Rosita - Metode Ekstraksi (review Materi Uts).pdf

FITOKIMIA 1

Tujuan perkuliahan  Mahasiswa dapat memahami definisi metabolit primer, sekunder, dan hubungannya secara kimia  Mahasiswa dapat memahami perbedaan antara ekstrak, fraksi, sub fraksi, maupun isolat.  Mahasiswa mampu memahami prinsip-prinsip ekstraksi dan isolasi beserta tujuannya  Mahasiswa mampu memahami faktor-faktor yang perlu dipertimbangkan dalam proses ekstraksi dan isolasi senyawa.  Mahasiswa dapat merancang metode untuk mengekstraksi dan mengisolasi senyawa-senyawa sederhana.

Agenda kuliah Pertemuan-1 Pertemuan 2-6

• Pendahuluan • Presentasi mahasiswa (8 kelompok)

Pertemuan-7

• Review materi oleh dosen

Pertemuan 8

• Ujian

Bahan bacaan

•

Sarker, S. (2012). Natural Products Isolation 3rd Edition. New Jersey, USA : Humana Press Inc.

•

Ikan, R. (1991). Natural Products A Laboratory Guide Second Edition. California, USA : Academic Press , Inc.

•

Harborne. (1973). Phytochemical Methods : A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. New York, USA : Chapman and Hall

•

Cannell. (1998). Natural Products Isolation. New Jersey, USA : Humana Press Inc.

•

Dewick, P. M. (2009). Medicinal Natural Products : A Biosyntethic Approach 3rd Edition. West Sussex United Kingdom: John Wiley & Sons, Inc.

•

Evans, WC. (2009). Trease & Evans Pharmacognosy 16th edition. London : Elsevier Ltd.

•

Fransworth, N.R. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of Pharmaceutical Science 22,3, 226-276.

Harbowy, ME; Balentine, DA. (1997). Tea Chemistry .Critical Reviews in Plant Sciences, 16(5):415-480

• Metabolit sekunder berasal dari metabolit primer yang melalui berbagai jalur biosintesis

Dewick, P. M. (2009). Medicinal Natural Products : A Biosyntethic Approach 3rd Edition. West Sussex United Kingdom: John Wiley & Sons, Inc.

Pembentukan C, GC, EGC, EC dari precursor Fenilalanin

•

Wu et al. (2014). De novo assembly and transcriptome characterization: novel insights into catechins biosynthesis in Camellia sinensis. BMC Plant Biology 201414:277

Obat kanker

Obat kanker

Taxol  obat kanker

Artemisinin  Obat malaria

Digoksin  obat jantung (kardiotonik)

Dewick, P. M. (2009). Medicinal Natural Products : A Biosyntethic Approach 3rd Edition. West Sussex United Kingdom: John Wiley & Sons, Inc.

Ekstraksi

Fraksinasi

Fraksi Ekstrak

Subfraksinasi

Purifikasi

Subfraksi

Isolat

Konvensional

Modern

• Pemilihan pelarut, lama proses, penggunaan panas menjadi faktor dominan. • Jenis : Ekstraksi panas (Sokhlet, refluks, dekokta, infusa), Ekstraksi dingin (Maserasi, perkolasi) • Modifikasi dan pengembangan dari metode konvensional. • Saat ini berkembang : Supercritical Fluid Extraction (SFE), Microwave Assisted Extraction (MAE), Ultrasonic Assisted Extraction, Ultrasonic Microwave Assisted Extraction (UMAE), Ionic liquid (IL), Natural Deep Eutectic Solvents (NADES)

De Monte et al. (2014). Modern extraction techniques and their impact on the pharmacological profile of Serenoa repens extracts for the treatment of lower urinary tract symptoms. BMC Urology : Pubmed Sarker, S. (2012). Natural Products Isolation 3rd Edition. New Jersey, USA : Humana Press Inc.

Sampel

Pelarut

Metode

• Ukuran partikel

• Selektivitas / polaritas

• Waktu

• Sifat senyawa (stabilitas terhadap panas)

• Toksisitas

• Suhu

• Volatilitas

• Penggunaan energi mekanik : pengadukan, sonikasi, gelombang mikro dll

• Perbandingan sampel : pelarut

Metode ekstraksi yang sesuai Cannell. (1998). Natural Products Isolation. New Jersey, USA : Humana Press Inc.

• Prinsip ekstraksi :

“Like dissolve like” • Senyawa akan terlarut pada pelarut yang dapat melarutkannya dengan baik. • Pertimbangkan : kepolaran, selektivitas, volatilitas, toksisitas

Sarker, S. (2012). Natural Products Isolation 3rd Edition. New Jersey, USA : Humana Press Inc.

Chemat, F; Strube, J. (2015). Green Extraction of Natural Products Theory and Practice. Germany : Wiley-VCH Verlag. Page : 190

• Penggantian pelarut – Suatu saat pasti terjadi kejenuhan pelarut, perlu dilakukan penggantian pelarut

• Perbandingan pelarut:linarut – Disebut juga dengan nisbah pelarut – Misalnya 1:10 (1 kg simplisia : 10 L etanol)

• Ukuran matriks (simplisia / sediaan)

• Merupakan sistem pemisahan yang terdiri dari dua fase cair yang terpisah/tidak bercampur. • Komponen terdistribusi dalam 2 fase, bergantung pada koefisien partisinya. • Istilah : – Rafinat : Pelarut yang mengandung zat – Ekstraktan : Pelarut yang digunakan untuk mengekstraksi

• Memiliki prinsip pemisahan “Like Dissolve Like”

• Peningkatan polaritas • Dapat diprediksi senyawa terlarut

• Lipid, Klorofil  nonpolar • Monoglikosida, alkaloid semi polar • Glikosida  polar

• Sarker, Natural Product Isolation pg 271

• Cannell, 1998

Lemak •Sering ikut tertarik saat melakukan ekstraksi dengan senyawa non polar/polartasya rendah. •Deteksi : TLC. Penampak bercak : uap iodin  bercak cokelat. •Ekstraksi lemak dengan petroleum eter atau n-heksan terlebih dahulu. Kromatografi kolom  elusi dengan PE/n-heksan.

Pigmen warna. •Paling umum : klorofil (daun), karoten (umbi), senyawa-senyawa xanthon. •Dapat dikurangi dengan menggunakan larutan timbal asetat 2-5% (reagen pengendap pigmen warna, klorofil, dan beberapa asam lemak)

Tanin •Sering menghasilkan “positif palsu” pada uji aktivitas enzimatik  tanin mengendapkan protein (enzim) yang diuji. •Dapat dikurangi/dihilangkan melalui pengendapan dengan larutan gelatin-NaCl (5% w/v NaCl dan 0.5% w/v gelatin),

Cannells, 1998

• Sarker, 2002

• Cannel, 1998. Natural Product Isolation pg 352

Cari metode-metode untuk memisahkan komponen pengganggu lainnya berdasarkan review artikel jurnal!

1. Komponen apa saja yang dapat mengganggu proses ekstraksi? 2. Cari perbandingan berbagai metode ekstraksi berdasarkan artikel jurnal/review!

Bioactive guided isolation Proses isolasi senyawa dipandu dengan uji aktivitas  ekstrak/fraksi teraktiflah yang dikembangkan Sarker, 2006

• Biasanya dimulai dengan proses fraksinasi  jumlah senyawa yang akan dipisahkan semakin sedikit • Tiap senyawa memiliki sifat yang berbeda-beda : kepolaran, keasamaan, kebasaan, ukuran partikel dll  memerlukan strategi khusus  sering baca artikel penelitian yang up to date • Isolasi merupakan sebuah proses pemisahan senyawa target dari senyawa lain yang tidak diinginkan  melalui proses panjang  tidak langsung berhasil dalam 1 kali tahapan. • Beberapa senyawa yang mudah diisolasi : piperin, capsaisin  merupakan senyawa “mayor” dalam tanaman tsb

Kromatografi Lapis Tipis

• Prinsip : adsorbsi • Disebut juga kromatografi planar  pada bidang datar

• Fase diam? Fase gerak? • Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal / jarak migrasi fase gerak setelah pengembangan.

Fase diam

Solut

Fase Gerak

Jenis KLT Tujuan • Analitik • Preparatif

Sistem • Fase normal • Fase balik

Tujuan • Kualitatif • Kuantitatif  densitometri

Joshi DD. 2012. Herbal Drugs and Fingerprints Evidence Based Herbal Drugs

Joshi DD. 2012. Herbal Drugs and Fingerprints Evidence Based Herbal Drugs

SILIKA GEL: SiOH, SiO2 

Sifat = polar



Jenis :

-

Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%)

-

Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati

-

Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif, yang berfluoresensi pada 254 nm

-

Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat) biasanya untuk kromatografi vakum.

-

Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator floresensi)

-

Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif & mengandung indikator floresensi)

Kromatografi kolom menggunakan silika yang mana? Kromatografi lapis tipis analitik? Kromatografi lapis tipis preparatif?

Alumina Al2O3 Kurang polar dibanding silika gel Almunina basa, netral, asam Alumina G, F, H, P Selulosa Tanah diatom

Apa pengaruh ukuran fase diam/adsorben yang digunakan terhadap resolusi dan waktu pemisahan? Jelaskan menggunakan logika dan rumus yang mendukung!

Kromatografi kertas Fase diamnya? Prinsip : partisi

Tidak bisa menggunakan H2SO4. Mengapa?

Penjenuhan bejana

Efek Penjenuhan plat pengembangan plat

Visualisasi hasil 1. Sinar UV : 254 dan 366 nm 2. Penampak bercak. • Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:

1. Permanen: Asam sulfat , ninhidrin, dragendorff 2. Sementara: Uap Iodium • Penampak Bercak kimia, berdasarkan spesifisitasnya: 1. Spesifik: Ninhidrin: untuk zat dengan atom N (protein, Alkaloid dll) 2. Umum: Uap Iodium, Asam sulfat (hampir semua zat)

• Joshi DD. 2012. Herbal Drugs and Fingerprints Evidence Based Herbal Drugs

•

Joshi DD. 2012. Herbal Drugs and Fingerprints Evidence Based Herbal Drugs

Sarker, 2006

Kromatografi kolom • Prinsip : campuran. Partisi dan adsorbsi. Partisi lebih berperan. • Ada pengaruh gravitasi. • Beberapa pemisahan menggunakan bantuan tekanan  kromatografi cair vakum (KCV)

Jenis elusi Elusi gradien • Menggunakan fase gerak dengan kepolaran yang meningkat.

Isokratik • Menggunakan fase gerak dengan kombinasi kepolaran yang sama

Pengemasan kolom Cara basah • Adsorben dicampur dengan fase gerak hingga menjadi bubur  dimasukkan ke dalam kolom. • Keuntungan? Kelemahan?

Cara kering • Adsorben dalam bentuk serbuk dimasukkan pelan-pelan ke dalam kolom, fase gerak (eluen) di masukkan dalam kolom. • Keuntungan? Kelemahan?

Pemasukan sampel

Cara basah.

Cara kering

Untuk sampel yang bagaimana?

• Untuk sampel yang bagaimana?

Bagaimana memindahkan sistem dari KLT ke KK?

•

Proses pemurnian senyawa di dalam larutan campuran atau proses substitusi satu jenis senyawa ionik dengan yang lain terjadi pada permukaan fase diam.

•

Fase diam merupakan suatu matriks yang kuat (rigid), yang permukaannya mempunyai muatan, dapat berupa muatan positif maupun negatif. Mekanisme pemisahan berdasarkan pada daya tarik elektrostatik.

•

Bila matriks padat tersebut mempunyai gugus fungsional yang bermuatan negatif seperti gugus sulfonat (SO3-), maka akan dapat berfungsi sebagai penukar kation. Sebaliknya, bila bermuatan positif, misalnya mempunyai gugus amin kuaterner (-N(CH)3+), maka akan dapat berfungsi sebagai penukar anion.

Ion cuplikan bersaing dengan ion fase gerak terhadap bagian ionik pada penukar ion resin (fase diam). Pemisahan ion sederhana berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan fase diam. Jika senyawa terlarut berinteraksi lemah dengan adanya ion fasa gerak, ion terlarut keluar awal pada kromatogram, sedangkan senyawa terlarut yang berinteraksi kuat dengan fase diam, berarti lebih kuat terikat dan keluar belakangan.

• Kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda • Pemisahan berdasarkan ukuran partikel. • Molekul kecil tertahan di pori, molekul besar terelusi terlebih dahulu. • Bisakah untuk memisahkan isomer?

• Metode yang paling umum untuk memurnikan senyawa organik padat. • Dalam teknik ini, senyawa padat murni dilarutkan dalam pelarut dan kemudian dibiarkan perlahan-lahan mengkristal  molekul-molekul dari senyawa lain akan terlarut dalam larutan  senyawa padat murni

Pengertian

Prinsip

Tujuan

• Teknik pemurnian atau pemisahan zat padat

• Perbedaan kelarutan antara zat yang dimurnikan dengan zat pencemarnya

•

• Proses pengendapan zat melalui penjenuhan larutan

•

• Dilakukan dengan cara: mengkristalkan kembali zat setelah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai

Memurnikan suatu zat/senyawa dengan membentuk suatu kristal dari larutan/solut pembawanya. Memisahkan suatu campuran tertentu dari larutan multikomponen sehingga didapatkan produk dalam bentuk kristal.

• Proses rekristalisasi bergantung suhu.

suhu meningkat, kelarutan senyawa dalam pelarut juga meningkat. Suhu larutan menurun, kelarutan gula dalam air juga menurun • Sebagai contoh, gula dapat larut lebih cepat dalam air yang sangat panas (tepat di bawah titik didih) daripada di air pada suhu kamar. Apa yang akan terjadi jika larutan pekat dari air panas dan gula dibiarkan dingin sampai suhu kamar? ketika suhu larutan menurun, kelarutan gula dalam air juga menurun, dan molekul gula akan mulai mengkristal. (Ini adalah bagaimana gula batu dibuat) • Untuk memahami proses rekristalisasi, kelarutan dari zat harus diperhatikan. Sering dinyatakan bahwa “like dissolves like” yaitu senyawa yang memiliki kepolaran/sifat yang sama dapat larut satu sama lain.

Sarker, 2006

Profil KLT •Pengembangan tunggal, KLT 2 D, pengembangan bertahap. •KLT densitometri  lihat jumlah peak yang muncul, %AUC

Titik leleh •Untuk isolat padat

Titik didih •Untuk isolat cair

Rotasi optik •Untuk senyawa aktif optik

HPLC •Lihat peak yang muncul, %AUC

Identifikasi

Elusidasi

• Identifikasi golongan senyawa  dengan penampak bercak spesifik.

• Dilakukan dengan bantuan spektrometer : IR, NMR (H dan C, NOESY, ROESY, HMBC, HMQC), MS, LC-MS.

• Menggunakan pembanding  jika senyawa yang ditemukan merupakan senyawa yang tidak baru (sudah ditemukan sebelumnya). Dibandingkan profil spektrum UV, nilai Rf (KLT), titik leleh, tR (HPLC) dll. • Baca data-data yang ada di literatur

• Pelajari prinsip-prinsip kerja dari spektrometer diatas

Informasi apakah yang didapatkan dari spektrofotometer UV, Spektrometer : IR, NMR (H dan C), dan MS ?

• Quercetin

• Quercetin

•

https://www.thermofisher.com/id/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/spectroscopyelemental-isotope-analysis-learning-center/spectroscopy-elemental-isotope-analysis-resource-library/nmr-techtalk/nmr-tech-talk-february-2015/nmr-spectrum-quercetin.html

•

https://www.researchgate.net/publication/307449263_Toxicity_and_physiological_effect_of_quercetin_on_generalist_ herbivore_Spodoptera_litura_Fab_and_a_non-target_earthworm_Eisenia_fetida_Savigny/figures?lo=1

Jelaskan tahap-tahap pada isolasi sampai penentuan struktur suatu senyawa dari simplisia tanaman!