S13 Aliskiren

Aliskiren – prvi peroralni inhibitor renina

Avtorji: Marko Simonič Maša Sinreih Katarina Smolej Mateja Somrak Franci Sopotnik

Mentor: Prof. dr. Danijel Kikelj

Anja Zaletel Anže Zorc

Kazalo 1 Uvod....................................................................................................................................4 2 Renin angiotenzin aldosteronski sistem..............................................................................5 3 Odkritje aliskirena...............................................................................................................6 4 Načrtovanje aliskirena.........................................................................................................9 4.1 Modifikacije P3 in P4 arilnega mesta.........................................................................10 4.2 Modifikacije dušika na stranski verigi.......................................................................12 4.3 Modifikacije P1' mesta na stranski verigi..................................................................14 5 Vezava aliskirena na renin................................................................................................14 6 Sintezna pot do aliskirena, prvega peroralnega inhibitorja renina....................................17 6.1 Komentar k sintezi......................................................................................................20 6.2 Industijska sinteza aliskirena......................................................................................21 7 Zaključek...........................................................................................................................22 8 Literatura...........................................................................................................................23

Kazalo slik Slika 1: Shema cepitve angiotenzinogena do angiotenzina I in II.........................................5 Slika 2: Predstavniki prve, druge in tretje generacije inhibitorjev renina..............................7 Slika 3: Mehanizem cepitve peptidne vezi z aspartatno proteazo..........................................8 Slika 4: Izolirani derivati stabilnega prehodnega stanja.........................................................8 Slika 5: Enalkiren in zankiren................................................................................................9 Slika 6: Peptidomimetik angotenzinogena...........................................................................10 Slika 7: Prvi nizkomolekularni inhibitor..............................................................................10 Slika 8: Mesta modifikacij na aliskirenu..............................................................................10 Slika 9: Aliskiren..................................................................................................................14 Slika 10: Vezava aliskirena v aktivno mesto encima. Molekula aliskirena je prikazana z »ball and sticks« modelom. Z Sx so označeni predeli aktivnega mesta, na katere se veže aliskiren. ..........................................................................................................................................................14 Slika 11: Človeški renin zaseden z aliskirenom. Vidno je, da aliskiren zaseda S3 do S2' območja enicma in zato blokira katalitično funkcijo encima..........................................................15 Slika 12: Superpozicija aliskirena (vijolična) s peptidnim inhibitorjem CGP 38560A (zelena), kjer so vidne razlike v vezavi obeh substratov na renin....................................................15 Slika 13: Vezava aliskirena s Ser219. Encimsko vezana voda (W092) na vstopu v S3sp žep tvori mostično vodikovo vez med fenolnim kisikom aliskirena in OH skupino Ser219...........15 2

Slika 14: Vezava aliskirena na S1-S3 vezavno mesto renina ter interakcija metoksipropoksi stranske skupine aliskirena z S3sp žepom.......................................................................................16 Slika 15: Interakcije α,α-diMe β-alanin karboksamida aliskirena (zelena barva) z S2' žepom. Na sliki je prikazana tudi n-butilna skupina starejših inhibitorjev.....................................16 Slika 16: Sintoni A, B in C...................................................................................................21

Kazalo tabel Tabela 1: Modifikacije mesta P3 in P4................................................................................11 Tabela 2: Modifikacije mesta P3..........................................................................................12 Tabela 3: Modifikacije na dušiku v stranski verigi..............................................................12 Tabela 4: Modifikacije dušika na stranski verigi.................................................................13 Tabela 5: Modifikacije dušika na stranski verigi.................................................................13 Tabela 6: Modifikacije dušika na stranski verigi.................................................................13 Tabela 7: IC50 vrednost aliskirena za različne humane peptidaze (A) in IC50 aliskirena za renin v sesalskih predstavnikih (B)..................................................................................................16

3

1 Uvod Hipertenzija je glavni dejavnik tveganja za srčno-žilne bolezni, te pa so glavni vzrok umrljivosti v zahodnem svetu. Po poročilu Svetovne zdravstvene organizacije naj bi letno za posledicami srčno-žilnih bolezni umrlo več kot 7.1 miliona ljudi. Številka je zaskrbljujoča predvsem zato, ker kar 30 % vseh obolelih za hipertenzijo zanjo ne ve, 11%, ki imajo povišan krvni tlak, pa se sploh ne zdravi. Trenutno je na trgu več razredov zdravilnih učinkovin za zdravljenje hipertenzije ( ßblokatorji, ACE inhibitorji…). Mi se bomo v nadaljevanju osredotočili na predstavitev aliskirena. Leta 2007 sta ga EMEA in FDA odobrila kot prvega peroralnega inhibitorja renina za zdravljenje hipertenzije. V Sloveniji je dovoljenje za promet pridobilo po tako imenovanem centraliziranem postopku avgusta leta 2007 in je na trgu prisoten pod lastniškimi imeni Rasilez®, Enviage®, Sprimeo®, Tekturna® in Riprazo®.

4

2 Renin angiotenzin aldosteronski sistem Renin-angiotenzin-aldosteronski sistem ali RAAS je hormonski sistem, ki uravnava krvni pritisk in elektrolitsko ter vodno ravnotežje v telesu. To se dogaja preko sekrecije renina iz celic gladke muskulature v aferentni arterioli nefrona. V steni teh arteriol se renin sintetizira, shranjuje in izloča v krvni obtok. Tu igrajo pomembno vlogo trije faktorji: •

krvni tlak: aferentne arteriole so baroreceptorji, ki ob zmanjšanju tlaka stimulirajo sekrecijo renina in obratno, ob povečanem tlaku se sekrecija renina inhibira

•

aktivnost simpatika: aktivacija simpatičnih živcev, ki oživčujejo aferentno arteriolo, stimulira sekrecijo renina, prav tako tudi znižan tonus simpatika inhibira oziroma zmanjša sekrecijo renina

•

koncentracija NaCl v maculi densi: v primeru znižanja koncentracije NaCl v maculi densi se sekrecija renina stimulira, ob zvišani koncentracijo pa inhibira. Sam renin brez substrata nima nobene fiziološke funkcije. Je proteolitični encim, ki od

angiotenzinogena, α-2-globulina, sestavljenega iz 452 aminokislin, ki je vedno prisoten v krvi in ga proizvajajo jetra, odcepi dekapeptid angiotenzin I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu). Tudi ta nima nobenih poznanih direktnih fizioloških učinkov, a je substrat za ACE (angiotensin converting enzyme), ki iz njega pripravi fiziološko aktivno obliko, angiotenzin II z odcepom še dveh aminokislin, histidina in levcina. Ta pretvorba se zgodi na površini vaskularnih endotelijskih celic pljuč in jeter.

Slika 1: Shema cepitve angiotenzinogena do angiotenzina I in II

5

Angiotenzin II ima številne pomembne učinke: •

stimulacija sekrecije aldosterona iz skorje nadledvične žleze

•

arteriolna vazokonstricija, ki zviša krvni tlak

•

stimulacija sekrecije antidiuretskega hormona (ADH) in stimulacija žeje

•

povečana reabsorpcija NaCl v proksimalnih tubulih Aldosteron je steroidni hormon, ki ga proizvajajo celice skorje nadledvične žleze. Stimulus

za njegovo sekrecijo je angiotenzin II in povišana koncentracija K v plazmi. Aldosteron poveča reabsorpcijo NaCl v debelem ascendentnem delu Henlejeve zanke, v distalnem tubulu in zbiralcu. Manipulacija reninskega sistema se pogosto uporablja za zniževanje visokega krvnega tlaka. Prijemališča, katera izkoriščajo trenutno razvite učinkovine so angiotenzinska konvertaza, repeptorji za aldosteron AT1 in v zadnjem času tudi renin.

3 Odkritje aliskirena V sedemdesetih in osemdesetih letih so bili odkriti inhibitorji angiotenzinske konvertaze, v devetdesetih letih pa je sledil razvoj antagonistov aldosterona na AT1 receptorjih. Obe vrsti zdravil se danes široko uporabljata v terapiji hipertenzije, srčnega popuščanja in diabetične nefropatije. Te učinkovine izkazujejo veliko neželjenih učinkov. Zaradi zmanjšane koncentracije angiotenzina II v plazmi se aktivirajo kompenzacijski mehanizmi, ki pospešujejo sintezo in sekrecijo renina. V primeru ACE inhibitorjev se tako poveča plazemska koncentracija renina in angiotenzina I, antagonisti AT1 receptorjev pa povišajo

plazemsko koncentracijo renina in

angiotenzina II. Zaradi tega se učinek zdravil, ki delujejo na RAAS, s časom zmanjšuje. Pri uporabi ACE inhibitorjev lahko pride do pojava kašlja ali angioedema, kar lahko vodi do življenjsko ogrožajoče zožitve dihalnih poti. Zvišana plazemska koncentracija renina pa zvišuje verjetnost za srčni napad in pospešeno odpoved ledvic za kar 4 -6 krat. Inhibitorje renina so začeli razvijati v firmi Ciba-Geigy, ki se je leta 1996 s Sandozom združila v Novartis. Zaradi začetka prodaje valsartana so raziskave reninskih inhibitorjev postavili na stranski tir, čez tri leta pa so se na podlagi mnenj določenih raziskovalcev odločili, da prepustijo razvoj aliskirena Speedelu.

6

Slika 2: Predstavniki prve, druge in tretje generacije inhibitorjev renina

Kemični razvoj inhibitorjev renina je potekal v treh fazah. Najprej so razvili peptidne analoge angiotenzinogena, ki so blokirali encimsko delovanje renina. Generacija je bila metabolno nestabilna in imela nizko učinkovitost. Druga generacija so bili peptidomimetiki, ki so oponašali prehodno stanje dipeptida, ki je inhibitor v aktivnem mestu encima. Ta generacija je bila bolj učinkovita (delovanje že v nanomolarnih koncentracijah) in je zniževala krvni pritisk po parenteralni aplikaciji tako pri živalih kot pri ljudeh. Nadaljnji razvoj druge generacije je vodil do daljšega razpolovnega časa in peroralno aktivnih učinkovin, problematične pa so bile zelo visoke doze, ki so bile potrebne za dosego učinka. Strukturne spremembe za izboljšanje metabolne stabilnosti so bile uspešne, biološka uporabnost po peroralni aplikaciji in z njo znižanje krvnega pritiska pa sta ostala nizka. Klinična uporaba je bila zaradi nizke peroralne aktivnosti in kratkega razpolovnega časa omejena. Renin je asparaginska proteaza, zgrajena iz dveh homolognih delov, med katerima leži žleb z dvema katalitično aktivnima asparaginskima kislinama. Za razliko od drugih proteaz je renin zelo specifičen in deluje samo na angiotenzinogen tako, da ga pretvori v angiotenzin1. Mehanizem cepitve poteka preko tetraedričnega prehodnega stanja (slika 2), katerega struktura je ključna za načrtovanje inhibitorjev. 7

Slika 3: Mehanizem cepitve peptidne vezi z aspartatno proteazo

Inhibitor mora poleg tega vsebovati še neko funkcionalno skupino, ki bo prehodno stanje stabilizirala in tako preprečila cepitev peptidne vezi. Izolirani inhibitorji so bili derivati hidroksietilena, etilenglikola, statina in norstatina (slika 3). Aliskiren ima v svoji strukturi hidroksietilenski derivat, je nenaravna aminokislina, katere renin ne zna cepiti.

Slika 4: Izolirani derivati stabilnega prehodnega stanja

Najmanjši prepoznan substrat je oktapeptid His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr. To zaporedje je zelo podobno AK zaporedju His6-Pro7-Phe8-His9-Leu10-Val11-Ile12-His13, ki se nahaja znotraj angiotenzinogena. J. Boger je nestabilno Leu-Leu vez zamenjal z dipeptidomimetikom iz dveh molekul statina ter zadnja C-terminalna ostanka Val-Tyr zamenjal s podobnima hidrofobnima AK Leu-Phe. Rezultat teh modifikacij je bila spojina SCRIP, ki je, aplicirana intravensko, izkazovala kratkodelujočo aktivnost v inhibiciji renina. Ti poskusi so nakazali, da bi lahko tudi manjša sintezna molekula uspešno inhibirala renin in znižala krvni tlak za daljše časovno obdobje. Vendar pa je občutljivost na encimsko cepitev omejevala terapevtsko uporabo SCRIP in njenih analogov. SAR študije so pokazale, da bi lahko N-terminalno His-Pro-Phe zaporedje zamenjali z aciliranim fenilalaninom ali tirozinom, ne da bi pri tem izgubili inhibitorno aktivnost. Z dodatnimi modifikacijami na SCRIP so razvili enalkiren (A-64662), novo potencialno molekulo za klinična testiranja. Histidinski ostanek (His6), ki je prisoten v angiotenzinogenu in vseh prejšnjih testnih molekulah, so smatrali kot ključen za prepoznavanje encima, zato so ga pustili nespremenjenega (v aliskirenu ga ni več). Aciliran tirozin ščiti molekulo pred aminopeptidazami ter hkrati prispeva k boljšemu prepoznavanju aktivnega mesta na reninu. 8

Cikloheksilmetilna in izo-butilna stranska veriga sta lipofilni komponenti in posnemata lipofilni verigi, prisotni na Leu10 in Val11 angiotenzinogena (T. Lemke, D. Williams, 6th Ed., 741). Na C-terminalnem koncu uporaba alkohola namesto karboksilata še dodatno ščiti molekulo pred karboksipeptidazami. Enalkiren so obsežno preučevali v predkliničnih in kliničnih študijah, kjer se je izkazal za učinkovitega pri i.v. aplikaciji. Peroralno pa je bila njegova BU majhna, v glavnem zaradi majhne lipofilnosti. Zankiren, lipofilnješi analog, je imel večjo peroralno BU in je v kliničnih študijah kazal signifikantno znižanje krvnega tlaka, a so zaradi neimenovanih razlogov nadaljnji razvoj opustili. Prvi nepeptidni peroralno aktiven inhibitor renina, potrjen s strani FDA, je postal aliskiren, ki spada v tretjo generacijo reninskih inhibitorjev. S pomočjo napredka v kristalografiji in SAR študijah so ugotovili, da aliskiren interagira z več žepi v različnih regijah okoli aktivnega mesta renina. Pokazalo se je, da histidinski ostanek ni nujno potreben za inhibitorno delovanje. Zelo pomembno pa je bilo odkritje, da molekula reagira tudi s prej nepoznanim žepom S3 sp renina, ki se razteza od S3-vezavnega mesta. Vezava aliskirena s tem mestom je esencialna za močno inhibicijo renina.

Slika 5: Enalkiren in zankiren

4 Načrtovanje aliskirena Prva

potencialna

antihipertenzivna

učinkovina

je

bil

biotehnološko

pridobljen

rekombinantni inhibitor človeškega renina, vendar se je pri poskusih izkazalo, da ob prisotnosti 9

plazme izgubi aktivnost. Na podlagi strukture peptidomimetika angiotenzinogena (slika 2) so začeli z načrtovanjem nizko molekularnih peptidomimetičnih spojin (slika 3). Z računalniškim modeliranjem in rentgensko kristalografijo so nato preučevali spojino in ugotovili, da področje P3-P1 tvori vodikove vezi s Ser19 v reninu, P1' izopropilna skupina in P3 tercbutilna skupina pa interagirata z S3-S1 hidrofobnim področjem encima. Relativno velik P1' izopropil tako penetrira globoko v hidrofobni S1 žep, majhna para-metoksi skupina na fenilnem vmesniku pa ustrezno zapolni S3 mesto. Metilna skupina je v S3 žepu usmerjena proti Leu114, Ala115 in Phe117. Karboksamidna skupina tvori vodikove vezi z distalnim mestom encima, N-alkil pa hidrofobne interakcije z S4. Na podlagi dobljenih podatkov so pričeli z optimizacijo spojine in dobili učinkovit inhibitor renina.

Slika 6: Peptidomimetik angotenzinogena

Slika 7: Prvi nizkomolekularni inhibitor

Slika 8: Mesta modifikacij na aliskirenu

4.1 Modifikacije P3 in P4 arilnega mesta Terciarna butilna skupina na mestu štiri (spojina št. 6) je prispevala k afiniteti čiste spojine, v prisotnosti plazme pa se je le ta zelo zmanjšala. Veliko lipofilno funkcionalno skupino so 10

zamenjali z manjšo, bolj polarno oksimetilno skupino. V poskusih s čisto spojino je bila afiniteta primerljiva z inhibitorjem s skupino t-Bu, v plazmi pa so zaznali njeno povečanje. Analiza strukture z rentgensko difrakcijo je pokazala, da nekateri inhibitorji, v nasprotju z ostalimi, kot je npr. CGP 38560, interagirajo tudi s specifičnim podžepom S3sp, ki je pravokoten na S3 žep renina. Na kisik na mestu tri so zato uvedli skupine, ki so bile bodisi H-donorji ali Hakceptorji. IC50 teh spojin se je, ne glede na to ali je bila na mestu štiri terciarna butilna ali oksimetilna skupina, močno povečal. Pri 4-piridinskem analogu se je afiniteta v plazmi zmanjšala. Iz dobljenih rezultatov so sklepali, da vodikova vez na tem mestu ni nujna. Kljub temu so v nadaljevanju na mesto 3 uvedli etrske substituente z različnim številom CH2 skupin. Pri teh spojinah so zaznali zvečanje afinitete. S primerjavo jakosti spojin št. 38 in 43, ki sta imeli enako velikost, so ugotovili pri spojini 43 veliko manjšo afiniteto. Iz tega so sklepali, da ima etrski kisik svoj prispevek k afiniteti, saj tvori H-vez s Try 14 v S3sp žepu. Ta stranska veriga se je izkazala za optimalno, kar se tiče njene dolžine in položaja distalnega etrnega kisika kot akceptorja vodikove vezi. Posledica te vezave je močna afiniteta in selektivnost za človeški renin.

Tabela 1: Modifikacije mesta P3 in P4

11

Tabela 2: Modifikacije mesta P3

4.2 Modifikacije dušika na stranski verigi N-butilno skupino na mestu P2` so zamenjali z nevtralnimi, bazičnimi in kislimi skupinami. Proučevali so tudi vpliv heteroarilnih skupin. Afiniteta je pri večini spojin v primerjavi s prvotno skupino ostala nespremenjena ali pa se je celo zmanjšala. Najmanjšo afiniteto so imeli aminski derivati. Če pa so slednjim dodali še hidroksilno skupino, se je afiniteta zmanjšala. Najboljše rezultate je imela amidna skupina, ki lahko tvori vodikovo vez z Arg 74, Gly34, Gln128 ali Thr295 preko vodnih molekul (W010 in W096). Na tem mestu je v angiotenzinogenu prisoten levcin, zato večji in lipofilni substituenti povečajo afiniteto. V stransko verigo so dali tudi hidroksilno skupino, ki pa na afiniteto ni imela vpliva, zato je niso obdržali. Dobili so spojino, ki je kazala najboljše rezultate tako v čisti obliki kot v plazmi.

Tabela 3: Modifikacije na dušiku v stranski verigi

12

Tabela 4: Modifikacije dušika na stranski verigi

Tabela 5: Modifikacije dušika na stranski verigi

Tabela 6: Modifikacije dušika na stranski verigi

13

4.3 Modifikacije P1' mesta na stranski verigi Metilno skupino na P1` so zamenjali z izopropilno skupino. Ta zamenjava na afiniteto ni imela učinka, podaljšal pa se je čas delovanja v preliminarnih testiranjih peroralne aplikacije. Dobljena spojina je aliskiren, majhna nepeptidna molekula, ki deluje kot mimetik prehodnega stanja. Renin inhibira preko interakcij z vodikovimi vezmi med aliskirenovo centralno hidroksilno skupino ter aminsko skupino z reninovima katalitičnima ostankoma Asp 32 in Asp 215.

Slika 9: Aliskiren

5 Vezava aliskirena na renin

Slika 10: Vezava aliskirena v aktivno mesto encima. Molekula aliskirena je prikazana z »ball and sticks« modelom. Z Sx so označeni predeli aktivnega mesta, na katere se veže aliskiren.

14

Slika 11: Človeški renin zaseden z aliskirenom. Vidno je, da aliskiren zaseda S3 do S2' območja enicma in zato blokira katalitično funkcijo encima.

Slika 12: Superpozicija aliskirena (vijolična) s peptidnim inhibitorjem CGP 38560A (zelena), kjer so vidne razlike v vezavi obeh substratov na renin.

Slika 13: Vezava aliskirena s Ser219. Encimsko vezana voda (W092) na vstopu v S3sp žep tvori mostično vodikovo vez med fenolnim kisikom aliskirena in OH skupino Ser219.

15

Slika 14: Vezava aliskirena na S1-S3 vezavno mesto renina ter interakcija metoksipropoksi stranske skupine aliskirena z S3sp žepom.

Slika 15: Interakcije α,α-diMe β-alanin karboksamida aliskirena (zelena barva) z S2' žepom. Na sliki je prikazana tudi n-butilna skupina starejših inhibitorjev.

Tabela 7: IC50 vrednost aliskirena za različne humane peptidaze (A) in IC50 aliskirena za renin v sesalskih predstavnikih (B).

16

6 Sintezna pot do aliskirena, prvega peroralnega inhibitorja renina OH

Br

Me3SiBr DKM, rt

LiHMDS/THF Od -75°C do 0°C

bromiranje

diastereoselektivno alkiliranje

1.n-BuLi/hex BnSh/THF 0°C

OH

2.LiAlH4

NBS Ph3P/ DKM, rt

redukcija

bromiranje

MeCN, 1 M HCl,

Br

BOC2O, DIPEA, DKM

n-BuLi/hex diastereoselektivno

Schöllkopfova šibka kisla hidroliza THF Odalkiliranje -75°C do -20°C in uvedbametoda zaščite

DIBAL/toluen -75°C

BnO

redukcija

Br

V razmerju

17

2(S):2(R) = 4:6 Mg, 1,2-dibromoetan/THF

Grignardovi reagenti

2,2 dimetoksi propan

+

p-TsOH/ DKM 24h, rt

5(S)

5(R)

uvedba zaščite

N-metilmorfolin-N-oksid

H2/Pd(C)

TPAP/ DKM, 30 min

oksidacija

THF, 15 min

odstranitev zaščite

CHO

KMnO4, Bu4N+Br-

COOH

Toluen –H2O, 48h, 0°C

oksidacija

H3C

CH3

H2 N

H2N

NH2 O

p-TsOH

18

HCl,

MeOH, rt

DEPC, Et3N/ DMF, rt

odstranite v zaščite

alkiliranje

4 M HCl

dioksan

odstranite v zaščite

x HCl

19

6.1 Komentar k sintezi Odkritje aliskirena, prvega peroralnega inhibitorja renina temelji na študiju številnih spojin, ki so izkazale manjšo učinkovitost inhibicije renina. Pri sintezi aliskirena izhajajo iz 2-benziloksi-4-hidroksimetil-1-metoksibenzena, katerega so bromirali s pomočjo trimetilsililbromida (Me3SiBr) v kloroformu pri sobni temperaturi. Ob dodatku 4-(R)-benzil-3-izovaleroil-oksazolidin-2-ona v prisotnosti baze litijevega heksametil disilazana (LiHMDS), ki odstrani kisel vodikov proton, diastereoselektivno uvedejo ustrezno substituirano benzilno skupino. Ob dodatku benzilmerkaptana v prisotnosti baze n-butillitija odstranijo substituiran oksazolidinon in nastane tioester, ki ga ob dodatku litijevega aluminijevega hidrida (LiAlH4) reducirajo do enantiomerno čistega alkohola. Zopet izvedejo bromiranje, tokrat s pomočjo N-bromosukcinimida (NBS) kot vira broma ob prisotnosti trifenilfosfina, ki veže kisik ob nastanku trifenilfosfin oksida. Nato po Shöllkopfovi metodi dodajo zaščiten vir aminokisline (2R)-2,5-dihidro-3,6-dimetoksi-2-izopropilpirazin v prisotnosti n-butillitija, da diastereoselektivno uvedejo aminokislino. S pomočjo 1 M HCl izvedejo šibko kislo hidrolizo in zaščitijo amino skupino z BOC zaščito. Diizobutilaluminijev hidrid (DIBAL) v toluenu pri znižani temperaturi reducira ester do aldehida. Odkrili so, da je učinkovitost inhibicije renina večja, če se substituent benziloksi na mestu 2 zamenja s 3-metoksi-propoksi. Sinteza je popolnoma identična, le da izhajamo iz spojine s takšnim substituentom na benzenu. Tako pripravljenemu aldehidu dodajo 2(S)-bromometil-3-metilbutil-benzil eter in magnezij, da najprej nastane Grignardov reagent. Nato poteče nukleofilna adicija in nastaneta dva produkta v razmerju 2(S):2(R) = 4:6. Ker ju ne morejo ločiti na silikagelu, dodajo 2,2-dimetoksi propan (pravzaprav zaščiten aceton) v prisotnosti paratoluensulfonske kisline (p-TsOH - tozilne kisline) kot kislinskega katalizatorja. Dobijo N,O zaščiten ketal v razmerju 5(S):5(R)=97:3, ki ga s pomočjo flash kromatografije ločijo da dobijo le 5(S) produkt. Benzilno zaščito odščitijo s pomočjo katalitskega hidrogeniranja s paladijem na ogljiku. Oksidacija poteče postopno, najprej s pomočjo tetrapropilamonijevega perrutenata (TPAP) ob prisotnosti N-metilmorfolin-N-oksida kot ko-kalizatorja do aldehida, ki ga nato oksidirajo s pomočjo kalijevega permanganata (KMnO4) v prisotnosti katalizatorja faznega prenosa tetrabutil amonijevega bromida (Bu4N+Br-) v toluenu in vodi in do kisline. Na tej stopnji so pripenjali vrsto različnih karbamoilov, v našem primeru se je za najbolj učinkovito izkazal 2-karbamoil-2-metil-propil, ki so ga uvedli s pomočjo DEPC – dietil ciano fosfonata ((EtO)2P(O)CN) kot aktivacijskega reagenta. Zaščito na OH in NH skupini odščitijo v dveh stopnjah-najprej s pomočjo paratoluensulfonske kisline v metanolu, ki da ustrezen karbamat, za zaključek pa še odstranijo BOC zaščito s pomočjo kislinske hidrolize s 4 M HCl v dioksanu. 20

6.2 Industijska sinteza aliskirena Pri sintezi aliskirena v industriji so uporabili pristop s sintoni – retrospektivno sintezo. Uporabljeni sintoni so podobni kot v zgoraj omenjeni sintezi, le z nekoliko modifikacijami. Sinton A je podoben enemu izmed vmesnih produktov v sintezi, sinton B je nekoliko večji, sinton C je popolnoma identičen.

Slika 16: Sintoni A, B in C

Sintone so pridobili na naslednje načine: •

Sinton A z enantioseletivnim selektivnim hidrogeniranjem kataliziranim z rodijem

•

sinton B s prašičjo jetrno esterazo katalizrano encimsko resolucijo racemnega estra in sinton C v eni stopnji izvedeno (one-pot) redukcijo nitrila in aminoliza estra. Nadaljna sinteza je sestavljena iz treh stopenj:

Najprej »združijo« sinton A s sintonom B v cross coupling reakciji katalizirani z nikljem. Nato združijo dva kiralna centra, ki sta v združenih sintonih A in B s preostalima dvema kiralnima centroma z visoko halolaktonizacijo. Za konec pa integrirajo sinton C z laktonsko aminolizo. Točen potek reakcije ni opisan, opaziti je le, da je uporabljenih precej novejših pristopov, katerih mehanizmi nam niso dostopni. Prikazan sintonski pristop je konvergenten, fleksibilen in bolj »eleganten« (z vidika sinteze) in najpomembneje, bolj zmožen rešiti problem dolgotrajne in drage sinteze aliskirena kot so jo odkrili znanstveniki. Vsak kemijski korak in vsaka od različnih kemičnih reakcij so bili podvrženi mnogim študijam in scale-up poskusom od miligramske do kilogramske skale. Takšna sinteza je bila tudi z ekonomskega vidika primernejša in opravičljiva za industrijsko proizvodnjo.

21

7 Zaključek Aliskiren se je izkazal kot zelo učinkovit peroralni inhibitor človeškega renina, katerega IC50 je 0.6 nM (pri in vitro poskusih v plazmi). Prav tako izkazuje visoko selektivnost za človeški renin s praktično ničnim inhibitornim učinkom na ostale proteaze. Razpolovni čas aliskirena je 24 ur, kar omogoča večjo komplianco bolnika ter tako tudi učinkovitost zdravljenja. Aliskiren v obliki monoterapije ne znižuje krvnega tlaka nič bolj učinkovito kot ostala zdravila, vendar se v kombinaciji z njimi krvni tlak zniža bolj in po končani terapiji se tudi počasneje zvišuje. Inhibitorji renina so odprli nove terapevtske možnosti za zdravljenje hipertenzije. Farmacevtska podjetja (Actelion in Speedel) so že napovedala prihod novih inhibitorjev renina. Speedel je predstavil podatke o treh spojinah iz dveh serij spojin. Dve izmed teh so v prvi fazi, ena pa v drugi fazi kliničnih testiranj.

22

8 Literatura 

R. Göschke et al. (2007). Novel 2,7-dialkyl-substituted 5(S)-amino-4(S)-hydroxy-8-

phenyl-octanecarboxamide transition state peptidomimetics are potent and orally active inhibitors of human renin. J. Med. Chem., 50, 4818-4831. 

C. Jensen, P. Harold, H. R. Brunner (2008). Aliskiren: the first renin inhibitor for clinical

treatment. Nature reviews drug discovery, Vol. 7 

T. Lemke, D. Williams. Foye’s principles of medicinal chemistry, 6th Ed, 741.



J. Maibaum et al. (2007). Structural modification of the P2’ Position of 2,7-dialkyl-

substituted 5(S)-amino-4(S)-hydroxy-8-phenyl-octanecarboxamides: The discovery of aliskiren, a potent nonpeptide human renin inhibitor active after once daily dosing in marmosets. J. Med. Chem., 50, 4832-4844. 

J. M. Wood et al. (2003). Structure-based design of aliskiren, a novel orally effective renin

inhibitor. Biochemical and Biophysical research communications, 308, 698-705.

23