Resume Jurnal.pdf

REVIEW JURNAL “Creation of a nanoformulated cabotegravir prodrug with improved antiretroviral profiles”

Disusun untuk memenuhi tugas mata sistem penghantaran obat

Disusun oleh :

Nama

: Siti Horrimatul fhaturani

NIM

:152210101064

Kelas/Angkatan

: B / 2015

Dosen Pengampu

Eka Dedy Irawan, S.Si., M.Sc., Apt

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2018

I. Pendahuluan Setelah penemuan virus HIV-1 pada tahun 1983, pengembangan diagnosa dan perawatan yang efektif mengenai virus ini mengalami kemajuan yang luar biasa. Terapi antiretroviral (ART) meupakan terapi yang efektif mengurangi morbiditas dan meningkatkan kualitas hidup pasien. Namun, resistensi HIV-1, toksisitas obat, faktor ekonomi, sosial dan psikologi serta kepatuhan pasien yang buruk dapat menghambat keefektifan terapi. Untuk meningkatkan kepatuhan terhadap ART yaitu dapat menggunakan obat antiretroviral parenteral jangka panjang (long-acting parenteral (LAP)). Salah satu obat yang digunakan yaitu Cabotegravir merupakan inhibitor integrase yang sangat kuat, dengan waktu paruh hingga 54 hari, memungkinkan untuk rute administrasi parenteral yang diberikan setiap bulan. Meskipun profil yang sangat baik, dosis volume tinggi, reaksi di tempat suntikan dan konsentrasi obat dalam cairan tubuh yang rendah mempengaruhi penggunaan bagi orang yang rentan maupun orang yang telah terinfeksi virus ini. Untuk

meningkatkan

profil

farmakokinetik

ARV

(PK)

dan

biodistribusi(BD). Modifikasi dalam struktur ARV dan platform pengiriman dapat memfasilitasi pembentukan depot obat dan penargetan limfoid dan memiliki potensi untuk lebih baik dalam menembus pertahanan HIV, dosis obat yang lebih rendah, dan mengurangi toksisitas sistemik . Penelitian ini merancang prodrug nanoformulated CAB, yang bertujuan meningkatkan lipofilisitas obat, hidrofobik, dan untuk meningkatkan kemampuan obat dalam menembus pertahanan virus serta mempertahankan konsentrasi obat dalam plasma tetap tinggi. II. Material & Metode 2.1 Material CAB dan CAB LAP (200 mg / mL), Myristoyl chloride, poloxamer 407 (P407), N, N-diisopropillethilamina (DIEA), dimethylformamide (DMF), 1-oktal,

ciprofloxacin,

paraformaldehyde

(PFA),

dan

3,30-

diaminobenzidine (DAB). Dulbecco Dimodifikasi Eagle's Medium (DMEM). Serum manusia yang yang tidak aktif. Penghitung sel kit-8 (CCK-8). Gentamisin, HPLC grade asetonitril (ACN), HPLC grade

metanol, dan Air Optima LC / MS. FITC mouse anti-human CD45, Alexa Fluor 700 mouse antihuman CD3, APC mouse anti-human CD4, dan antihuman mouse BV421 CD8. Monoclonal tikus anti-manusia HIV-1p24 (klon Kal-1), monoklonal tikus antigen leukosit manusia (HLA-DR; klon CR3 / 43), dan anti-mouse EnVision+ yang terkompensasi HRPterkonjugasi sekunder 2.2 Sintesis Myristoyl CAB (MCAB) Sintesis MCAB dilakukan sesuai dengan skema ditunjukkan pada Fig.1A 2.3 Karakterisasi fisikakimia MCAB Karekterisasi MCAB menggunakan resonansi magnetik nuklir (1H NMR) dan tetrametilsilan sebagai standar internal. Dilakukan juga analisis Transformasi Fourier inframerah spektroskopi (FT-IR) dan analisis komparatif kristalografi CAB dan MCAB dengan bubuk X-ray difraksi (XRD). 2.4 Uji kelarutan Kelarutan CAB dan MCAB dalam air dan 1-oktanol ditentukan dengan menambahkan kelebihan obat ke setiap larutan pada suhu kamar kemudian dicampur selama 24 jam. Sampel disentrifugasi pada 20.000 x g selama 10 menit untuk obat pelet yang tidak larut. Supernatan mengandung obat yang dilarutkan dikeringkan dengan vakum kemudian didispersikan kembali dalam metanol untuk pengukuran konsentrasi obat menggunakan Sistem HClass ultra performance liquid chromatography (UPLC) dengan detektor TUV dan didukung dengan 3 software. Kandungan obat dikuantitatifkan dengan perbandingan puncak daerah dengan standar yang diketahui . 2.5 Pembuatan dan karakterisasi nanoformulasi MCAB (NMCAB) NMCAB dan nanoformulated CAB (NCAB) diproduksi menggunakan alat homogenisasi bertekanan tinggi. Secara singkat, MCAB atau CAB (5% b / v) dilarutkan dalam larutan P407 (0,5% b / v dalam air bebas endotoksin) selama 16 jam pada suhu kamar diikuti oleh homogenisasi pada 20.000 psi sampai ukuran partikel yang diinginkan sekitar 300 nm tercapai. karakterisasi nanoformulasi MCAB (NMCAB) meliputi pengukuran

diameter efektif (Deff), indeks polidispersitas (PdI), z-potensial, morfologi partikel, stabilitas, efisiensi pembebanan dan enkapsulasi obat. 2.6 Model sel untuk menilai aktivitas antiretroviral Percobaan ini menggunakan derivat makrofag monosit (MDM) yang dipreparasi sedemikian rupa dan mengalami perlakuan dengan berbagai konsentrasi (0,06-1000 nM) CAB atau MCAB asli dan diikuti dengan pemberian HIV-1ADA . Untuk menentukan aktivitas antiretroviral dari nanoformulasi, MDM dirawat dengan NMCAB, CAB LAP, atau NCAB mengandung 100 mM obat selama 8 jam, diikuti oleh 3x pencuciian menggunakan PBS untuk menghilangkan ekstraseluler obat. Ekspresi protein dinilai oleh immunocytochemistry. 2.7 Transmisi mikroskopi elektron (TEM) Morfologi makrofag dengan nanoformulasi dicitrakan oleh TEM. 2.8 Farmakokinetik (PK) dan biodistribusi (BD) NMCAB pada tikus BALB/cJ Tikus jantan BALB / cJ diberikan dosis intramuskular dengan NMCAB atau CAB LAP 45 mg setara CAB, diikuti oleh pengumpulan darah mingguan dalam tabung heparin melalui perdarahan pipi. 2.9 PK NMCAB di rhesus monyet Penelitian ini menggunakan dua monyet jantan Cina dianestesi dengan ketamine 10 mg / kg dan disuntikkan intramuskular dengan NMCAB dan darahnya diambil untuk pengukuran profil darah lengkap pada interval waktu tertentu. 2.10 Analisis parameter PK Analisis PK non-kompartemen untuk plasma CAB dilakukan menggunakan WinNonlin-5.1 pada kedua hewan coba 2.11 Studi pembatasan virus pada limfosit dewasa manusia Tikus jantan yang berusia 6-8 minggu disuntikkan secara intramuskular dengan NMCAB atau CAB LAP pada 45 mg setara CAB / kg yang kemudian disuntiikan dengan HIV-1ADA . Setelah menjalani perlakuan sedemikian rupa lalu pada akhir perlakuan diukur kadar CD45, CD3, CD4 dan CD8 menggunakan analisis flow cytometry.

2.12 Statistik Untuk semua penelitian in vitro, data disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi (SD), dan eksperimen dilakukan menggunakan minimum tiga ulangan yang berbeda secara biologis. Untuk penelitian in vivo, data adalah disajikan sebagai rata-rata ± standard error of mean (SEM). Untuk perbandingan dua kelompok, Student's t-test (two-tailed) digunakan. Untuk perbandingan antara tiga kelompok digunakan one way ANOVA diikuti oleh Tukey atau Dunnett T3 post hoc test III. Hasil 3.1 Sintesis dan Karakterisasi MCAB Sintesis MCAB dibuat dari sebuah rantai asam lemak karbon-empat yang dimodifikasi dari CAB dengan hasil akhir 85%. Struktur MCAB ditandai oleh 1H NMR dan spektrum FT-IR dan dibandingkan dengan CAB seperti yang ditunjukkan pada Gambar. S1 dan Gambar. 1B. Analisis kristalografi komparatif dari CAB dan MCAB oleh XRD mengungkapkan kristal yang lebih seragam di MCAB (Gambar 1C). Myristoylation mengurangi kelarutan air dari 31,9 ± 14,4 mg / mL (CAB) menjadi 5,6 ± 1,8 mg / mL (MCAB), dan meningkat kelarutan dalam 1-oktanol sebesar 30 kali lipat dari 44,4 ± 1,3 mg / mL (CAB) menjadi 1366,5 ± 27,5 mg / mL (MCAB) (Gambar 1D). Pengukuran aktivitas HIV RT menunjukkan bahwa IC50 dari MCAB dan CAB terhadap HIV-1ADA di MDM sebanding (Gambar 1E), menunjukkan bahwa modifikasi kimia CAB tidak mengubah aktivitas antiretroviral. 3.2 Nanoformulasi MCAB (NMCAB) NMCAB

berhasil

diproduksi

oleh

homogenisasi

tekanan

tinggi

menggunakan rasio obat untuk polimer 10: 1 (b / b). NMCAB dan NCAB sebanding dalam ukuran partikel (318 ± 25 dan 315 ± 26 nm masingmasing) dengan PdI <0,3 dan muatan permukaan negatif. CAB LAP menunjukkan ukuran 257 ± 6 nm, dan PdI dan z-potensial serupa dengan NMCAB. Karena eksipien yang digunakan terbatas, drug-loading yang diperoleh sebesar (90 dan 86%) dan efisiensi enkapsulasi (91 dan 63%) dicapai untuk NMCAB dan NCAB. Struktur bentuk batang, merupakan

morfologi yang disukai untuk serapan makrofag. NMCAB stabil dengan PdI dan zpotential yang konsisten dengan peningkatan minimal Deff (39 nm) setelah penyimpanan pada 4oC hingga tiga bulan (Gambar 2D). 3.3 Viabilitas MDM, serapan dan retensi Uji viabilitas sel mengungkapkan bahwa baik NMCAB dan CAB LAP pengobatan tidak berpengaruh pada viabilitas MDM dengan konsentrasi obat hingga 100 µM. Namun, pengobatan CAB LAP 400 µM mengurangi viabilitas sel MDM menjadi 39,4% dibandingkan dengan 83,7% di NMCAB sel yang diobati (P <0,001) (Gambar 3A). Berdasarkan hasil ini, 100 µM adalah dipilih untuk semua studi kultur sel. NMCAB dengan mudah diambil oleh. Dalam studi retensi (Gambar 3B, retensi), NMCAB dipertahankan dalam sel hingga 30 hari, namun Tingkat CAB tidak terdeteksi dalam NCAB dan CABP LAP mengobati sel setelah 1 atau 5 hari. Baik MCAB dan CAB terdeteksi di dalam sel yang diobati menggunakan NMCAB menunjukkan bahwa MCAB dihidrolisis di dalam sel untuk melepaskan CAB. Untuk menyelidiki mekanisme yang diusulkan ini, kami menggunakan

TEM

untuk

memvisualisasikan

nanopartikel

yang

dipertahankan hasilnya yaitu kristal NMCAB tetap stabil dalam organelorganel sitoplasma untuk waktu yang lama. 3.4 Aktivitas antiretroviral berbasis sel Peningkatan aktivitas antiretroviral diamati pada sel yang diobati dengan NMCAB dibandingkan dengan CAB LAP atau NCAB. 3.5 Penilaian PK dan BD pengobatan NMCAB menunjukkan konsentrasi awal yang lebih rendah tetapi CAB yang lebih lambat tingkat peluruhan dibandingkan dengan perlakuan CAB LAP. Konsentrasi CAB plasma secara signifikan lebih tinggi dicapai pada tikus yang diberi NMCAB mulai dari hari ke 21. Injeksi tunggal NMCAB mempertahankan konsentrasi obat plasma CAB di atas 4xPA-IC90 hingga dua bulan. Pada hari ke 56, rata-rata konsentrasi plasma CAB adalah 780 ng / mL pada tikus yang diberi NMCAB. Sebaliknya, konsentrasi plasma CAB pada tikus diobati dengan CAB LAP turun di bawah 4xPA-IC90 pada hari ke 35 (Gambar 5B). Parameter PK dihitung

untuk semua formulasi obat dengan dosis 45 mg / kg (Tabel 1), fase paruh (t1 / 2) setelah pemberian intramuskular NMCAB 4 kali lipat lebih besar daripada CAB LAP (278 dibandingkan 71 jam). Demikian pula, CAB berarti waktu tinggal (MRT) adalah 2 kali lipat lebih lama untuk NMCAB dibandingkan dengan CAB LAP, sedangkan clearance (CL / F) sebanding antara semua formulasi yang diuji. Sebuah studi PK awal NMCAB di primata non-manusia mendukung temuan kami pada hewan pengerat. Konsentrasi plasma CAB adalah di atau di atas PA-IC90 hingga 102 hari di dua monyet jantan yang diberikan suntikan intramuskular tunggal NMCAB pada 45 mg CAB setara / kg (Gambar 5D). Konsentrasi CAB plasma mencapai maksimum pada hari ke 7 dan dipertahankan dari hari ke 11 sampai hari 102. Dihitung Parameter PK (Tabel S2) menunjukkan t1 / 2 selama 22,5 dan 27,2 hari pada masingmasing untuk setiap monyet. Profil darah lengkap (CBC) dan hati dan profil metabolik ginjal tidak berubah sebelum dan sesudah Pengobatan NMCAB (Tabel S3). 3.6 Analisis depot NMCAB Pengobatan NMCAB menghasilkan konsentrasi CAB plasma awal yang lebih rendah dibandingkan dengan CAB LAP. Ini menunjukkan depot sekunder dan / atau pelepasan obat yang lebih lambat dari depot injeksi. Oleh karena itu, suatu PK dan studi BD berfokus pada distribusi awal dari MCAB dan CAB yang dilakukan untuk mengidentifikasi depot jaringan potensial untuk NMCAB. Konsentrasi MCAB tinggi dalam jaringan versus konsentrasi yang diabaikan dalam darah menunjukkan bahwa jaringan, seperti limpa, kelenjar getah bening, hati dan usus, dapat berfungsi sebagai depot obat untuk Formulasi NMCAB. 3.7 Studi relatif restriksi virus pada NMCAB dan CAB LAP Untuk menentukan apakah profil PK yang ditingkatkan dari NMCAB bisa diterjemahkan ke dalam peningkatan efikasi ARV, tikus diberikan suntikan intramuskular tunggal NMCAB atau CAB LAP setara 45 mg CAB / kg pada hari ke 0, diikuti oleh PBL manusia rekonstitusi pada hari ke 11, diberikan HIV-1ADA pada hari ke-22, dan necropsy 10 hari setelah pemberian HIV-1

(Gambar 7A). Darah, plasma, dan jaringan dikumpulkan untuk menentukan tingkat obat, rasio CD4 / CD8, Ekspresi HIV-1p24, viral load, dan viral RNA / DNA. Analisis Flow cytometry Analisis menunjukkan bahwa perlakuan NMCAB dan CAB LAP melindungi hewan dari HIV-1 yang diinduksi dengan kehilangan sel T CD4+ (Gambar 7B). Tes viral load plasma menunjukkan bahwa pengobatan NMCAB dapat membatasi perkembangan virus dibandingkan dengan perawatan CAB LAP. Analisis imunohistokimia mengungkapkan bahwa 7/8 binatang pada kelompok yang diobati NMCAB menunjukkan HIV-1p24 negatif pada limpa dan paru-paru, sementara HIV1p24 sel positif diamati pada semuanya CAB LAP tikus yang mengalami perlakuan dan hewan kontrol HIV-1 yang tidak diobati.Di semua jaringan, termasuk limpa, paru-paru, kelenjar getah bening, dan sumsum tulang, pengobatan NMCAB mengurangi jumlah RNA dan DNA virus oleh lebih dari satu urutan besarnya, dan dalam banyak jaringan dapat mengurangi lebih dari 3 log10 dibandingkan dengan kontrol positif HIV-1 atau CAB LAP. Jaringan yang berkurang ekspresi RNA, DNA virus dan HIV-1p24 berkorelasi dengan> 5 kali lipat peningkatan kadar CAB dalam jaringan (Gambar 7H).

IV. Pembahasan Era ARV long-acting kini telah muncul, CAB dan RPV dapat digunakan pada interval pemberian dosis hingga setiap dua bulan pada pasien terinfeksi HIV. Namun, terapi LAP akan memiliki keterbatasan yang terkait dengan volume injeksi besar, reaksi tempat suntikan, dan interval dosis suboptimal. Cara nyata untuk mengatasi keterbatasan ini terletak pada penurunan volume injeksi yang diperlukan, Memperluas interval dosis, dan menargetkan pertahanan virus. Peneliti meyakini teknologi nano dapat mengatasi masalah ini. Proses formulasi NMCAB dioptimalkan untuk memaksimalkan pembuatan obat dengan penggunaan eksipien terbatas, sambil mempertahankan skalabilitas dan stabilitas penyimpanan jangka panjang. Ini bisa berpotensi diterjemahkan ke dalam volume dosis yang dikurangi dan menurunkan efek samping eksipien. Bahkan, secara signifikan reduksi lebih tinggi (P <0,001) dalam viabilitas sel

MDM yang diamati pada pengobatan dengan 400 µm MCAB setara dengan CAB LAP dibandingkan dengan NMCAB (Gambar 3A). Kami percaya ini dikarenkan jumlah eksipien yang lebih tinggi, terutama surfaktan, dalam formulasi CABP. Formulasi NMCAB memiliki ukuran partikel yang sebanding, polidispersitas, dan morfologi sebagai formulasi CAB LAP. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa morfologi partikel memainkan peran penting dalam perlekatan nanopartikel dan internalisasi oleh makrofag. Baik NMCAB dan CAB LAP menunjukkan morfologi bentuk batang (Gbr. 2C), geometri yang disukai untuk serapan makrofag. CAB adalah senyawa hidrofobik dengan profil pelepasan berkelanjutan. Masa paruh CAB setelah injeksi intramuskular sebagian besar karena pelepasan obat yang lambat dari depot tempat injeksi.Ini penting dan diamati dalam penelitian hewan di situs otot yang digunakan sebagai depot. Sebaliknya, depot obat-obatan seperti itu tidak diamati dalam hewan yang disuntik dengan NMCAB. Perubahan depot obat yang utama dari tempat suntikan otot ke sel dan jaringan juga dapat mengurangi reaksi injeksi. Konsentrasi tinggi MCAB diamati di limpa, hati, usus dan kelenjar getah bening segera setelah pemberian nanoformulasi meskipun konsentrasi MCAB diabaikan

dalam

darah

(Gambar.

5A)

menunjukkan

bahwa

sistem

retikuloendotelial memainkan peran penting dalam redistribusi NMCAB. Data ini menetapkan temuan paralel sebelumnya dari laboratorium kami bahwa monosit makrofag siap digunakan untuk pengiriman ARV berdasarkan kapasitas dan kemampuan memuat yang tinggi sebagai pembawa melintasi hambatan fisiologis. Khususnya, mereka juga merupakan situs reservoir utama untuk HIV1 yang menambah potensi peningkatan tanggapan antiretroviral yang diamati dalam laporan ini. Mekanisme untuk memperpanjang waktu paruh NMCAB terletak di luar sifat strukturalnya dan termasuk metabolisme obat yang berkurang. Ini dicapai dengan memblokir gugus hidroksilnya melalui esterifikasi prodrug. Secara keseluruhan, dalam tikus dengan perlakuan NMCAB memiliki waktu paruh 4 kali lebih lama daripada CAB LAP dengan konsentrasi puncak berkurang,

mencerminkan pelepasan obat yang lebih lambat dari depot. Dengan aktivitas karboksilesterase yang lebih rendah dan tingkat metabolisme yang lebih lambat manusia dibandingkan dengan tikus, NMCAB dapat memperpanjang dosis interval di luar dua bulan dan mengurangi dosis dan volume injeksi secara keseluruhan. Selain itu, hewan yang diperlakukan NMCAB menunjukkan secara signifikan penurunan viral load dalam darah dan jaringan dibandingkan dengan tikus yang diobati CAB LAP. Peningkatan ini didasarkan pada kemampuannya untuk mempertahankan kadar obat plasma di atas 4xPA-IC90 untuk waktu yang lama di luar apa yang bisa disediakan oleh CAB LAP. Untuk kedepannya, NMCAB dapat lebih dioptimalkan dengan modifikasi kimia tambahan, modifikasi permukaan untuk penargetan sel dan kombinasi dengan ARV lain dalam formulasi tunggal. Strategi ini akan memperpanjang interval pemberian dosis, memudahkan administrasi, dan memfasilitasi pengangkutan obat melintasi hambatan fisiologis untuk mencapai jangkauan yang lebih baik untuk meningkatkan aplikasi klinis. V. Kesimpulan Singkatnya, NMCAB, prodrug nanoformulated dari CAB, telah berhasil dikembangkan dengan stabilitas dan skalabilitas yang cukup besar. Ini menunjukkan peningkatan entri seluler dan retensi, dan bentuk depot obat intraseluler yang menyediakan obat yang berkelanjutan yang memiliki pelepasan efektif dan perlindungan jangka panjang terhadap HIV pada makrofag. NMCAB dapat memperpanjang Interval pemberian dosis, meningkatkan konsentrasi obat dalam jaringan, dan meningkatkan profil antiretroviral di luar formulasi CAB LAP saat ini yang dipercaya bahwa peningkatan ini akan berdampak positif bagi hasil baik pengobatan dan pencegahan HIV.