/o conjugaciones en la molécula a partir de las absorciones observadas observadas..

Infrarrojo

Grupos funcionales a partir de las absorciones observadas.. observadas

Resonancia magnética nuclear

Grupos funcionales, subestructuras, conectividad, estereoquímica, etc. etc. a partir de datos de desplazamiento químico, áreas de los picos y constantes de acoplamiento observadas. observadas.

Rayos X

Estructura total estereoquímica.. estereoquímica

de

la

molécula

incluida

su

Espectrometría de masas. Técnica denominada de Impacto Electrónico (EM-IE) consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada) con una corriente de electrones a alta velocidad. Ello produce que la sustancia pierda electrones y se fragmente dando diferentes iones, radicales y moléculas neutras. Los iones, son conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte campo magnético y conducidos a un colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones en función de la relación carga/masa de los mismos.

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Espectroscopia ultravioleta. Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud de onda está comprendida entre los 100 y los 800 nm (energía comprendida entre las 286 y 36 Kcal/mol) y su efecto sobre la materia orgánica, es producir transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y/o moleculares de la sustancia. Los máximos de absorción se deben a la presencia de cromóforos en la molécula.

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Espectroscopia infrarroja. Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud de onda (λ) está comprendida entre los 800 y los 4000 nm, y su efecto sobre la materia orgánica, es producir deformaciones de los enlaces de la sustancia. Cada absorción observable en el espectro corresponde a una vibración determinada de algún enlace dentro de la molécula. Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas, llevan asociado un movimiento característico de los átomos, los principales son: las deformaciones de enlace, ángulos de valencia, ángulos diedros, deformaciones fuera del plano, etc. Este tipo de espectros determina sobre todo, los GRUPOS FUNCIONALES presentes en la molécula.

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Espectroscopia de R.M.N. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares, aunque también se puede emplear con fines cuantitativos. Esta técnica se basa en el fenómeno físico de resonancia magnética nuclear (RMN). Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben radiación electromagnética (concretamente en la región de las radiofrecuencias). Como esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran éstos.

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