Saperoni Seminarski

[arac Sa{a Andrej

[aperoni

2008.

Uvod [aperoni Molekularni {aperoni (chaperones) su proteini koji poma`u u pravilnom savijanju proteina za vreme ili nakon translacije. Oni pripadaju heat-shock proteinima (HSP) jer im se pove}ava koncentracija pri vi{im temperaturama (npr tokom groznice) {to predstavlja odbranu organizma (visoka temperatura mo`e da promeni konformaciju klju~nih proteina i dovede do katastrofalnih posledica po }eliju). Funkcija proteina zavisi od konformacije. Abnormalno savijeni proteini mogu da dovedu i do neurodegenerativnih bolesti1 poput Hungtintonove ili Alzheimer-ove bolesti (slika 1). Prionske bolesti su tako|e posledica nepravilnog savijanja proteina ali za razliku od gore navedenih one su infektivne. Abnormalan PrP* protein navodi normalne PrP proteine da pre|u u infektivnu formu.

Slika 1. Znaci Alzheimer-ove bolesti

Klasifikacija Heat shock proteini se javljaju u razli~itim formama i nalaze se u prokariotskim i eukariotskim }elijama. Visoko su konzervativni {to ukazuje na njihov fundamentalni zna~aj. Kako predstavljaju odgovor }elije na stres, potencijalno mogu da se koriste kao markeri }elijskih o{te}enja. Molekularna masa im je od 15-110 kDa i na osnovu mase i funkcije podeljeni su u grupe (tabela 1). Prisutni su u citosolu, mitohondrijama, endoplazmati~nom retikulumu i nukleusu. Najbolje prou~eni sisarski HSP-ovi su od 60,70,90 i 110 kDa. U~estvuju u mnogim procesima: savijanju proteina,njegovoj translokaciji,stabilizaciji citoskeleta {to doprinosi termotoleranciji. Me|utim, termotolerancija nije uvek povezana sa agregacijom HSP-a jer je odgovor sisara na stres kompleksan.

1

Abnormalni proteini mogu obrazovati amiloidne depozicije tako {to grade fibrile od uvijenih βkonfiguracija koje nale`u jedna na drugu,dok kod normalnih proteina dominira α-konfiguracija koja spre~ava stvaranje slojeva.

2

HSP familija HSP27 (sHSP)

Lokacija Citosol, nukleus

Mogu}a funkcija Stabilizacija mikrofilamenata,antiapoptotska HSP60 Mitohondrije Ponovno savijanje proteina, onemogu}avanje agregacije denaturisanih proteina,proapoptotska HSP70 familija: Antiapoptotska HSP72 (Hsp70) Citosol, nukleus Savijanje proteina,za{tita }elije HSP73 (Hsc70) Citosol, nukleus Molekularni {aperoni HSP75 (mHSP70) Mitohondrije Molekularni {aperoni HSP78 (GRP78) ER Za{tita }elije,molekularni {aperoni HSP90 Citosol, ER, nukleus Regulacija receptora steroidnog hormona,translokacija proteina HSP110/104 Citosol Savijanje proteina HSP,heat shock protein; sHSP,small (mali) HSP; ER, endoplazmati~ni retikulum Tabela 1. Lokacije i funkcije sisarskih HSP-a

Hsp70 {aperoni funkcioni{u rano,tokom sinteze polipeptidnog lanca (slika 2). Visoko su konzervativni i njihovi geni pokazuju 60-80% identi~nih baza u }elijama razli~itih eukariota. Pomognuti hsp40 ko{aperonima (slika 3), hsp70 se vezuju za hidrofobne delove polipeptidnog lanca,hidrolizuju ATP do ADP-a {to dovodi do njihove konformacione promene i ~vrstog vezivanja za metu. Hsp40 se otka~inje, a nakon smene ADP-a novim ATP-om hsp70 se otka~inje. Ciklusi prika~injanja i otka~injanja hsp70 usmeravaju savijanje ciljnog proteina. Druga funkcija je odmotavanje proteina i priprema za transport kroz membrane i zatim ponovno savijanje.

Slika 2. Funkcija Hsp70 {aperona

Svaki hsp70 ima 3 domena: 1) Domen N-kraja vezuje ATP. 2) Domen za vezivanje supstrata ima afinitet prema hidrofobnim aminokiselinama. 3) Domen C-kraja se pona{a kao poklopac. Kad je za hsp70 vezan ATP poklopac je otvoren,i lako se vezuje ali i otpu{ta supstrat. Kad je vezan ADP poklopac se zatvara i ~vrsto vezuje supstrat.

3

Slika 3. Mehanizam kooperacije HSP70 i HSP40 pri savijanju proteina

HSF(Heat shock transcription factors) se vezuju za regulatorne elemente u stresnim uslovima i aktiviraju transkripciju gena za Hsp70. Pored hipertermije, acidoza, viralna infekcija,kiseonikovi radikali i njegova reaktivna jedinjenja, ishemija, hipoksija i brojni drugi stimulusi indukuju transkripciju Hsp70 (slika 4). Postoje naznake da je translacija Hsp70 nezavisna od transkripcije njegovog gena.

Slika 4.Mehanizam aktiviranja sinteze HSP70. ROS-reaktivne kiseonikove vrste. RNS-reaktivne azotove vrste. HSF vezan za HSP je neaktivan. Stresor izaziva razdvajanje HSF-a od HSP-a. HSF je fosforilisan kinazama i formira trimere koji ulaze u nukleus, vezuju se za promoter i aktiviraju transkripciju HSP70.

4

Ste~ena termotolerancija predstavlja produ`enu (3-5 dana) otpornost organizma na visoke temperature nakon izlaganja subletalnoj temperaturi. Dolazi do proizvodnje Hsp70. Termotolerancija organizma zavisi od stepena tolerancije najosetljivijeg vitalnog organa. Tako se uo~avaju gastrointestinalni problemi kod tela izlaganog visokoj temperaturi (120min na 42ₒC) jer je tanko crevo posebno osetljivo na povi{enu temperaturu. Ubacivanje plazmida koji sadr`i gen za Drosophila-in Hsp70 u fibroblast majmuna pove}ava otpornost fibroblasta na visoke temperature. Tako|e Hsp702 {titi retinu pacova od o{te}enja izazvanog svetlo{}u ve}eg intenziteta. Hsp doprinose pobolj{anju imuniteta tako {to olak{avaju prepoznavanje antigena, aktiviraju T limfocite, uti~u na produkciju citokina i NK }elija. Tako|e otkrivena je pove}ana produkcija Hsp70 u skeletnim mi{i}ima, limfocitima, slezini i srcu pacova koji su izlagani fizi~kim naporima. Sli~ni rezultati dobijeni su kod ~oveka. Smanjena ekspresija Hsp-a je povezana i sa starenjem organizma.

Slika 5 Ekspresija Hsp70 u jetri mladog (levo) i starog (desno) pacova nakon izlaganja povi{enoj temperaturi. Uzorci su bojeni antitelima specifi~nim za Hsp70. Kod mladog pacova je prime}en znatno ja~i odgovor u predelu centralne vene.

Hsp60 (jo{ se zovu {aperonini) {aperonski kompleks je u obliku burenceta (izolacione komore) i modifikuje konformaciju proteina nakon translacije. Pogre{no savijeni protein se izoluje u burencetu (slika 5) ~ime se spre~ava njegova agregacija sa drugim proteinima i obezbe|uje pogodna sredina za ponovno savijanje. Protein se vezuje preko hidrofobnog dela za {aperonski kompleks. Sledi vezivanje ATP-a i proteinske kape {to dovodi do pro{irenja otvora burenceta, kroz koji upada protein i zatvaranja otvora kapicom.

2

Proizveden nakon izlaganja visokoj temperature

5

Slika 5. Funkcija Hsp60 {aperonina

Hsp60 kompleks se sastoji iz 14 identi~nih subjedinica koje su ure|ene u 2 prstena (od 7 subjedinica). Svaka subjedinica ima 3 domena: apikalni, intermedijarni i ekvatorijalni domen. ATP kao i drugi prsten se vezuje za ekvatorijalni domen. Na cis heptamerski prsten nale`e kapa i on je u svom apikalnom i intermedijarnom delu “pomeren” {to pove}ava zapreminu i omogu}ava zatvaranje ciljnog proteina (slika 6).

Slika 6. Struktura GroEL-GroES-(ADP)7 kompleksa

Vezivanjem ATP-a i GroES kape za cis prsten GroEL-a dolazi do konformacione promene koja onemogu}ava njihovo vezivanje za trans prsten. Ali kad ATP hidrolizuje,trans prsten mo`e da ve`e ATP i to dovodi do otka~injanja kape od cis prstena. Tako mutant koji ima samo jedan prsten mo`e da ve`e supstrat i kapu ali ih ne pu{ta nakon hidrolize ATP-a. Dakle, oba prstena su neophodna za funkcionisanje {aperonskog kompleksa. Tek nakon ATP hidrolize cis prstena, trans prsten mo`e da ve`e GroES,dobije funkciju cis prstena i obradi pogre{no savijeni protein. [aperoninski ciklus se sastoji iz nekoliko stupnjeva:

6

Slika 7. [aperoninski ciklus

1.GroEL prsten vezuje 7ATP-a, pogre{no savijen protein i GroES kapu. Ovo dovodi do konformacione promene prstena koji postaje cis prsten sa uve}anom zapreminom koja je oblo`ena hidrofilnim grupama koje pru`aju mikrookru`enje za savijanje proteina. 2. Nakon 13 sekundi dolazi do hidrolize 7ATP-a u 7ADP. Nedostatak γ fosfatne grupe slabi vezu izme|u GroEL i GroES. 3.Drugi molekul supstrata i 7 ATP-a se vezuju za trans prsten. 4.vezivanje ATP-a i supstrata za trans prsten indukuje otpu{tanje GroES kape, 7ADPa i sad bolje savijenog proteina iz cis prstena. Trans prsten vezuje GroES kapu i postaje cis prsten i ciklus se ponavlja. Supstrat koji se nije dobro savio ima izlo`ene hidrofobne delove koji se vezuju za {aperonin. Protein koji je ispravno savijen nema izlo`enih hidrofobnih delova i zato ne mo`e da se ve`e za {aperonin. Protein koji je vezan za hidrofobne delove apikalnog dela {aperonina biva rastegnut,delimi~no raspleten jer se pro{iruje otvor sa vezivanjem ATP-a i GroES kape. Istezanje dovodi do pove}anja slobodne energije {to omogu}ava proteinu da

7

prevazi|e lokalni minimum 3u kome je bio zarobljen i nastavi savijanje ka globalnom energetskom minimumu i prirodnom stanju (slika 8).

Silka 8. Potencijalna jama

Hsp90 u~estvuju u savijanju proteina koji u~estvuju u preno{enju signala kroz }eliju,uklu~uju}i i receptore steroidnog hormona. Hsp90 se sastoji iz 4 domena (slika 9): 1) Domen N-kraja koji vezuje ATP. 2)Linkerskog regiona 3)Sredi{njeg domena 4)Domena C-kraja

Slika 9. Hsp90

Hsp90 obrazuju homodimere koji poput kle{ta dr`e supstrat. Kao primer zavisnosti preno{enja signala vezanog za steroidni receptor od Hsp90 navodimo glukokortikoidni receptor (GR) koji se nalazi u citoplazmi i za njega je (pored drugih proteina) vezan hsp90. Ovi dodatni proteini stavljaju receptor u takvo stanje da je sposoban da ve`e hormon. Dalje, Hsp90 vezuje imunofiline koji vezuju GR kompleks za motorni protein dinein koji u~estvuje u transportu receptora iz citoplazme u nukleus gde se GR receptor vezuje za odre|enu sekvencu DNK i reguli{e ekspresiju gena. Hsp90 je neophodan i za funkcionisanje drugih receptora koji vezuju aldosteron,androgen, estrogen i progesteron. Hsp90 u~estvuje i u onkogenezi,a lekovi koji inhibiraju Hsp90 inhibiraju i rast tumora. 3

Ne postoji jedan odre|eni put koji protein mora da prati pri savijanju.Postoji vi{e na~ina kojima se mo`e do}i do globalnog minimuma ali na svom putu protein mo`e da upadne u lokalne minimume (doline) iz kojih mora iza}i.

8

4.Nukleoplazmini su kiseli nukleusni proteini ~ije prisustvo je neophodno za ispravno obrazovanje nukleozoma iz DNK i histona. [aperoni ~esto funkcioni{u u timu. Npr hsp60 zavr{ava posao koji nije obavio hsp70. Proteini koji ne uspeju pravilno da se saviju bivaju obele`eni poli-ubiquitinskim signalom i degradirani u proteazomu. BiP(binding protein) je {aperonski protein koji repetitivno vezuje i otpu{ta polipeptidni lanac koji se preko translokatora ubacuje u ER lumen. Osim Hsp70 u citosolu,mitohondrije poseduju hsp70 koji poma`e uvla~enje polipeptidnog lanca preko translokatora iz intermembranskog prostora u mitohondrijalni matriks (slika 10).

Slika 10. Unos proteina u mitohondriju

Zaklju~ak O~uvanje ispravne konformacije proteina i time njegove funkcije je od vitalne va`nosti, {to obezbe|uju razli~iti {aperoni. U stresnim uslovima, npr pri izlaganju visokim temperaturama, dolazi do njihove poja~ane sinteze ~ime organizam pobolj{ava termotoleranciju. Razmatra se njihova upotreba u terapeutske svrhe jer smanjena ekspresija Hsp-a ima udela u starenju i slabljenju imunog odgovora. Potrebna su dalja istra`ivanja jer se javljaju problemi prilikom prekomerne ekspresije Hsp-a.

Literatura: 1)Voet D.,Voet J.: Biochemistry,3rd ed.,USA 2004.,John Wiley&sons,inc. 2)Alberts B.,Johnson A.,Lewis J.,Raff M.,Roberts K.,Walter P.:Molecular biology of the cell,4thed,USA 2002.,Garland Science 3)Campbell N.,Reece J.:Biology,7th ed, 2005.Pearson Education: Benjamin Cummings 4) Kregel C. K.: Molecular Biology of Thermoregulation:Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance, J Appl Physiol 92: 2177–2186, 2002; 10.1152/japplphysiol.01267.2001. 5) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

9