Riki

ABSTRAK

TERAPI GEN : PENGARUH INJEKSI siRNA ANGIOTENSINOGEN TERHADAP TEKANAN DARAH TIKUS (Rattus norvegicus) JANTAN GALUR WISTAR Jessica R. Afendi Program Studi Magister Bioteknologi NIM : 21106009

Tekanan darah tinggi (hipertensi) pada manusia adalah salah satu faktor resiko terjadinya stroke, serangan jantung, gagal jantung, aneurisma arterial dan merupakan penyebab utama gagal jantung kronis. Tekanan darah tinggi dapat diturunkan dengan mengkonsumsi obat-obatan secara teratur sepanjang hidup penderita. Efek samping obat-obatan penurun tekanan darah cukup banyak dijumpai meskipun tidak selalu menjadi keluhan penderita. Terapi genetik dengan memanfaatkan siRNA (small interfering RNA) perlu dikembangkan untuk mempengaruhi regulasi tekanan darah dengan menurunkan tekanan darah tinggi ke tekanan darah normal. Salah satu protein di dalam plasma darah yang merupakan faktor regulasi tekanan darah adalah angiotensinogen, merupakan target terapi genetik pada penelitian ini. Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh siRNA-angiotensinogen yang diberikan secara intravena terhadap penurunan tekanan darah tikus. siRNA berupa untai ganda RNA yang berjumlah kurang dari 30 pasangan basa serta memiliki 2 nukleotida yang menggantung pada kedua ujung 3’. siRNA ini dirancang dengan menggunakan urutan mRNA-angiotensinogen Rattus norvegicus yang diperoleh dari NCBI (National Center for Biotechnology Information) dengan metode BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dan program dari Invitrogen (Block-iTTM RNAi Designer, www.rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress) untuk menghasilkan rancangan RNA komplemen yang spesifik terhadap mRNA gen target. Penelitian dilakukan terhadap 15 ekor tkus jantan normal dan 15 ekor tikus jantan hipertensi spontan (THS) (National Bioresource for the Rat, Kyoto University-Japan) dikelompokkan menjadi: i. Kontrol normal, ii. Normal + Plasebo, iii. Normal + 15 µg/kg berat badan (bb) SiRNA, iv. Normal + 25 µg/kg bb si RNA, v. Normal + 35 µg/kg bb siRNA, vi. Kontrol THS, vii. THS + Plasebo, viii. THS + 15 µg/kg bb SiRNA, ix. THS + 25 µg/kg bb si RNA, v. THS + 35 µg/kg bb siRNA. Pengukuran tekanan darah dilakukan secara langsung pada ekor tikus dengan menggunakan alat non-invasive blood pressure telemetry

(Bard Biomedical,Sentron) pada 2 jam, 24 jam, 72 jam, 120 jam, 168 jam setelah perlakuan berupa pengukuran tekanan sistol (TS) dan tekanan diastol (TD) dilakukan pada tiap individu tikus dilakukan sebanyak tiga (3) ulangan. Protein angiotensinogen diisolasi dari plasma darah setiap individu dalam kelompok 0 jam dan 168 jam setelah perlakuan untuk dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE. Hasil rancangan siRNA-angiotensinogen dari NCBI dan BLAST adalah

:

5’-UCGUCUUCCAGCACGACUUdTdT-3’

(sense)

dan

3’-

dTdTAGCAGAAGGUCGUGCUGAA-5’ (antisense), dengan target mRNA-angiotensinogen yang memiliki homologi terendah yaitu: 5’-UCGUCUUCCAGCACGACUU-3’.

Hasil

pengukuran tekanan darah tikus setelah diberi perlakuan siRNA adalah: Tekanan sistol (TS) pada tikus normal menunjukkan terjadi penurunan pada kelompok dengan perlakuan SiRNA (semua dosis), demikian juga pada kelompok THS, sementara tikus yang diberi plasebo tidak mengalami penurunan TS. Hal yang sama terjadi pada hasil pengukuran tekanan diastol (TD). Penurunan tekanan darah yang terjadi pada kelompok THS berkisar antara 21 – 53 % (TS) dan 17 – 58 % (TD) yang dibandingkan dengan kontrol hipertensi. Hasil analisis protein angiotensinogen dengan BM 51,981 KD dengan SDS-PAGE tidak bisa disimpulkan karena kualitas dan kuantitas protein pada gel yang kurang homogen.

ABSTRACT THE EFFECTS OF INJECTING ANGIOTENSINOGEN siRNA ON WISTAR STRAIN MALE RATS (Rattus norvegicus) BLOOD PRESSURE Hypertension in human is one of the risk factors to stroke, heart attack, heart failure and arterial aneurism. Hypertension can be lowered by consuming antihypertensive drugs. The side effects of the drugs are commonly found in sufferers although it has not always been a complain. The genetic therapy by using siRNA (small interfering RNA) needs to develop to influence blood pressure (BP) regulation by reducing BP to normotensive. One of the blood plasma protein which is the factor of BP regulation is angiotensinogen. It is the target of gene therapy of this research. The objective of the research is to know the effect of angiotensinogen siRNA injected intravenously on the decrease of rat BP. siRNA consists of double heliks of RNA, less than 30 nucleotides and has 2 overhang nucleotides on each 3’ end. siRNA was designed due to angiotensinogen mRNA sequence of Rattus norvegicus, obtained from NCBI (National Center of Biotechnology Information) by BLAST (Local Allignment

Search

Tool)

and

from

Invitrogen

(Block-iTTM

RNAi

Designer,

www.rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress) to get the specific siRNA design. The research was done on 15 male normotensive rats and 15 male spontaneously hypertensive rats (SHR) (National Bioresource for the Rat, Kyoto University-Japan). The rats were divided into : i. Normal control, ii. Normal+placebo, iii. Normal + 15 µg/kg body weight (bw) siRNA, iv. Normal + 25 µg/kg bw siRNA, v. Normal + 35 µg/kg bw siRNA, vi.SHR control, vii. SHR placebo, viii. SHR + 15 µg/kg bw siRNA, ix. SHR +25 µg/kg bw siRNA and x. SHR + 35 µg/kg bw siRNA. The measurement of BP was directly done via rat tail using non invasive blood pressure telemetry (Bard Biomedical, Sentron,USA) on 2 hours, 24 hours, 72 hours, 120 hours and 168 hours after treatment. The measurement resulted sistolic BP (SBP) and diastolic BP (DBP). Angiotensinogen was isolated from blood plasma of each individu before treatment and at seven days after treatment and analysed by using SDS

PAGE

method.

The

design

of

angiotensinogen

UCGUCUUCCAGCACGACUUdTdT-3’(sense) dTdTAGCAGAAGGUCGUGCUGAA-5’

(antisense)

and

siRNA

was

5’3’-

with mRNA target sequence 5’

UCGUCUUCCAGCACGACUU -3’. The results of BP measurement after siRNA injection indicated that SBP reduced in all treated normotensive rats (all dosages) and as well as all

treated SHR. The decrease of blood pressure of SHR that was calculated compared to the hypertensive control resulted in averagely 21 – 53 % (SBP) and 17 – 58 % (DBP) knock down. The result of protein analysis of angiotensinogen (51,891 KD) could not be concluded in regards of the unsatisfying quality and the quantity of the protein on the gel.