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UV-VIS Spectrophotometry A Brief Background to Spectrophotometry.

Electromagnetic Spectrum

El espectro electromagnético abarca desde la radiación gamma, con la menor longitud de onda (1 pm), hasta la radiación de baja frecuencia, con la mayor longitud de onda más allá de las ondas de radio convencionales (100 Mm o 100000 km). Los seres humanos solo pueden detectar directamente una porción muy pequeña de este espectro, ya que la percepción térmica del calor radiante es una sensibilidad a la radiación infrarroja (IR), y la vista está limitada al espectro VIS. El espectro es suavemente continuo y el etiquetado y la asignación de rangos separados se designan en gran medida como una cuestión de conveniencia (Figura 1). La espectrofotometría UV-VIS se refiere al rango de UV de 200-380 nm y al rango de VIS de 380-770 nm. Muchos instrumentos ofrecerán un rango ligeramente más amplio desde 190 nm en la región UV hasta 1100 nm en la región del infrarrojo cercano (NIR). Toda la radiación electromagnética viaja a la velocidad de la luz en un vacío (𝑐), que equivale a 3 × 108 m / s, la distancia entre dos picos a lo largo de la línea de viaje es la longitud de onda (𝜆) y el número de picos que pasan a punto por unidad de tiempo es la frecuencia (𝑣). La relación matemática entre estas tres cantidades se expresa utilizando: 𝑐=𝜆𝜈

Además, las leyes de la mecánica cuántica definen la energía de una sola partícula de luz, un fotón, como: 𝐸=ℎ𝜈

Donde 𝐸 es la energía de la radiación, y ℎ es la constante de Planck. Combinando estas dos ecuaciones se obtiene: 𝐸=ℎ𝑐/𝜆

Lo que demuestra que la energía es inversamente proporcional a la longitud de onda. Es decir, cuanto más corta es la longitud de onda, mayor es la energía. En la región visible es conveniente, y la convención moderna, definir la longitud de onda en nm (nanómetros), que es de 10-9 m. Sin embargo, la literatura histórica puede mostrar unidades alternativas, como milimicron (mμ) o Angstrom (Å). Estos se convierten simplemente utilizando: 1 𝑛𝑚=1 𝑚μ=10 Å

Radiation and the Atom

Es conveniente describir la radiación electromagnética como ondas. Sin embargo, para demostrar claramente las interacciones que conducen a una absorción específica, es útil considerar la radiación como paquetes discretos de energía, o cuantos, llamados fotones. Los fenómenos de absorbancia dependen de la estructura atómica, más específicamente de los orbitales atómicos que ocupan cada uno de los electrones de esos átomos y los niveles de energía asociados de esos orbitales. Los orbitales ocupados son finitos y están bien definidos, pero un electrón puede moverse a un orbital más energético, en un proceso llamado excitación de electrones, que proporciona una cantidad de energía igual a la diferencia de energía entre el estado de tierra y excitación. Los estados excitados son generalmente inestables y el electrón regresará rápidamente al estado fundamental, en un proceso denominado relajación de electrones, perdiendo la energía adquirida, descrita como emisión. Si bien el modelo aceptado de estructura atómica y molecular surgió del tratamiento mecánico de la onda de Schrödinger, es conveniente emplear el modelo más simple de Rutherford-Bohr para explicar los fenómenos electrónicos relacionados con la espectrofotometría. El modelo de Rutherford-Bohr define que un átomo tiene un número de capas de electrones, n1, n2, n3, etc., en las que los valores crecientes de n representan niveles de energía más altos y una mayor distancia desde el núcleo. Los electrones orbitan el núcleo en subcapas, designados s, p, d, y f, dentro de cada capa. Cada n-capa contiene una configuración de subcapas s, p, d, y f y cada subcapa puede alojar un máximo de dos electrones (Figura 2). No hay dos electrones que puedan tener energías idénticas, pero para ser concisos se pueden agrupar en función de la capa n que ocupan, 1s, 2s, 2p, 3s, 3p, 3d, etc. Al considerar los átomos de vapor de sodio, se puede demostrar el efecto de someter un átomo a una radiación apropiada. La excitación de un electrón, en la subcapa más externa de un átomo de sodio, por un fotón a 589, 330 o 285 nm promoverá su transición a diversos estados excitados; correspondiente a la energía más alta (longitud de onda más corta) de la radiación (Figura 3.). Radiation and the Molecule Electron Transitions:

Se puede considerar que los electrones en el átomo ocupan grupos de niveles de energía similares. El modelo molecular más complicado muestra los electrones de enlace asociados con más de un núcleo, y son particularmente susceptibles a las transiciones de subcapas.

Los electrones en cuestión pueden estar presentes en uno de los dos tipos de enlaces químicos; los enlaces sigma (σ) que resultan de la superposición de ssubcapa, o el enlace pi (π) generalmente más débil que resulta de la superposición de p-subcapa. Los enlaces químicos se forman mediante la superposición de capas atómicas que dan como resultado uno de los tres tipos de orbital molecular (MO); enlace (baja energía), anti retorno (alta energía) o no enlace. La excitación se asocia más típicamente con las transiciones inducidas en los electrones involucrados en la unión de los MO, y los átomos involucrados son generalmente aquellos que contienen los electrones ocupados por s y p. La excitación por la radiación UV-VIS da como resultado transiciones de electrones de los MO que se unen a sus MO relativos que responden, y de los MO que no se unen a cualquiera de los MO que se unen (Figura 4). La presencia de un doble enlace carbono-carbono en la molécula aumenta la probabilidad de enlaces π. Especialmente si se alternan con enlaces simples (enlaces dobles conjugados), donde uno de los MO de enlace se eleva en energía y el otro se reduce en relación con la energía de un enlace doble aislado. Lo mismo se aplica a los MOs antienlazantes. El efecto es aún mayor si el enlace contiene un átomo altamente electronegativo, como el nitrógeno, que atrae a los electrones con mayor fuerza. Como resultado, se aumenta la probabilidad de transición de las moléculas con enlaces π, la longitud de onda de la excitación máxima se mueve a una longitud de onda más larga, menos energética, y con frecuencia aumenta la probabilidad de transiciones a estados de excitación más altos. La probabilidad de que ocurra la transición está estrechamente relacionada con la estructura de MO. Si se conoce la composición de MO, la probabilidad de transición se puede calcular con certeza relativa y se puede hacer una estimación de la energía requerida para inducir la transición electrónica, lo que indica un valor aproximado para la capacidad de absorción molar de la especie. Vibration and Rotation: La estructura molecular interna puede responder a la energía

radiante además de las transiciones de electrones. En algunas moléculas, los electrones de enlace también tienen frecuencias de resonancia naturales, lo que da lugar a vibraciones moleculares, mientras que otras exhiben una rotación. Las diferencias en los niveles de energía asociados con la vibración y la rotación son mucho más pequeñas que aquellas involucradas en las transiciones de electrones, por lo tanto, la excitación resultante de estos fenómenos ocurrirá en longitudes de onda comparativamente más largas; La excitación vibratoria se asocia típicamente con la radiación IR, mientras que la excitación rotacional está asociada con la radiación de infrarrojo lejano o incluso la radiación de microondas. A pesar de que la excitación vibratoria y rotacional está asociada principalmente con regiones espectrales distintas de UV-VIS, tienen un efecto en las transiciones

de electrones dentro de este rango. El efecto principal es la "ampliación", es decir, la desviación de una región de absorción observada de su región predicha. Para la mayoría de las especies, especialmente en solución, la excitación no aparece como puntos de absorbancia nítidos en longitudes de onda altamente diferenciadas, sino más bien como bandas de absorbancia en un rango de longitudes de onda. Una razón principal es que la absorbancia en el nivel de transición de electrones está frecuentemente acompañada por estructuras más pequeñas en el nivel de vibración. De la misma manera, cada estructura vibratoria puede tener estructuras asociadas aún más pequeñas en el nivel de rotación, por lo que un espectro de absorbancia debido a las transiciones de electrones puede mostrar estructuras mucho más complejas de lo esperado. Specific Absorption

Cada electrón en una molécula tiene una energía de estado fundamental única, y como los distintos niveles a los que puede promoverse también son únicos, existe un conjunto finito y predecible de transiciones disponibles para los electrones en cualquier molécula dada. Cada transición, resultante de la absorción de un fotón, tendrá una relación directa y permanente entre la longitud de onda del fotón y la transición particular que estimula, conocida como absorción específica. Una gráfica de esos puntos a lo largo de la escala de longitud de onda, en la que una sustancia dada muestra "picos" o máximos de absorción, se denomina espectro de absorción (Figura 5). Un espectro de absorción de un compuesto es una característica física útil, tanto para el análisis cualitativo (identificación) como para el análisis cuantitativo (concentración). En su forma más simple, la absorción de longitudes de onda en el extremo rojo del espectro VIS y la reflexión de longitudes de onda no absorbidas harán que el compuesto aparezca verde / azul (Figura 6). El grupo químico que influye más fuertemente en la absorbancia de un compuesto se conoce como el cromóforo. Como se discutió anteriormente, los cromóforos que pueden ser excitados por la radiación UV-VIS involucran un enlace múltiple (como C = C, C = O o C≡N). Pueden conjugarse con otros grupos para formar cromóforos complejos, y los cromóforos, cada vez más complejos, mueven el pico de absorción asociado hacia longitudes de onda más largas y menos energéticas, y generalmente aumentan el grado de absorbancia en los máximos de absorción (Figura 7). La correlación entre la complejidad de la molécula y la detectabilidad mediante espectrofotometría UV-VIS se presta a la medición de compuestos orgánicos. Sin embargo, una amplia gama de compuestos inorgánicos se ofrece a métodos de análisis similares. Las especies con un átomo no metálico se unen al oxígeno en la región UV, y hay varios cromóforos inorgánicos de doble enlace que muestran picos de absorción característicos. En algunos casos, la medición de materiales inorgánicos puede requerir un proceso secundario, como la complejación con un

reactivo formador de color u oxidación. Por ejemplo, el óxido de manganeso (II) (MnO) se oxida a óxido de manganeso (VII) (Mn2O7), y se mide como el ion permanganato (MnO4-). Absorption and Concentration

Para propósitos analíticos, dos proposiciones principales definen las leyes de absorción de luz. La primera, la Ley de Lambert, establece que la proporción de luz incidente absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad de la luz (Lambert, 1760). Por lo tanto, capas sucesivas de igual grosor transmitirán una proporción igual de la energía incidente. Se define por la ecuación: 𝐼/𝐼0=𝑇

Donde 𝐼 es la intensidad de la luz transmitida, 𝐼0 es la intensidad de la luz incidente, y 𝑇 es la transmitancia. Es típico expresar la transmitancia como un porcentaje de la luz incidente, que se define de la siguiente manera: 𝐼/𝐼0×100=%𝑇

La segunda, la Ley de Beer, establece que la absorción de la luz es directamente proporcional tanto a la concentración del medio absorbente como al grosor de ese medio (Beer, 1852). Una combinación de las dos leyes, la Ley de Beer-Lambert, define la relación entre absorbancia y transmitancia. 𝐴=𝑙𝑜𝑔𝐼/𝐼0=𝑙𝑜𝑔100/𝑇=𝜀𝑐𝑙

Donde 𝐴 es la absorbancia, que no tiene unidades, aunque a menudo se hace referencia a ellas en unidades de absorbancia (AU). 𝜀 es el coeficiente de atenuación molar del medio (M-1cm-1), 𝑐 es la concentración molar (M) y l es la longitud de la trayectoria (cm). Es importante tener en cuenta que el coeficiente de atenuación molar es una función de la longitud de onda, por lo tanto, la ley de Beer-Lambert solo se aplica a una sola longitud de onda, también conocida como luz monocromática. En un escenario en el que tres muestras idénticas de 50% T se colocan secuencialmente en un haz de radiación incidente (100% T), la intensidad después de cada muestra se reducirá a la mitad (Figura 8). Las tres muestras pueden considerarse concentraciones conocidas de un medio absorbente y, por lo tanto, es posible trazar la transmisión contra la concentración (Figura 9). Esta gráfica seguirá una curva exponencial, y por lo tanto es de valor limitado.

Sin embargo, siempre que la luz sea monocromática y se cumpla la ley de BeerLambert, es posible definir el proceso en términos de unidades de absorbancia (AU). Para el mismo ejemplo, convertir% T en AU y luego trazar la absorbancia contra la concentración muestra una relación lineal (Figura 10). Haciendo que los resultados sean más convenientes para ser expresados en absorbancia, en lugar de transmisión, al medir muestras de concentración desconocida, dado que las curvas de calibración lineal están disponibles. Un uso alternativo de la relación lineal entre absorbancia y concentración, es calcular un factor para una molécula específica de interés que luego puede aplicarse a una muestra posterior de concentraciones desconocidas de esa misma molécula. Esto evita el proceso relativamente lento de una curva de calibración de trazado. Para calcular el factor (), se debe determinar la absorbancia de una concentración conocida de la molécula de interés. Estos dos parámetros se pueden usar como se detalla en la ecuación. 𝑘=𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛/𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒

Este factor se puede usar en la siguiente ecuación para calcular la concentración (𝑐) de la absorbancia (𝐴) de una muestra de concentración desconocida. 𝑐=𝑘×𝐴

Instrumentation

En su forma más simple, un espectrofotómetro tiene una fuente de luz, un monocromador, un compartimiento de muestra y un detector acoplado a un sistema de medición y lectura de resultados. Light Source: La luz UV generalmente se deriva de una lámpara de arco de deuterio

que proporciona una emisión de alta intensidad y continuidad adecuada en el rango de 190-380 nm. Se necesita una envoltura de cuarzo para transmitir las longitudes de onda más cortas de la radiación UV. La luz VIS normalmente es suministrada por una lámpara con base de tungsteno, con lámparas halógenas de tungsteno que tienen un rendimiento relativamente más alto en la región de cruce de UV-VIS (Figura 11). El límite de longitud de onda larga generalmente es el corte del vidrio o la envoltura de cuarzo de la lámpara, pero normalmente está más allá del límite visible útil a 900 nm. Las fuentes de luz de la lámpara de destello de xenón son una alternativa a los sistemas combinados de tungsteno y deuterio. Las lámparas de destello de xenón cubren la gama UV y VIS, y tienen una vida útil muy larga. Sin embargo, los

procesos adicionales para tener en cuenta los niveles más altos de luz parásita, así como menos energía en la región VIS, significa que los instrumentos están limitados a aplicaciones donde no se requieren especificaciones de instrumentos más altas. Los diodos emisores de luz (LED) tienen rangos de longitud de onda de aproximadamente 25 nm y siguen una distribución gaussiana. Como resultado, no son aptos para aplicaciones generales, pero pueden usarse para aplicaciones especializadas o como fuentes de referencia para calibrar contra fuentes de luz de rango de longitud de onda más amplio. Monochromator: El monocromador es responsable de producir un haz seleccionable

de radiación monocromática (longitud de onda única) desde el amplio rango de longitudes de onda que proporciona la fuente de luz. Forman parte de cualquier número o combinación de lentes, filtros, rejillas, espejos y ranuras (Figura 12). Existen dos métodos básicos de selección de longitud de onda; Filtros, y elementos dispersantes como las rejillas de difracción. Los filtros de vidrio coloreado o gelatina son la forma más simple de selección, pero tienen una utilidad limitada debido a que los filtros rentables están restringidos a la región VIS, además de tener una resolución de longitud de onda pobre: por lo general, no pueden aislar rangos de longitud de onda menores a 30 40 nm. Los filtros de interferencia más sofisticados pueden alcanzar resoluciones de longitud de onda de 10 nm o menos, pero siguen siendo inadecuados para la mayoría de las aplicaciones de laboratorio de rutina, a pesar del bajo costo y la simplicidad técnica. Más a menudo se usan en combinación con, y aguas arriba, de elementos dispersantes más sofisticados para eliminar regiones relativamente grandes de radiación no deseada. Las rejillas de difracción transmisivas tradicionales, una placa con múltiples ranuras paralelas, han sido reemplazadas por rejillas de difracción reflectantes, espejos con múltiples ranuras paralelas en su superficie, pero el término rejilla de difracción sin distinción es un lugar común. La serie de ranuras paralelas, denominadas líneas, en una rejilla de difracción reflectiva se pueden considerar espejos separados, y la luz difractada de las líneas vecinas se superponen entre sí, lo que resulta en una interferencia. Si las ondas difractadas están en fase, sufren interferencias constructivas que dan como resultado la amplificación. Aumentar la intensidad de la luz difractada. Si las ondas difractadas están en antifase, se someten a interferencias destructivas que se anulan entre sí, disminuyendo la intensidad de la luz dañada (Figura 13). Como diferentes longitudes de onda de la misma fuente de luz estarían en fase y en antifase en diferentes ángulos al haz incidente, su luz proyectada amplificada y cancelada ocurre en una posición diferente en una superficie proyectada, separando las longitudes de onda y creando un espectro.

El ángulo donde se producen los máximos se puede encontrar en la siguiente ecuación: 𝑑sin𝜃𝑚/𝜆=𝑚

Donde 𝜃𝑚 es el ángulo entre la luz difractada y el vector normal de la rejilla de difracción, la línea perpendicular al plano de la rejilla de difracción, 𝑑 es la distancia entre los centros de las líneas adyacentes, y m es un número entero que representa el modo de propagación de interés, Descrito como el orden. Cuando la luz incide normalmente en la rejilla, la luz reflejada tendrá un máximo en los ángulos 𝜃𝑚: 𝑑sin𝜃𝑚=𝑚𝜆

Para incorporar el ángulo de la radiación incidente (𝜃𝑖), en relación con el vector normal de la rejilla, la ecuación de la rejilla se convierte en: 𝑑(sin𝜃𝑖+𝑠𝑖𝑛 𝜃𝑚)=𝑚𝜆

Cuando se reorganiza para que el ángulo máximo del sujeto, la ecuación es: 𝜃𝑚=𝑎𝑟𝑐𝑠𝑖𝑛(𝑚𝜆/𝑑−𝑠𝑖𝑛𝜃𝑖)

Al rotar la rejilla en el haz incidente cambia su ángulo relativo, cambiando la longitud de onda de salida en un punto dado (𝜆), por lo tanto, proporciona la longitud de onda seleccionable de la luz. La luz que corresponde a la reflexión se llama orden cero. Los máximos de difracción que se producen en ángulos distintos del orden cero se representan mediante enteros distintos de cero, 1, 2, 3, etc., denominados primero, segundo, tercero, etcétera. Estas órdenes pueden ser tanto positivas como negativas, resultando en órdenes difractadas en ambos lados del haz de orden cero (Figura 14) Optical Geometry: Como las mediciones dependen de la relación (𝐼 / 𝐼0), se toma una

medición de referencia que crea una línea de base impartida por la solución de referencia antes de registrar la medición de la muestra. La intensidad de referencia (𝐼0) varía con la longitud de onda, debido a muchos factores como la energía de la fuente, la transmisión del monocromador, el ancho de la rendija y la respuesta del detector, por lo que es necesario crear una nueva línea de referencia de referencia para cada longitud de onda por separado en la que la medición de la muestra es hacerse. Los microprocesadores en instrumentos modernos han permitido que la instalación almacene múltiples líneas de base, establecidas en cada longitud de onda, permitiendo que las opciones superen este requisito. Como resultado, los instrumentos de haz único no tienen esta desventaja tradicional en comparación con los instrumentos de haz doble más caros (Figura 15).

La incorporación de lámparas de destello de xenón en un instrumento requiere una configuración de haz dividido. Esto se debe a que los destellos de alta intensidad no son de igual magnitud. Aproximadamente el 70% de la energía del monocromador se pasa a través de la muestra, y el resto va a un detector de referencia separado, lo que permite un medio para tener en cuenta las fluctuaciones en la energía. Esto estabiliza el sistema sin que se requieran elementos adicionales costosos. Para mayor precisión, la configuración óptica preferida es un sistema de doble haz. La operación de doble haz se logra dividiendo el haz, usando un espejo parcial o cortador, en dos trayectorias de luz separadas que se dirigen a través de las posiciones de referencia y de muestra. Las funciones dependientes de la longitud de onda del instrumento se reducen significativamente para brindar un mejor rendimiento, ya que el sistema es capaz de compensar las variaciones de la fuente de luz y del detector, así como los cambios en la línea de base de las muestras de prueba y de referencia que dependen del tiempo. Un aspecto adicional a una geometría óptica es la configuración óptica estándar o inversa. En una configuración óptica estándar, la muestra está corriente abajo del monocromador y, por lo tanto, recibe luz monocromática. En una configuración óptica inversa, la muestra está corriente arriba del monocromador y la luz transmitida se pasa a través del monocromador. Una pista visual de la configuración que emplea un instrumento es si el compartimiento de la muestra tiene una tapa o no, ya que la luz que viaja a través de un soporte de muestra de un sistema óptico inverso aún no se ha monocromado, por lo que la luz ambiental no afectará en gran medida la medición. Otro punto a tener en cuenta es que los sistemas ópticos inversos tienden a usarse con detectores de dispositivos de acoplamiento de fotodiodos (PDA) y dispositivos de carga acoplada (CCD). Entonces el elemento dispersivo está en una posición fija. Vale la pena señalar que las configuraciones ópticas del instrumento, definidas como doble y haz dividido, pueden diferir entre los fabricantes. Algunos describen que la doble viga tiene un solo detector, mientras que una viga dividida tiene dos, una para cada viga, otras describen que una viga doble tiene dos posiciones de soporte de celda, una para cada viga, mientras que una viga dividida tiene una posición de soporte de celda única. Sample Handling: La gran mayoría de las mediciones se realizan en muestras en

solución. Sin embargo, los gases y los sólidos también se pueden medir, pero la mayoría de los instrumentos están diseñados para acomodar cubetas estándar (también conocidas como células) en el compartimiento de la muestra. Las consideraciones importantes son el diseño, la construcción y el material de la cubeta que se utiliza para obtener mediciones precisas y confiables, al igual que la práctica del operador y la preparación de la muestra. Las cubetas generalmente están hechas de vidrio o cuarzo (sílice fundida) para las longitudes de onda VIS o UV-VIS de interés respectivamente. Sus uniones están

fusionadas en lugar de cementadas, para resistir la acción de los solventes, y están terminadas para asegurar que las ventanas ópticas (los lados a través de los cuales pasa el haz) estén altamente pulidas, paralelas entre sí y planas, y que la longitud del camino (distancia) Entre las superficies interiores de las ventanas) se presenta una desviación mínima. El soporte que ubica la cubeta en la viga debe garantizar un posicionamiento preciso y reproducible con respecto a la trayectoria de la viga a través de la cubeta. La cubeta más utilizada tiene una longitud de trayectoria de 10 mm, pero las longitudes de trayectoria más largas o más cortas son útiles si se miden concentraciones más altas o más bajas, respectivamente, que caen fuera del rango del instrumento en una longitud de trayectoria de 10 mm. Micro cubetas; para pequeños volúmenes de muestra, cubetas de gas y cubetas de flujo, así como versiones enmascaradas y sin máscara, están disponibles para extender la utilidad de un instrumento. El poliestireno desechable, que se usa en las aplicaciones VIS, y el metacrilato de metilmetilo (PMMA), que se usa en las aplicaciones UV-VIS, también están disponibles las cubetas. Preferido para evitar la contaminación cruzada, o en aplicaciones de alto rendimiento para eliminar los arduos procedimientos de lavado (Figura 16). Detectors: Hay dos tipos de detectores encontrados en los espectrofotómetros de

Biochrom. Son detectores de avalanchas de fotodiodos y matrices. El material utilizado para hacer un detector define sus propiedades. Los detectores basados en silicio son más comunes en la espectrofotometría UV-VIS, son sensibles a 1901100 nm. El fotodiodo de avalancha consiste en tiras estrechas de silicona dopada en polarización inversa. El material semiconductor dopado tipo P (positivo) conectado a un terminal negativo de una fuente eléctrica, y el material semiconductor dopado tipo N (negativo) conectado a un terminal positivo de una fuente eléctrica, recibe radiación a través de ellos. Esto causa la ionización por impacto, donde los electrones se mueven desde el ánodo de tipo n a los agujeros de electrones vacíos en el cátodo de tipo p, produciendo una fotocorriente que se puede detectar y medir. Tienen un rango de longitud de onda más amplio pero son menos sensibles. Al ser dispositivos de estado sólido, son mecánicamente robustos y se benefician de la reducción de la demanda eléctrica y la demanda del circuito de control (Figura 17). Los detectores de matrices incluyen una matriz de diodos fotográficos (PDA) y una matriz de dispositivos de carga acoplada (CCD). Son un conjunto de elementos fotodiodos individuales en forma lineal o matricial y se pueden montar de manera que el espectro completo se centre en un conjunto de tamaño apropiado. No se requiere un mecanismo de cambio de longitud de onda para que las mediciones de toma y visualización sean muy rápidas. La resolución está limitada por el tamaño físico de los elementos detectores individuales. Además, se requieren

consideraciones adicionales de geometría óptica para eliminar los efectos de la luz dispersa de los espectros de segundo orden. Measuring Systems: La última función de un espectrofotómetro es proporcionar al

usuario final un valor que sea proporcional a la absorción por una muestra en una longitud de onda determinada. Muchos fabricantes de instrumentos ofrecen dos variantes del mismo instrumento. Uno con pantallas digitales (LED o LCD) y el otro sin pantalla, que están diseñados para ser controlados y capturar los datos a través de un software adicional para PC. La mayoría de los instrumentos permiten a los usuarios finales definir parámetros específicos, como la longitud de onda, las unidades de salida y cualquier factor relevante (dilución, coeficiente molar y de masa, peso molecular). El instrumento aplicará los parámetros eliminando el requisito de cálculo manual. Además, a partir de esta información proporcionada por el usuario final, el instrumento seleccionará automáticamente la fuente de luz y los filtros necesarios para cumplir con los requisitos de la medición. A menudo se pueden introducir componentes adicionales, por ejemplo, los cambiadores automáticos de celdas, permiten cargar múltiples muestras a la vez, y con los parámetros proporcionados por el usuario final, se colocarán automáticamente en la trayectoria del haz y presentarán la salida apropiada contra la muestra relevante. Las rutinas secundarias, como la calibración y validación de instrumentos, a menudo están disponibles a pedido, ya sea a través de la pantalla a bordo del instrumento o mediante una interfaz con una PC externa. Good Operating Practice

Las buenas prácticas de laboratorio siempre deben aplicarse en la preparación de muestras para ensayos espectrofotométricos. La limpieza de todos los materiales y equipos, especialmente las cubetas de muestra, es imperativa, al igual que el pesaje y la precisión volumétrica. Las cubetas utilizadas para las mediciones de referencia y de muestra deben coincidir ópticamente siempre que sea posible. La mayoría de los fabricantes de cubetas pueden suministrar cubetas con características ópticas combinadas en un rango de longitud de onda definido. Cuando esto no sea factible, se debe hacer un gráfico de la absorbancia contra la concentración, la curva tendrá una intersección () que se puede aplicar como una corrección como se define a continuación. 𝐴=𝜀𝑙𝑐+𝑘

Se pueden hacer mediciones de muestras sucesivas utilizando la misma cubeta, pero se deben limpiar de manera efectiva, incluidos los lavados con disolventes de muestra y el secado.

Igualmente, importante es que la orientación de la cubeta en la trayectoria del haz se controle cuidadosamente para la continuidad de las superficies de la cubeta y la longitud del recorrido que influye en la medición. Varios procesos pueden contribuir a la atenuación total de la luz a medida que pasa a través de una cubeta y una muestra, incluidos la reflexión, la dispersión, la absorbancia y la fluorescencia (Figura 18). En la práctica, los efectos de la reflexión se limitan a niveles menos que significativos por las consideraciones descritas anteriormente, son el uso de cubetas de muestra de calidad, combinadas donde sea posible, y mediante el manejo cuidadoso de la muestra. Los efectos de la fluorescencia se pueden reducir por inhibición química o por filtros de corte apropiados. Las variaciones de temperatura también pueden ser una fuente de error, por lo tanto, se deben tomar nuevas medidas de referencia para actualizar la línea de base y contrarrestar cualquier cambio potencial durante períodos de tiempo significativos. Se debe hacer un esfuerzo para mantener el pH del solvente entre las mediciones. Como ejemplo, un cambio en el pH de ácido a básico resulta en un cambio estructural del rojo fenol de su forma amarilla a su forma roja. La redistribución relacionada de los electrones en las órbitas moleculares significa que el espectro de absorción de la muestra cambia con el cambio en el pH (Figura 19). Un último punto a tener en cuenta es que los componentes del tampón pueden impartir su propia absorbancia. Detergentes como IGEPAL, Triton x-100 y NP-9 exhiben absorbancia en la región UV. Como resultado, se recomiendan detergentes alternativos como Brij-35, CHAPS o Tween 20. También hay alternativas comerciales reducidas (hidrogenadas) de Triton x-100 que reportan una menor absorbancia UV. Donde no se pueda evitar su uso, las concentraciones deben mantenerse al mínimo para que la absorbancia impartida por el analito sea el componente más grande de la absorción total. Limitations of Beer-Lambert Law: La relación lineal entre la absorbancia y la

concentración se demuestra por la ley de Beer-Lambert. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias esta relación se rompe. Estas desviaciones se pueden agrupar en dos categorías. Las desviaciones debidas a las limitaciones de la ley en sí, y las desviaciones debidas a las características específicas de la muestra que se está analizando. La ley de Beer-Lambert es capaz de describir el comportamiento de absorción de soluciones con una concentración de solutos relativamente baja (<10 mM). Las desviaciones de la ley en sí ocurren cuando la concentración de la muestra es mayor, el analito puede comportarse de manera diferente debido a las interacciones con el disolvente y otras moléculas de soluto, formando potencialmente interacciones de enlaces de hidrógeno. Las moléculas de soluto forzadas a una gran proximidad como resultado de una alta concentración pueden

influir en la distribución de la carga de las moléculas vecinas, lo que podría resultar en un cambio en los máximos de absorción de longitud de onda. El tamaño de una molécula también afecta la desviación del grado. Las moléculas más grandes, con más transiciones de electrones disponibles, exhibirán una mayor absorbancia y, por lo tanto, mostrarán desviaciones incluso en concentraciones muy bajas. Por ejemplo, la capacidad de absorción del azul de metileno a 436 nm no cumple con la ley de Beer-Lambert, incluso en concentraciones tan bajas como 10 μM. Las altas concentraciones también pueden alterar el índice de refracción de una muestra (), lo que podría afectar el valor de absorbancia obtenido. Las correcciones a la ecuación que definen la ley de Beer-Lambert se han aplicado como se detalla en la ecuación. 𝐴 = 𝜀𝑐𝑙 (𝜂2 + 2)2

En la práctica, no deben requerirse correcciones por debajo de concentraciones de 10 mM. Para concluir, se pueden tomar medidas para que el usuario final minimice los efectos de las desviaciones de la muestra. La relación lineal entre la absorbancia y la concentración, tal como lo define la ley de Beer-Lambert, es válida entre 0,1 y 1,5 UA. Con una absorbancia muy baja, las mediciones pueden ser ruidosas y con una absorbancia mayor, ≥2,0 UA, pueden producirse desviaciones significativas de la linealidad, lo que resulta en una subestimación considerable de la concentración. Por lo tanto, para minimizar las desviaciones basadas en las limitaciones de la ley de Beer-Lambert, se recomienda mantener los datos en el rango de 0.1 a 1.0 UA. Si se requiere un ajuste para que la medición se encuentre dentro de un rango de absorbancia preferido, es mejor cambiar la longitud de la trayectoria de la muestra en lugar de la concentración de la muestra siempre que sea posible. Sources of Error

Para tener confianza en las mediciones obtenidas de un instrumento, es importante conocer las fuentes de error asociadas con ese instrumento y con la muestra en sí. Instrument Sources of Error: El ancho de banda espectral es la resolución de un

espectrofotómetro, que se describe como la capacidad de un instrumento para separar la luz en distintas regiones de longitud de onda finita y distinguirlas entre sí. Definido como el intervalo de longitud de onda en el que la radiación incidente nominal en la mitad de su valor máximo, o el ancho total en la mitad máxima (FWHM) (Figura 20). Generalmente está limitado por la pureza espectral y la intensidad de la luz monocromática y la sensibilidad del detector a esa longitud de onda.

El ancho de banda espectral en el detector es dictado por la ranura de salida del monocromador e influye tanto en la precisión fotométrica como en la longitud de onda. Los anchos de corte generalmente más estrechos reducirán el error, a condición de que el nivel de energía general siga siendo adecuado y los niveles de ruido electrónico no sean significativos. La mayoría de los instrumentos que utilizan rejillas de difracción aprovechan la dispersión lineal y tienen anchos de corte fijos. Los instrumentos de gama más alta pueden ofrecer anchos de banda variables, pero cada uno está definido por su propia ranura física, con un tamaño fijo que se intercambia en lugar uno del otro. Esto le da al usuario un medio de intercambiar energía para la resolución espectral (Figura 21). El ancho de banda natural es el FWHM del pico de absorbancia de un analito. La relación entre el ancho de banda espectral y natural es un factor determinante en una medición de absorción. A medida que aumenta esta relación, la desviación de la absorbancia observada de la absorbancia real será mayor. El ancho de banda natural de los compuestos más comúnmente encontrados en la espectrofotometría UV-VIS, particularmente las moléculas biológicas grandes, está dentro del rango de 5 a 50 nm, por lo que carecen de detalles espectrales finos. En general, una relación entre el ancho de banda espectral y natural de 0.1 o menos generará mediciones de absorbancia con una precisión del 99.5% o mejor. Para relaciones por encima de 0.1, la precisión se deteriora. Por lo tanto, un instrumento con un ancho de banda fijo de entre 3 y 5 nm es ideal para la medición de moléculas biológicas. Se requiere un ancho de banda más estrecho para las mediciones que involucran complejos de tierras raras y metales de transición, y especies orgánicas conjugadas, donde pueden estar presentes detalles finos críticos. El error del instrumento es generalmente luz extraviada. Sin embargo, los instrumentos de calidad medirán la absorbancia en su rango fotométrico con un alto grado de precisión. Aunque la ley de Beer-Lambert se sigue estrictamente cuando se aplica un haz incidente monocromático a una muestra, en la práctica no siempre se emite una sola longitud de onda desde el monocromador. En su lugar, se emite una pequeña gama de longitudes de onda continuas. Para una molécula que tiene coeficientes de atenuación molar ε ’y ε” en las longitudes de onda λ ’y λ” dentro del rango emitido, si ε ’y ε” son iguales, la absorbancia seguirá la linealidad de la ley de Beer-Lambert. Sin embargo, si ε ’y ε” y no es igual, la absorbancia se desviará de la linealidad, y además, cuanto mayor sea la diferencia entre ε ’y ε”, mayor será esta desviación. Es importante medir una muestra en el máximo de absorbancia de la molécula de interés. Como la absorbancia sigue una distribución gaussiana, y cuanto mayor sea la desviación de la longitud de onda correspondiente de los máximos de absorbancia, mayor será el rango de discrepancia en el valor de absorbancia obtenido (Figura 22). Por lo tanto, para evitar mediciones erróneas causadas por inexactitudes de longitud de onda, es recomendable medir en los máximos de absorbancia donde la tasa de cambio es mínima.

La luz perdida es quizás la causa de error más influyente. Se define como la radiación del instrumento que está fuera de la longitud de onda nominal seleccionada. El rango de longitud de onda de la luz parásita suele ser muy diferente de la banda de longitud de onda seleccionada. Se sabe que el haz incidente que sale del monocromador está contaminado con cantidades diminutas de radiación dispersa o dispersa, generalmente debido a la reflexión, refracción y difracción de las superficies ópticas, exacerbadas por partículas contaminantes y aberraciones. Su efecto es tal, que a medida que la absorbancia de la luz incidente aumenta con la concentración de analito, la luz incidente transmitida disminuye mientras que cualquier luz parásita permanece igual. Por lo tanto, cualquier luz detectada es una proporción creciente de la luz parásita. Lo que finalmente oculta un mayor aumento de la concentración de analito y se observa una desviación de la linealidad de la ley de Beer-Lambert (Figura 23). El error del instrumento que afecta la precisión de la absorbancia se debe principalmente al ruido inherente en el detector. En la práctica, el error es insignificante, excepto cuando la energía del haz incidente es baja, además, puede minimizarse mediante la elección del componente. Non-instrument Sources of Error: Los errores no instrumentales se derivan más

comúnmente de la naturaleza de la solución a examinar. Las características físicas, la temperatura y la concentración de las muestras deben tomarse en consideración, así como el potencial de compuestos adicionales que absorben la luz en la longitud de onda de interés. La absorbancia en estas condiciones es aditiva y ya no es posible realizar mediciones precisas del analito.

Ultraviolet – Visible Spectroscopy (UV) Absorción de radiación ultravioleta y visible. La absorción de radiación visible y ultravioleta (UV) está asociada con la excitación de los electrones, tanto en los átomos como en las moléculas, desde niveles de energía más bajos hasta niveles más altos. Dado que los niveles de energía de la materia están cuantificados, solo la luz con la cantidad precisa de energía puede causar que las transiciones de un nivel a otro sean absorbidas. Las posibles transiciones electrónicas que la luz podría causar son:

En cada caso posible, un electrón se excita desde un orbital completo (de baja energía, estado fundamental) a un orbital anti-enlace vacío (mayor energía, estado excitado). Cada longitud de onda de la luz tiene una energía particular asociada con ella. Si esa cantidad particular de energía es la adecuada para hacer una de estas transiciones electrónicas, entonces esa longitud de onda será absorbida. Cuanto mayor sea la brecha entre los niveles de energía, mayor será la energía requerida para promover el electrón a un nivel de energía más alto; dando como resultado una luz de mayor frecuencia, y por lo tanto una longitud de onda más corta, siendo absorbida. Todas las moléculas se someterán a excitación electrónica luego de la absorción de la luz, pero para la mayoría de las moléculas se requiere una radiación de muy alta energía (en el ultravioleta de vacío, <200 nm). En consecuencia, la absorción de luz en la región visible a la luz ultravioleta solo dará lugar a las siguientes transiciones:

Por lo tanto, para absorber la luz en la región de 200 a 800 nm (donde se miden los espectros), la molécula debe contener enlaces V o átomos con orbitales sin enlaces. Un orbital sin enlace es un par solitario en, digamos, oxígeno, nitrógeno o un halógeno. Los enlaces π están formados por la superposición lateral de los orbitales p medio llenos en los dos átomos de carbono de un enlace doble. Las dos formas rojas que se muestran en el diagrama a continuación para el eteno son parte del mismo orbital de enlace π. Ambos electrones se encuentran en el orbital de unión π resultante en el estado fundamental.

Las moléculas que contienen sistemas conjugados, es decir, alternando enlaces simples y dobles, tendrán sus electrones deslocalizados debido a la superposición de los orbitales p en los enlaces dobles. Esto se ilustra a continuación para buta 1,3-dieno.

El benceno es un ejemplo bien conocido de un sistema conjugado. La estructura de benceno de Kekulé consiste en enlaces dobles simples alternos que dan lugar al sistema V deslocalizado por encima y por debajo del plano de los enlaces simples carbono-carbono.

A medida que la cantidad de deslocalización en la molécula aumenta, la brecha de energía entre los orbitales de enlace π y los orbitales anti-enlace de π se reduce y, por lo tanto, se absorbe la luz de menor energía y de mayor longitud de onda.

Aunque el buta-1,3-dieno absorbe luz de una longitud de onda más larga que el eteno, todavía absorbe en la región UV y por lo tanto ambos compuestos son incoloros. Sin embargo, si la deslocalización se extiende aún más, la longitud de onda absorbida será eventualmente lo suficientemente larga como para estar en la región visible del espectro, dando como resultado un compuesto altamente coloreado. Un buen ejemplo de esto es el pigmento vegetal anaranjado, beta caroteno, que tiene 11 dobles enlaces carbono-carbono conjugados entre sí.

El betacaroteno se absorbe en toda la región UV, pero en especial en la región visible entre 400 y 500 nm, con un pico a 470 nm. Los grupos en una molécula que consisten en alternar enlaces simples y dobles (conjugación) y absorber la luz visible se conocen como cromóforos. Los complejos de metales de transición también son muy coloridos, lo que se debe a la división de los orbitales d cuando los ligandos se acercan y se unen al ion

metálico central. Algunos de los orbitales d ganan energía y otros pierden energía. La cantidad de división depende del ion metálico central y los ligandos. La diferencia de energía entre los nuevos niveles afecta la cantidad de energía que se absorberá cuando un electrón se promueva a un nivel más alto. La cantidad de energía gobernará el color de la luz que será absorbida.

Página de Internet Mientras que la interacción con la luz infrarroja hace que las moléculas experimenten transiciones vibratorias, la longitud de onda más corta, la radiación de mayor energía en el rango UV (200-400 nm) y visible (400-700 nm) del espectro electromagnético hace que muchas moléculas orgánicas experimenten transiciones electrónicas. Lo que esto significa es que cuando la energía de la luz UV o visible es absorbida por una molécula, uno de sus electrones salta de una energía más baja a un orbital molecular de energía más alta. Transiciones electrónicas Tomemos como primer ejemplo el caso simple del hidrógeno molecular, H 2. Como recordará de la sección 2.1A, el cuadro orbital molecular de la molécula de hidrógeno consiste en un enlace σ MO y un antídoto de mayor energía σ * MO. Cuando la molécula se encuentra en el estado fundamental, ambos electrones se emparejan en el orbital de enlace de energía más baja: este es el orbital molecular más ocupado (HOMO). El orbital σ * antienlazante, a su vez, es el orbital molecular más bajo desocupado (LUMO).

Si la molécula está expuesta a la luz de una longitud de onda con energía igual a Δ E, la brecha de energía HOMO-LUMO, esta longitud de onda se absorberá y la energía utilizada para golpear uno de los electrones del HOMO al LUMO, es decir, del σ al σ * orbital. Esto se conoce como una transición σ - σ * . Δ E para esta transición electrónica es 258 kcal / mol, correspondiente a la luz con una longitud de onda de 111 nm. Cuando una molécula con doble enlace como el eteno (etileno de nombre común) absorbe la luz, sufre una transición π - π *. Debido a que las brechas de energía

π - π * son más estrechas que las brechas σ - σ *, el eteno absorbe luz a 165 nm, una longitud de onda más larga que el hidrógeno molecular.

Las transiciones electrónicas tanto del hidrógeno molecular como del eteno son demasiado energéticas para ser registradas con precisión por espectrofotómetros UV estándar, que generalmente tienen un rango de 220 a 700 nm. Donde la espectroscopia UV-vis se vuelve útil para la mayoría de los químicos orgánicos y biológicos, se encuentra en el estudio de moléculas con π conjugadosistemas En estos grupos, la brecha de energía para las transiciones π - π * es menor que para los dobles enlaces aislados, y por lo tanto la longitud de onda absorbida es más larga. Las moléculas o partes de moléculas que absorben la luz fuertemente en la región UV-vis se llaman cromóforos. Revisemos la imagen de MO para el 1,3-butadieno, el sistema conjugado más simple. Recordemos que podemos sacar un diagrama que muestra los cuatro pi de MO que resultan de la combinación de los cuatro 2p z orbitales atómicos. Los dos orbitales inferiores están unidos, mientras que los dos orbitales superiores están antienlazados.

Comparando esta imagen de MO con la de eteno, nuestro ejemplo de enlace pi aislado, vemos que la brecha de energía HOMO-LUMO es de hecho más pequeña para el sistema conjugado. El 1,3-butadieno absorbe la luz UV con una longitud de onda de 217 nm.

A medida que los sistemas pi conjugados se hacen más grandes, la brecha de energía para una transición π - π * se vuelve cada vez más estrecha, y la longitud de onda de la luz absorbida se hace más larga. La absorbancia debida a la transición π - π * en 1,3,5-hexatrieno, por ejemplo, ocurre a 258 nm, que corresponde a un Δ E de 111 kcal / mol.

En moléculas con sistemas pi extendidos, la brecha de energía HOMO-LUMO se vuelve tan pequeña que la absorción se produce en la región visible en lugar de en la UV del espectro electromagnético. El betacaroteno, con su sistema de 11 enlaces dobles conjugados, absorbe la luz con longitudes de onda en la región azul del espectro visible, mientras que permite que se transmitan otras longitudes de onda visibles, principalmente aquellas en la región rojo-amarillo. Por eso las zanahorias son de color naranja.

El sistema pi conjugado en 4-metil-3-penten-2-ona da lugar a una fuerte absorbancia UV a 236 nm debido a una transición π - π *. Sin embargo, esta molécula también absorbe a 314 nm. Esta segunda absorbancia se debe a la transición de un electrón sin enlace (par solitario) en el oxígeno hasta un π * antienvejecimiento de MO:

Esto se conoce como una transición n - π * . Los MO no enlazantes (n) son más altos en energía que los orbitales p de enlace más altos, por lo que la brecha de energía para una n → π ∗ la transición es más pequeña que la de una transición π - π * y, por lo tanto, el pico n - π * tiene una longitud de onda más larga. En general, las transiciones n - π * son más débiles (absorben menos luz) que las debidas a las transiciones π - π *.

Review La espectroscopía de absorción UV-visible es quizás la técnica instrumental más simple y más comúnmente empleada para estudiar tanto la estabilidad del ADN como sus interacciones con pequeñas moléculas de ligando. El estudio de las interacciones fármaco-ADN podría llevarse a cabo mediante espectroscopia de absorción UV-Visible mediante el control de los cambios en las propiedades de absorción del fármaco o de las moléculas de ADN. Por lo general, las moléculas utilizadas como ligandos muestran una banda de absorción que se puede distinguir claramente en la región visible. Una manera fácil de determinar si hay alguna interacción entre el ADN y el fármaco es, por lo tanto, examinar el desplazamiento de la posición del máximo de esta banda desde cuando el ligando está libre en solución hasta cuando el ligando está unido al ADN. Se ha asumido que la magnitud de este cambio podría interpretarse como una indicación de la fuerza de la interacción entre la estructura del ADN y el ligando considerado [39, 42]. El espectro de absorción UV visible del ADN muestra una banda ancha (200–350 nm) en la región UV con una absorción máxima a 260 nm. Este máximo es una consecuencia de los grupos cromóforos en los restos purina (adenina y guanina) y pirimidina (citosina y timina) responsables de las transiciones electrónicas. La probabilidad de estas transiciones es alta y, por lo tanto, la capacidad de absorción molar (e) es del orden de 104 M? 1 cm? 1 [3]. Esta técnica permite determinar la concentración molar de ADN sobre la base de la medición del valor de absorbancia a 260 nm. Las relaciones de absorbancia (A260 / A280 y A260 / A230) también pueden describir la pureza del ADN. Esta relación debe estar en el rango de 1.8 a 1.9 para garantizar que el ADN esté suficientemente libre de proteínas [43]. Los cambios leves en el máximo de absorción, así como la absorbencia molar pueden ocurrir con las variaciones en el pH o la fuerza iónica de los medios. Las interacciones entre el fármaco y el ADN se pueden estudiar comparando los espectros de absorción UV-Visible del fármaco libre y los complejos de ADNfármaco, que suelen ser diferentes. Los compuestos que se unen con el ADN a través de la intercalación generalmente dan como resultado hipocromismo y batocromismo (desplazamiento al rojo). Debido al modo de intercalación que implica una interacción de apilamiento entre un cromóforo aromático y el par de bases del ADN, la extensión del hipocromismo suele ser compatible con la fuerza de la interacción intercalativa [44]. Se espera que la fuerza de esta interacción electrónica disminuya a medida que disminuye el cubo de la distancia entre el cromóforo y las bases de ADN. Al disminuir la distancia entre el compuesto intercalado (fármaco) y las bases de ADN, el hipocromismo tiene lugar aparentemente. Por lo tanto, esto es consistente con la combinación de compuestos p electrones y p electrones de bases de ADN. En consecuencia, el nivel de energía de la p– p? Disminuye la transición

electrónica, lo que provoca un desplazamiento al rojo. Esto contribuye al efecto hipocrómico descrito anteriormente [45,46]. En caso de atracción electrostática entre el compuesto y el ADN, se observa un efecto hipercrómico que refleja los cambios correspondientes del ADN en su conformación y estructura después de que haya ocurrido la interacción complejoADN. El efecto hipercromático es el aumento sobresaliente de la absorbancia del ADN tras la desnaturalización. Las dos cadenas de ADN se mantienen juntas principalmente por las interacciones de apilamiento, los enlaces de hidrógeno y el efecto hidrófobo entre las bases complementarias. El enlace de hidrógeno limita la resonancia del anillo aromático, por lo que la absorbancia de la muestra también está limitada. Cuando la doble hélice del ADN se trata con agentes desnaturalizantes, se interrumpe la fuerza de interacción que mantiene la doble estructura helicoidal. La doble hélice se separa en dos cadenas simples que están en la conformación en espiral aleatoria. En este momento, la interacción de la base base se reducirá, lo que aumentará la absorbancia UV de la solución de ADN porque muchas bases están en forma libre y no forman enlaces de hidrógeno con bases complementarias. Como resultado, la absorbancia para el ADN monocatenario será 40% más alta que la del ADN bicatenario a la misma concentración. Además, el efecto hipercromático se debe principalmente a la presencia de cationes cargados que se unen al ADN a través de la atracción electrostática al grupo fosfato del esqueleto del ADN y, por lo tanto, causan una contracción y un daño general a la estructura secundaria del ADN [47]. El efecto hipercromático también puede atribuirse al contacto externo (unión electrostática [48]) o al desenrollamiento parcial de la estructura de hélice del ADN, exponiendo más bases del ADN [49]. Si hay una interacción más débil, solo se observan efectos hipocrómicos o hipercrómicos sin cambios significativos de los cambios en los perfiles espectrales [3,50]. Según la variación en la absorbancia, la constante de unión intrínseca / constante de asociación (K) del fármaco con el ADN se puede determinar de acuerdo con la ecuación de Benesi-Hildebrand [43]:

A medida que los sistemas pi conjugados se hacen más grandes, la brecha de energía para una transición π - π * se vuelve cada vez más estrecha, y la longitud de onda de la luz absorbida se hace más larga. La absorbancia debida a la transición π - π * en 1,3,5-hexatrieno, por ejemplo, ocurre a 258 nm, que corresponde a un Δ E de 111 kcal / mol.

La banda de 426 nm es la más apropiada a seguir debido a que el ADN no tiene ninguna absorbancia en esta región y los cambios en los espectros de absorción de tartrazina luego de la adición de ADN se pueden monitorear fácilmente.

Tras la complejación con ADN, el espectro de tartrazina mostró un cambio hipocrómico de alrededor del 15% sin ningún cambio en la posición de pico. Dichos cambios espectrales se asocian generalmente con una superposición íntima de la nube de electrones π del resto aromático del colorante y los pares de bases de ADN. El espectro de absorción de tartrazina en la región de 200 – 550 nm tuvo señales bien definidas, una con un máximo de 258 nm y otra con un máximo de 426 nm (Figura 4), correspondiente al color absorbido y emitido. La banda de 426 nm es la más apropiada a seguir debido a que el ADN no tiene ninguna absorbancia en esta región y los cambios en los espectros de absorción de tartrazina luego de la adición de ADN se pueden monitorear fácilmente.

Como la molécula posee dobles enlaces y anillos aromáticos la brecha de energía HOMO-LUMO se vuelve tan pequeña que la absorción se produce en la región visible en lugar de en la UV del espectro electromagnético. El betacaroteno, con su sistema de 11 enlaces dobles conjugados, absorbe la luz con longitudes de onda en la región azul del espectro visible, mientras que permite que se transmitan otras longitudes de onda visibles, principalmente aquellas en la región rojoamarillo. Por eso las zanahorias son de color naranja El color característico de los colorantes azoicos se caracterizan por un grupo cromóforo específico (-N = N-) o azo enlace, el cual deriva de un sistema conjugado que facilita la deslocalización de electrones pi, dando lugar a la absorción de energía en longitudes de onda selectivas en el espectro visible, esto permite la síntesis de un gran número de colorantes azoicos, de gran intensidad y variedad de color Debido a que la molécula es un cromóforo específico (-N=N-), el cuál deriva de un sistema conjugado que facilita la deslocalización de electrones π. La brecha de energía para una transición π - π * se vuelve cada vez más estrecha, y la longitud de onda de la luz absorbida se hace más larga,dando como resultado un espectro en la región visible.

El espectro de absorción de tartrazina en la región de 200 – 550 nm tuvo señales bien definidas, una con un máximo de 258 nm y otra con un máximo de 426 nm (Figura 4). La banda de 426 nm es la más apropiada a seguir debido a que el ADN no tiene ninguna absorbancia en esta región y los cambios en los espectros de absorción de tartrazina luego de la adición de ADN se pueden monitorear fácilmente. En la figura 7A, observamos claramente que hay un solapamiento entre ADN y TZ a los 258 nm, aumentando significativamente la absorbancia. En la figura 7B (imagen amplificada en 426 nm), se observa que la absorbancia de la interacción disminuye con respecto a la señal de la molécula libre, produciendo un claro efecto hipocrómico. Además, no hay aparición de bandas nuevas, ni tampoco corrimientos hacia el azul (efecto hipsocrómico) o hacia el rojo (efecto batocrómico), dichos cambios espectrales suelen asociarse con una superposición íntima de la nube de electrones π del resto aromático del colorante y los pares bases de ADN6. La banda de 426 nm es la más apropiada a seguir debido a que el ADN no tiene ninguna absorbancia en esta región y los cambios en los espectros de absorción de tartrazina luego de la adición de ADN se pueden monitorear fácilmente.

Ácido sulfanílico (paperKinetic, mechanistic and spectral studies for the oxidation of sulfanilic acid by alkaline hexacyanoferrate(III)) El ácido sulfanílico (ácido p-aminobencenosulfónico) (SAA) es un compuesto importante e interesante que encuentra varias aplicaciones en la síntesis de colorantes orgánicos.6 La amida del ácido sulfanílico (sulfanilamida) y ciertas amidas sustituidas relacionadas tienen una importancia médica considerable Como las drogas sulfa. Aunque han sido suplantados en gran medida por los antibióticos como la penicilina, la terramicina, la cloromicetina y la aureomicina, los medicamentos a base de sulfa todavía tienen sus usos médicos, y constituyen una parte considerable de la producción de la industria farmacéutica. Una vez ingerida la TZ se metaboliza por enzimas que están en el estómago a metabolitos de fácil absorción. Estos metabolitos son principalmente aminas aromáticas, donde la mayoría de estas moléculas presentan un riesgo carcinogénico y/o mutagénico10. En el caso de TZ, su principal metabolito es el

ácido sulfanílico (SA) (Fig. 2). Este ácido es un sólido cristalino incoloro, inodoro, que tiende a tener un aspecto grisáceo debido a la oxidación atmosférica.

Su metabolito, el ácido sulfanílico (ácido p-aminobencenosulfónico) (SA) es un compuesto sólido cristalino, que tiende a tornarse grisáceo por la oxidación del medio ambiente. Este metabolito es de importancia debido a que es empleado en la síntesis para la obtención de colorantes orgánicos mediante el proceso de diazotacion. Es de importancia debido a sus aplicaciones en la síntesis de colorantes orgánicos. Mediante el procedimiento de diazotación, es empleado en la obtención de colorantes, como es el caso de la tartrazina.

importante e interesante que encuentra varias aplicaciones en la síntesis de colorantes orgánicos. El ácido sulfanílico es un componente sólido cristalino que tiende a tornarse grisáceo por la oxidación del medio ambiente

mediante el procedimiento de diazotación, es empleado en la obtención de colorantes