Seminari 2-3

Seminario 2 (Prof.ssa Del Vecchio) L’evoluzione delle tecnologie e delle apparecchiature di imaging hanno permesso un uso della diagnostica per immagini per l’identificazione in vivo degli eventi molecolari alla base di sviluppo e progressione di patologie, in particolar modo neoplastiche, mediante la visualizzazione spaziale della morfologia e della funzionalità degli organi. Alla base di una neoplasia ci sono diversi eventi molecolari che vanno dalla proliferazione illimitata alla ridotta apoptosi, dall’indipendenza da segnali di crescita alla neoangiogenesi, dall’invasione di metastasi all’inattivazione di oncosoppressori (p53, Prb). L’imaging molecolare in oncologia interviene a varie fasi del percorso neoplastico (prognosi, diagnosi e risposta alla terapia). 1) PROLIFERAZIONE ILLIMITATA: per determinare il rate di proliferazione d un tumore, l’anatomopatologo deve asportarlo e valutare su di esso l’espressione di Ki67. Oggi è possibile in vivo somministrare al paziente analoghi marcati delle basi azotate (fluorotimidine) che si accumulano nei tessuti iperproliferanti (tomografia ad emissione di positroni). Il modello animale di questa tecnica è lo studio degli xenograft nei topi. 2) RIDOTTA APOPTOSI: il metodo tradizionale per valutare l’apoptosi è asportare il tumore e eseguire un saggio tunnel per marcare i frammenti di dna degradato. Oggi è possibile in vivo nel modello animale somministrare un tracciante radiomacato (annessina V) capace di legare la fosfatidil serina (espresso sulle cellule apoptotiche) che si andrà ad accumulare sul tessuto tumorale sottoposto a trattamento citotossico (valutazione del funzionamento di un farmaco proapoptotico). 3) INVASIONE: studio del potenziale metastatico. Le cellule metastatiche si possono ingegnerizzare trasfettandole con GFP, si iniettano nell’animale e si visualizzano le zone colonizzate. 4) ANGIOGENESI: si usano ultrasuoni che visualizzano il flusso ematico in un tumore (ecodopler), oppure sonde radiomarcate che legano marcatori di neoangiogenesi (integrine α2β3): PET con peptidi marcati col fluoro; RM con alta risoluzione magnetica (vasi piccoli). 5) INDIPENDENZA DAI FATTORI DI CRESCITA: dopo aver inibito la produzione di fattori di crescita, somministriamo traccianti con basi azotate marcate on fluoro: vengono identificate le aree di proliferazione Tecniche Si riscontra una certa difficoltà nel passaggio dall’animale all’uomo per i rischi legati all’utilizzo di sostanze radioattive nel corpo umano. Le tecniche più usate sono RM, Pet, Spect, TC; sono molto utilizzate macchine ibride, cioè capaci di eseguire contemporaneamente due diversi esami per la valutazione anatomca e molecolare di un fenomeno. La Pet-Tc ad esempio è utile sia per la diagnosi di patologie sia per il monitoraggio della terapia. L’ optical imaging è basato sull’utilizzo di alte risoluzioni spaziali (RM) e elevata sensibilità (Pet e Spect) ma i fotoni non penetrano nel corpo, quindi si possono usare solo per la cute o per analisi intraoperatorie. In modelli animali si utilizzano anche per analisi del feto intrauterine. Sonde a) sonde extracellulari non specifiche che tracciano il pool vascolare: gadolinio (MDC in RM) ottimo per lo studio della vascolarizzazione di una neoplasia b) sonde specifiche c) sonde intelligenti: si modificano in seguito al legame col target e diventano fluorescenti d) cel labeling e cel tracking: si prelevano leucociti del paziente, si marcano, si reiniettano e si visualizzano le sedi di infiammazione; si può fare lo stesso procedimento anche con cel staminali per studiarne l’attecchimento.

Pratica clinica I traccianti usati per marcare sono diversi a seconda della tecnica; si usano isotopi radioattivi, fluorocromi, sostanze paramagnetiche, microbolle. Un esempio è la PET con FDG (fluoro desossiglucosio), una sostanza nutriente marcata che viene captata dalle cellule mediante il trasportatore Glut1, viene fosforilata dall’esochinasi in modo da impedirne l’uscita, dopodichè è incapace di entrare nelle successive vie metaboliche per cui si accumula nella cellula. Il FDG viene captato con elevata avidità da cellule neoplastiche (fanno eccezione i tumori molto differenziati) che hanno upregulation di Glut1 e di esochinasi. In un tumore è notevolmente aumentata la glicolisi, ma non il ciclo di krebbs, probabilmente perché durante la fase ipossica della neoplasia sopravvivono solo cellule predisposte alla glicolisi. Dopo l’iniezione di FDG (1h) il paziente viene messo nella macchina e viene eseguita la Pet. La testa non viene analizzata perché fisiologicamente capta molto FDG. Prima di effettuare l’analisi si dosa la glicemia (dev’essere bassa altrimenti il Glu in circolo compete col FDG). Valutazione dell’uptake di FDG: - qualitativa: presenza o assenza di uptake - semiquantitativa: standard uptake value (SUV): viene valutato per discriminare lesioni maligne da benigne. Anche le flogosi consumano molto glucosio, ma in misura ridotta rispetto ad una neoplasia - quantitativa: micromol/min/ml: analisi cinetica dell’accumulo del tracciante del tumore e delle sedi di metastasi. Traccianti Fluorotimidina, annessina, fluorouracile, colina (metabolismo delle membrane), FDG, peptici per angiogenesi, farmaci per ipossia (i tumori ipossici sono + resistenti alle terapie), ioduro di sodio (si induce nel tumore l’espressione del trasportatore dello iodio, dopodichè si somministra lo iodio radioattivo letale per il tumore) - Fluorotimidina: utile per visualizzare la proliferazione: entra col trasportatore delle pirimidine, viene fosforilata da Timidino-chinasi ma non entra nella replicazione del DNA. Serve a valutare l’attività della timidino-chinasi1, indice di proliferazione. Negli animali la FlT viene usata per studiare xenograft in particolare nella risposta a terapia con farmaci che inibiscono la proliferazione. I farmaci antitumorali possono essere agenti citostatici (che inibiscono la proliferazione) e agenti citotossici (che inducono apoptosi). Per la valutazione degli effetti dei primi è necessario un monitoraggio dell’efficacia del trattamento mediante imaging.

Seminario 3 Ciclotrone È un acceleratore di particelle caratterizzato da 2 campi di forze: – Campo elettrico: accelera particelle cariche come protoni o deutroni – Campo magnetico: deflette le particelle lungo orbite di tipo circolare L’azione combinata dei due campi di forze porta le particelle a muoversi lungo una traiettoria con sviluppo a spirale, al termine della quale le particelle colpiscono un bersaglio (target), producendovi reazioni nucleari.

Componenti del ciclotrone:

• Due elettrodi cavi, detti «Dees» (a forma di D maiuscola) • Differenza di potenziale alternata che determina accelerazione delle particelle • Camera ad elevato grado di vuoto per evitare interazione con gas (si usano sistemi per generare il vuoto spinto: trasduttore di pressione, pompe a diffusione, pompe per rotatoria) • Campo magnetico: agisce sulle particelle portandole a muoversi lungo una traiettoria circolare.

Tipologie: 1) ciclotrone a ioni positivi (H+ protone; 2H+ deutrone; 3H+ nuclei di trizio) - vantaggi: fasci di corrente piuttosto elevati - svantaggi: difficile estrazione del fascio e scarso rendimento per attivazione diretta della materia e delle strutture interne del ciclotrone. 2) ciclotrone a ioni negativi (H- con 2 elettroni): gli ioni negativi hanno la stessa massa di quelli positivi, non sono in grado di produrre attivazione direttamente e devono essere trasformati in ioni positivi; vengono prodotti mediante “sorgenti di ioni”: una scarica di corrente viene generata all’interno di un gas puro, neutro, confinato in una regione delimitata da un campo magnetico: all’interno del gas dalla vicinanza di H e ioni (H+ e e-) si producono ioni H-; questi ioni H- posseggono una nuvola elettronica che con uno schermo colombiano impedisce loro di interagire con la macchina prima di trovare il target; una volta prodotti, vengono guidati con un campo elettrico in un sistema di immissione entro la camera a vuoto del ciclotrone. Qui si muovono lungo una traiettoria circolare. Ogni volta che attraversano lo spazio tra gli elettrodi acquistano energia ed assumono una traiettoria a spirale (fascio). L’estrazione degli ioni dal fascio avviene grazie all’impatto su un foglio di grafite che trattiene 2e- e li trasforma in H+; a questo punto gli ioni positivi ottenuti vengono deviati e sulla loro traiettoria è posto il target. Il target è un atomo in fase liquida o gassosa contenuto all’interno di un corpo metallico. Durante il bombardamento viene generato calore, che può modificare lo stato fisico del target, e la funzione del corpo metallico è proprio quella di dissipare il calore.

Es: • Produzione di 18F-

Il target è costituito da acqua arricchita nell’isotopo stabile 18 dell’O2 (8 protoni e 10 neutroni); la reazione che si verifica è 8O18 + 1H1  9F18 + 0n1; il F18 in forma anionica prodotto può attaccare il corpo del target o può subire decadimento positronico a O18 RADIOCHIMICA I laboratori di radiochimica servono a produrre prodotti di sintesi radioattivi per la pratica clinica e diagnostica. Vengono utilizzati armadi di piombo, cappe schermate con piombo a diverso spessore e tutte le norme di sicurezza per schermare le radiazioni γ e x. Attualmente esistono dei moduli di sintesi ad elevato curie messi in atto in maniera automatica dalle macchine per ridurre al minimo il rischio per l’operatore. Gli emittenti positronici usati sono 18F, 11C, 15O, 13N; si prestano bene a marcare molecole organiche e possono essere sostituiti senza alterare il tempo di reazione o i meccanismi di azione di una molecola; il Fluoro può sostituire un gruppo CH3: ad es nel FDG il Fluoro sostituisce un sito importante per la metabolizzazione della molecola. Si possono produrre anche sostanze chelanti che vengono aggiunte alla molecola (proteina principalmente) in questione. Fondamentale è la stechiometria nelle reazioni radiochimiche: è necessario che la [ ] di substrato da marcare sia in eccesso rispetto al reagente marcato, in modo da non permettere contaminazione con altre reazioni competitive. ATTIVITà SPECIFICA: attività introdotta per unità di massa (+ unità carrier: target rimasto non marcato). In condizioni ideali le reazioni sarebbero carrier free. - Sintesi di FDG: il precursone è Mannosio, che reagisce con una soluzione con 18F + k chelato con un etere che scherma il suo potere ionico. Poi si aggiunge NaOH e successivamente vengono ionizzati i gruppi acetili  FDG I controlli di qualità in un laboratorio di radiochimica sono fondamentali: il radiofarmaco deve essere conformato alle norme di sicurezza e avere tutti i requisiti. Viene sottoposto ad un esame visivo, pH, osmolarità, purezza radiochimica (verifica che la molecola ottenuta sia quella desiderata, mediante dHPLC) e purezza radionuclidica (verifica che la molecola sia marcata con 18F e non con altri eventuali radionuclidi contaminanti: si può fare analizzando il tempo di decadimento o attraverso un analizzatore cristallino che valuta i livelli energetici).