Reporte De Bioqui Proteinas.docx

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA AUXILIAR. NELLY GONZALEZ VIERNES / MATUTINA 8.03.2019 ALFREDO PONCE LIRA 201703317 RUBÉN ANDRÉ MONZÓN TOLEDO 201703372 BRAYAN ANDRÉ SANTOS PEREIDA 201703634 MARCOS ALEXANDER IMUCHAC CHIQUITÓ 201804146

“EXTRACCIÓN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEÍNAS EN FRIJOL” (Phaseolus vulgaris)

RESUMEN. Es importante conocer, como agrónomos, las propiedades físicas, químicas y bioquímicas que contienen los productos agrícolas. En esta ocasión se hace referencia al estudio de contenido proteico en el frijol (Phaseolus vulgaris) a la que luego de deshidratar y procesar hasta llevarla a harina se le realizará extracciones por métodos salinos y acuosos para identificar la mayor cantidad posible de proteínas que pudiera contener. Las proteínas de los granos de leguminosas son fuente potencial de nutrientes valiosos, por lo cual son objeto de estudios para lograr su mejor aprovechamiento. El propósito de este trabajo consistió en determinar varias características cualitativas de las fracciones proteínicas en el frijol (Phaseolus vulgaris), separadas por solubilidad en diferentes agentes precipitantes de carácter metálico, así como de la prueba de Biuret para identificar proteínas. Para ello y a modo de referencia se utilizó Caseína, Gelatina, Albúmina y Peptona como soluciones patrón de las diferentes pruebas sobre presencia de proteínas. Los granos de las leguminosas comestibles son en gran medida nutrimentalmente importantes, como la principal fuente de proteínas (20 al 40%) de bajo costo en la dieta del hombre. Tal como lo cita el párrafo anterior, se comprobó que en efecto el frijol contiene un buen porcentaje de proteínas puesto que al realizar la prueba de Precipitación con Metales, así como la prueba de Biuret, tanto para el extracto salino como para el extracto acuoso las pruebas fueron positivas.

OBJETIVOS. GENERAL.  Estudiar la importancia que tienen las proteínas y los aminoácidos, y su presencia en los granos (Phaseolus vulgaris). ESPECÍFICOS.  Realizar la extracción de proteínas; salina y acuosa a la muestra vegetal, aplicando pruebas de detección de proteínas, como: precipitación proteica y Biuret.  Llevar a cabo la hidrólisis ácida y alcalina de proteínas a la muestra vegetal, determinado mediante pruebas de reactivos la presencia o ausencia de diferentes aminoácidos.

 Utilizar técnicas de cromatografía en capa fina y espectrofotometría para realizar los análisis cualitativos y cuantitativos de aminoácidos en la muestra vegetal.

MARCO TEÓRICO. El frijol, Phaseolus vulgaris es importante en la alimentación de gran parte de los pobladores de Guatemala y América Central. No es de extrañarse que su valor nutricional sea muy alto, razón por la cual es de vital importancia determinar la calidad de las proteínas y sus aminoácidos desde la semilla. Sin embargo, siempre sorprende la variación en su valor nutritivo, especialmente cuando se trata de los aminoácidos esenciales. Cada proteína es única en términos de estructura y función. No obstante, también existen numerosas semejanzas entre las proteínas. Su característica más común es que todas son polímeros formados por aminoácidos, los cuales son sus monómeros, éstos se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptídico. (FAUSAC, 2010). Durante las prácticas de laboratorio se trabajaron diferentes métodos analíticos con la semilla de frijol blanco, el principal objetivo de dichos análisis era realizar pruebas cualitativas y cuantitativas tanto de proteínas, (haciendo extracciones acuosas y salinas) como de aminoácidos (haciendo hidrolizados básico y ácido de los dos tipos de extracciones) presentes en las muestras vegetales. Mediante la técnica de cromatografía se logró un análisis cualitativo de aminoácidos de la muestra; y con espectrofotometría se llegó a determinar la concentración proteica de la semilla de frijol blanco. Origen y Taxonomía del frijol. Dentro del grupo de las leguminosas que poseen semillas comestibles, el frijol común corresponde a una de las más importantes. Actualmente se encuentra distribuido en los cinco continentes y es un componente esencial de la dieta, especialmente en Centroamérica y Sudamérica. Taxonómicamente, el frijol corresponde a la especie del género Phaseolus. Su nombre completo es Phaseolus vulgaris L., asignada por Linneo en 1753, a la tribu Phaseoleae, subfamilia Papilionaideae, familia Leguminosae y al orden Rosales. Variedades y su clasificación. Las variedades del frijol se pueden clasificar de acuerdo a diversos criterios. Por su consumo como grano seco y como grano y vaina verde; desde el punto de vista agronómico se utilizan características como la duración del periodo vegetativo y se habla de variedades precoces o tardías; en cuanto a la reacción al fotoperiodo se dice de variedades sensibles, insensibles o neutras y en lo que respecta a factores limitantes de la producción se ubica a las variedades en al menos las resistentes y susceptibles. Dentro de color, se encuentran variedades de frijol clasificadas por su grupo como blanco, crema, amarillo, café marrón, rosado, rojo, morado, negro u otros. El tamaño se determina por el peso de 100 granos y los materiales se clasifican en tres grupos de la siguiente manera: pequeños (hasta 25 g/100 semillas), medianos (entre 25 y 40 g/100 semillas) y grandes (desde 40 g/100 semillas).

Figura 1. Diversos tamaños y colores de frijol. Propiedades alimenticias y valor nutricional del frijol. Las propiedades nutritivas que posee el frijol están relacionadas con su alto contenido proteico y en menor medida a su aportación de carbohidratos, vitaminas y minerales. CUADRO 1: Tabla del valor nutricional del frijol. Phaseolus vulgaris .sp Nombre Científico Nombre Común Frijol blanco Contenido nutricional del frijol por cada 100 gramos (crudo) Aminoácidos Calorías 332 g Fibra 4.3 g Isoleucina 927 mg Grasas 1.8 g Leucina 1,685 mg Proteínas 19.2 g Lisina 1,593 mg Carbohidratos 61.5 g Metionina 234 mg Lípidos Fenilalanina 1, 154 mg Grasas totales 1.8 g Treonina 878 mg Colesterol 0.0 mg Triptófano 223 mg Saturados totales 0.12 g Valina 1,016 mg Monoinsaturados (oleico) 0.06 g Arginina 1,257 mg Polliinsaturados (linoleico) 0.18 g Histidina 627 mg Minerales Vitaminas Calcio 228 mg Retinol 1.0 μg Fósforo 407 mg Tiamina 0.62 mg Hierro 5.5 mg Riboflavina 0.14 mg Magnesio 140 mg Niacina 1.7 mg Sodio 24 mg Piridoxina 0.4 mg Potasio 1,460 mg Ácido fólico 394 μg Zinc 2.79 mg Cobalamina 0.0 μg Fuente: Herrera Paz Leonel, 2017 Extracción y estudios cualitativos de proteínas en muestras vegetales. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina de [Na(OH) o K(OH)]. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm.

Figura 2. Estructuras de fotoquímicos importantes del frijol:(a) ácido fitico, (b) taninos (ácido galico).

Figura 3. Fórmula de Biuret.

Estudio de aminoácidos de muestras vegetales. La hidrolisis proteica es aquella que por medios enzimáticos busca hacer que una proteína sea de menor tamaño, o sea convertirla a péptidos, llegar a determinar la secuencia de aminoácidos que forman parte de su cadena primaria (Manual de bioquímica de FAUSAC, 2010) Para el efecto de esta práctica se utilizan soluciones patrón que son aquellas la cuales se conoce cuál es su concentración y se utiliza para lograr conocer la concentración de otra sustancia. Las soluciones patrón utilizadas en la prueba fueron aquellas medidas con lisina, triptófano, tirosina, leucina, histidina, cisteína, fenilalanina. Las soluciones patrón facilita la identificación de los compuestos en las pruebas. (Manual de bioquímica de FAUSAC, 2010). Prueba de ninhdrina, Se basa en la reacción del grupo carboxilo libre y el grupo amino de las proteínas, aminoácidos y péptidos con la ninhidrina provee un color purpura, a excepción de hallarse con prolina o hidroxiprolina, el grupo amino libre produce un color amarillo (MIKI., 2017). Prueba de Million. Este reactivo está conformado por mercurio disuelto en ácido nítrico. Al momento de que este reactivo es agregado a una proteína se forma un es el ejemplo hidrolisis

Figura 4. Reacción de un aminoácido con la ninhidrina

precipitado blanco. Tal de la tirosina en (Douglas, 2017).

Figura 5. Formación del complejo (sal mercúrica) a partir de una proteína con restos de tirosina.

Prueba Xantoproteica. Es un reactivo que tiene como base al ácido nítrico, identifica proteínas con cadenas aromáticas, derivadas del benceno como la tirosina, fenilalanina, triptófano, se denota su presencia por el distintivo color amarillo. Los aminoácidos tirosina y triptófano poseen sus anillos de benceno activados por lo que es fácil la identificación, caso contrario al de fenilalanina (MIKI., 2017)

Figura 6. Formación de productos nitrados a partir de aminoácidos con grupos aromáticos.

Prueba de sulfuro. Se nota con la sencillez del color negruzco de sulfuro de plomo, al separar un álcali, del azufre de los aminoácidos, reacciona este con una solución de acetato de plomo, lo que se refleja en el sulfuro de plomo ( Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, s.f.)

Figura 7. Reacción de un aminoácido con la prueba de sulfuro.

Prueba de bromo. Estando en medio alcalino los aminoácidos que poseen el grupo imidazol (histidina) al eliminar un doble enlace creando una adición provocaran una cloración azul- violeta (Manual de laboratorio de bioquímica, FAUSAC) Cromatografía. Cromatografía son varias técnicas que tienen como función la identificación de compuestos gracias a la separación de los mismos en un solvente común. Las fuerzas que definen el grado de separación de sustancias son: 1 la velocidad de flujo del solvente, 2 la solubilidad de las sustancias en el solvente, 3 los efectos de fraccionamiento, y 4 los efectos de absorción. Los responsables de la movilización de la mezcla de sustancia son la velocidad

de flujo del solvente y la solubilidad de las sustancias en el solvente. ( Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, s.f.) . Cromatografía capa fina y papel La diferencia entre cromatografía en papel y cromatografía en capa fina radica en que, capa fina provee resultados más fidedignos ya que se es capaz de utilizar diversos reactivos sin alteran los resultados y la rapidez con que se realiza la separación. Se recomienda no hacer puntos muy grandes al realizar la cromatografia, que el reactivo no supere la linea donde se encuentran los puntos de muestra a analizar, procurar tener una distancia prudente entre punto y punto para que no hallan confusiones de alrededor de .5 entre punto y punto y de 1.5 entre la distancia del borde. Una cromatoplaca se activa por medio del eluyente, al estar en contacto con la placa comienza a subir por polaridad y la sustancia se separa mediante este sube, según sea su polaridad este sube por capilaridad o bien baja por gravedad. Se utilizan tubos microcapilares ya que es posible controlar el tamaño de la gota que será colocada en la cromatoplaca. Se espera a que se sequé para a cerciorarse de que ha llegado a su punto donde haya ocurrido la separación. Por capilaridad el papel filtro es el eluyente ya que es la fase móvil, donde suben las sustancias. Se marca con un lápiz la posición del frente del disolvente para marcar hasta donde subió la solución en la elución y poder hacer el análisis en base a esos datos. Si aparece una mancha de un color diferente a azul o violeta se puede deducir que no posee aminoácidos La cromatoplaca se recorta según sea la cantidad de puntos que se vayan a utilizar. Espectrometría. La espectrometría se utiliza para analizar la cantidad de cierta especie en una muestra y su concentración en la misma por medio de la luz. El espectrómetro es el que se utiliza para realizar esta prueba. Se utilizó una longitud de onda de 540 mm porque está en 0 de absorbancia, un blanco de reactivo es aquel que mide cuanto se absorbe la luz en la cubeta. (Perez, s.f.) Cuanto más larga es la longitud de onda de la radiación absorbida, menor es la transformación energética por esa absorción. Leyes de la energía radiante. Se basan en la relación entre lo que absorbe la energía y la magnitud de la cantidad absorbente, la intensidad se basa en la concentración del absorbente y el trayecto que recorre por medio de la radiación energética en la solución. Para plasmar esto como fórmula deben cumplirse ciertos requisitos, como algunos los mencionados a continuación:  La longitud de onda es única  El medio es isótropo  Las moléculas absorbentes no se disocian y asocian  La ley de Beer se expresa entonces :

A1

C1

= C2 A2

Cuadro 2. Expresión de la ley de Beer A1 A2 C1 C2

Absorción de una solución problema. Absorción de una solución patrón de concentración conocida. Concentración de la solución problema. Concentración de la solución patrón.

RESULTADOS PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANÁLISIS QUÍMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES. Cuadro 3. Datos de pesos y % de humedad. Antes del secado. Masa total de la muestra Después del secado.

700 gr

Masa real de la muestra

639 gr

Gramos de humedad Gramos perdidos = (𝑀𝑇𝑀) − (𝑀𝑅𝐴𝑀)

61 gr

𝐺𝑃

% de humedad= (𝑀𝑇𝑀) ∗ 100 8.71% Después del tamizado 453 gr Masa de la harina Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Donde: MTM MRAM GP

Masa total de la muestra Masa real de la muestra despues del secado Gramos peridos.

PRÁCTICA No. 3 EXTRACCIÓN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEÍNAS EN MUESTRAS VEGETALES Cuadro 4. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrón y los dos extractos de proteínas. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen Extracto acuoso Violeta Extracto salino Violeta Peptona Violeta Albumina Violeta Caseína Violeta Gelatina Violeta Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019

+ + + + + +

Cuadro 4. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrón y los dos extractos de proteínas. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen Extracto acuoso Violeta Extracto salino Violeta Peptona Violeta Albumina Violeta Caseína Violeta Gelatina Violeta Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019

+ + + + + +

Cuadro 5. Resultados de la prueba de METALES PESADOS con las cuatro soluciones patrón y los dos extractos de proteínas. Muestra analizada Lisina Triptófano Tirosina Leucina Histidina Cisteína Fenilalanina

Coloración obtenida Rojiza amarillenta Lila Violeta Morado Violeta Amarillo Tenue amarillo

Dictamen + + + + + + +

Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Cuadro 6. Resultados de la prueba de NINHIDRINA con las siete soluciones patrón.

Muestra analizada Extracto acuoso Extracto salino Peptona Albumina Caseína Gelatina

Nitrato de mercurio Dictamen + + + + + (lechoso) + + (precipitado) + + (lechoso) + + (blanco grumoso) +

Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Cuadro 7. Resultados de la prueba de NINHIDRINA con los hidrolizados. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen A. Hidrolizado acuoso ácido. Rojizo B. Hidrolizado salino ácido. Incolora C. Hidrolizado acuoso básico Rojizo amarillento + D. Hidrolizado salino básico Lila Tenue + Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019

Cuadro 8. Resultados de la prueba XANTROPOTEICA con las soluciones patrón. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen Fenilalanina Naranja + Tirosina Naranja + Triptófano Amarillo naranjoso + Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Cuadro 9. Resultados de la prueba XANTROPOTEICA con hidrolizados. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen A. Hidrolizado acuoso ácido. Amarillenta naranjosa + B. Hidrolizado salino ácido. Incolora C. Hidrolizado acuoso básico Amarillenta muy débil D. Hidrolizado salino básico Incolora Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Cuadro 10. Resultados de la prueba de MILLÓN con la solución patrón y los hidrolizados. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen Tirosina Corinto + A. Hidrolizado acuoso ácido. Incolora B. Hidrolizado salino ácido. Incolora C. Hidrolizado acuoso básico Incolora D. Hidrolizado salino básico Incolora Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 Cuadro 11. Resultados de la prueba de SULFURO con la solución patrón y los hidrolizados. Muestra analizada Coloración obtenida Dictamen Cisteína Gris oscuro + A. Hidrolizado acuoso ácido. Incolora B. Hidrolizado salino ácido. Incolora C. Hidrolizado acuoso básico Incolora D. Hidrolizado salino básico Incolora Fuente: Datos del laboratorio de bioquímica 2019 PRÁCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS, CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRÍA.

Cuadro 12. Datos comparativos en el cálculo de concentración por el método de espectrofotometría. Muestra Absorbencia Extracto Acuoso 0.16 Extracto Salino 0.15 Albumina 0.17 Muestra desconocida 0.18  Cromatografía de aminoácidos.

Transmitancia 69 70 67 66

%Concentración (p/p) 4.70%p/p 4.41%p/p 5.00%p/p 5.29%p/p

Cuadro 13. Toma de datos sobre el recorrido de las diferentes muestras estudiadas en la cromatoplaca por cromatografía.

A. B. C. D.

Muestra Hidrolizado acuoso ácido. Hidrolizado salino ácido. Hidrolizado acuoso básico. Hidrolizado salino básico.

Recorrido en cm 0 0 0 0

Análisis En el cuadro anterior se observan los resultados obtenidos de la prueba de cromatografía para la identificación de aminoácidos presentes en las muestras. Los resultados para esta prueba fueron negativos ya que no se obtuvo ningún recorrido de algún aminoácido al momento de realizar la revelación de la placa cromatografía utilizada, lo cual se puedo deber a un proceso inadecuado de neutralización de los respectivos extractos a utilizar lo que al presentar variaciones extensas de pH causo la degradación de los aminoácidos a sus partes más sencillas o que estos se encontraron en una concentración demasiado baja la cual era insensible a la reacción con las pruebas determinadas.

ANÁLISIS DE RESULTADOS. Selección del material vegetal a trabajar en el laboratorio Las semillas tienen cierto contenido de humedad, por lo cual al pesarlas cuando no se le ha realizado ningún secado, en comparación con las que ya se les ha realizado el secado pesan menos ya que se ha suprimido la cantidad de humedad que estas tenían. Para esta técnica del secado se utilizó el método de secado al horno, que es una técnica de secado artificial, esta es mucho más rápida, que una técnica de secado natural ya que no hay descomposición de constituyentes por lo cual es una técnica muy recomendable pero mucho más tardada para la eliminación total del agua. Preparación de muestras vegetales para análisis químico secado, molido y tamizado de muestras vegetales Durante el proceso de molienda es de suma importancia contar con el proceso de secado, puesto lo que se pretende con dicha técnica es la obtención de pequeñas fracciones del órgano ya

homogenizado para la posterior evaluación de los compuestos químicos con los que el órgano de la planta cuente. Es así como se logró obtener 407 gramos de harina tras el proceso de molienda y tamizado, como también un porcentaje de humedad del 8.71% en semilla seca el cual fue eliminado mediante secado artificial, en donde dicho porcentaje fue la diferencia de peso de la semilla sin haber sido sometida al proceso de secado, menos el peso de la semilla seca, con el resultado siendo dividido nuevamente por el peso de semilla seca. Durante el secado artificial no se debe de exceder una temperatura mayor a los 60°C puesto de no ser así las biomoléculas se desnaturalizan, descomponiéndose de esta manera importantes compuestos de objeto de evaluación, para las consiguientes prácticas de proteínas y aminoácidos. Extracción y estudio cualitativo de proteínas en muestras vegetales. Los metales pesados tienen el efecto de precipitar proteínas de sus soluciones creando enlaces cross-linking entre los grupos amino libre y los grupos carboxilo libre. Los iones más comunes utilizados para detectar la presencia de proteínas. Incluyen: 2+ 3+ 2+ 3+ 1+ 2+ 2+ 2+ 𝑍𝑛 , 𝐹𝑒 , 𝐶𝑢 , 𝑆𝑏 , 𝐴𝑔 , 𝐻𝑔 , 𝐶𝑑 , 𝑃𝑏

Reacción del precipitado con, 𝐻𝑔2+ . Debido a su carácter anfótero, las proteínas reaccionan con los ácidos y con las bases. Los ácidos proteicos y álcali proteicos son insolubles en agua y en solución de sales neutras y se disocian en los ácidos y en las bases diluidas, pero precipitan en medio neutro. Las proteínas recuperadas resultan desnaturalizadas por la acción de metales pesados. (Thomas Devlin, 1990) El método de precipitación proteica por medio de metales pesados se basa en que las sales de que poseen los metales pesado precipitan las proteínas porque el ion del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aniónica de la proteína, ya que la proteína en el lado alcalino de su punto isoeléctrico existe como ion negativo y eso al combinarse con el ion del metal formara proteinatos, lo cual se pudo observar en este experimento ya que todas las muestras analizadas presentaron un precipitado de color Blanco unos con más intensidad que otros pero esto debido a la concentración de proteínas que varía de una sustancia a otra. (Elena Feduchi, 2014). REACCION DE BIURET (REACCION DE FEHLING) Es la formación de compuestos coloreados de violeta de las proteínas en medio fuerte alcalino de las sales de Cu la reacción empleada mediante ROONH2 , R – CS – NH2.

Ejemplo de reactivo biuret en albumina. En esta reacción de destruyen los enlaces amidos liberando aminoácidos, cuando este enlace de una proteína o péptido entra en contacto con este reactivo forma una coloración violeta o azul lo cual nos hace saber que la prueba es positiva. Como se pudo observar en todas las muestras analizadas dieron positivas ya que todas presentaban una concentración de proteínas en su interior, la intensidad del color puede variar debido a la concentración de proteínas en la sustancia analizada pero la más leve variación de color indica la presencia de proteínas. Estudio de aminoácidos de muestras vegetales Durante las pruebas que se realizaron para identificar aminoácidos se realizaron hidrolizados de los extractos de frijol, Elena Feduchi dice: ”la hidrólisis es una reacción química entre agua y otra sustancia, como sales, produciendo un desplazamiento del equilibrio de disociación del agua y como consecuencia se modifica el valor del pH, esta es la ruptura de enlaces peptidico, para producir aminoácidos libres”. En el laboratorio se realizaron hidrólisis acida utilizando HCl e hidrólisis básica utilizando NaOH; para que se puedan obtener aminoácidos libres y así poder aplicarles a cada hidrolizado las pruebas para la determinación de aminoácidos. Thomas Devlin dice:“la hidrólisis presenta problemas, dado la sensibilidad de varios aminoácidos al proceso, tales como la serina, la treonina, la cistina y el triptófano. Durante la hidrólisis ácida la cistina es parcialmente destruida y el triptófano lo es totalmente. La principal ventaja de los hidróxidos sobre los ácidos es que no dan lugar a la formación de humus; así pues, según informes, no destruyen el triptófano. Por otra parte, ocasionan la descomposición parcial o total de la cistina, la arginina y la lisina”. Con los resultados obtenidos de los hidrolizados que se muestran en el cuadro (hidrolizado acuoso acido, hidrolizado acuoso básico, hidrolizado salino acido e hidrolizado salino básico) se observan resultados positivos de acuerdo con las pruebas individuales que se le han aplicado a cada uno, solo con la excepción de la prueba de bromo, esta resulto negativa asimilando que no contiene histidina en su estructura. Podemos definir que los hidrolizados contienen aminoácidos en su estructura según el dictamen positivo; se encuentran alfa-aminoácidos, aminoácidos aromáticos y cisteína. La prueba de millón según lo investigado de los aminoácidos del frijol, contiene de 100 gr de frijol tiene 710 mg de

tirosina; con lo anterior podríamos decir entonces que la prueba de millón sería positiva para los hidrolizados, pero en las pruebas realizadas el resultado obtenido fue negativo tanto para los hidrolizados ácidos como para los hidrolizados básicos. Para las pruebas realizadas con las soluciones patrón que se tenía en el laboratorio servían como un modelo a seguir para comprobar la presencia de los aminoácidos que contenían, para la Lisina; solo se le aplico la prueba de Ninhidrina resultando un color violeta siendo así positiva ya que la prueba de ninhidrina es positiva para todos los aminoácidos. Al Triptofano, se le realizaron las pruebas de ninhidrina y xantoproteica obteniendo una coloración violeta y anaranjada, en ambas siendo así positivas las dos pruebas, como es un aminoácido y el triptófano posee un núcleo aromático da positiva denotando la presencia de aminoácidos aromáticos. A la tirosina se le aplicaron la prueba de ninhidrina y xantoproteica siendo positivas en ambas pruebas ya que presenta un anillo aromático en el, también debió haber resultado positivo con la prueba de millón ya que esta es específica para la tirosina denotando un color rojo. La leucina se le aplico únicamente la prueba de ninhidrina denotando una coloración violeta siendo positiva la prueba ya que es un aminoácido, a la Histidina se le aplicaron la prueba de ninhidrina siendo positiva por ser aminoácido y la prueba de bromo; con esta se obtuvo positiva denotando una coloración azul oscuro y el grupo imidazol en su estructura. La Cisteina se le aplico la prueba de ninhidrina y sulfuro siendo positivas ambas pruebas, demostrando que la cisteína es un thiaminoacido. Por último, a la Fenilalamina se le aplicaron las pruebas de ninhidrina y xantoproteica siendo ambas positivas, demostrado ser un aminoácido y que tiene un núcleo aromático en su estructura. Estos resultados positivos son tanto para hidrólisis alcalina como para hidrólisis ácida. Espectrofotometría. Las leyes de la absorción de energía radiante hacen referencia a las relaciones existentes entre la magnitud de la absorción de energía radiante y la cantidad de la sustancia absorbente. En base al fundamento anterior se dice que por medio de la espectrofotometría se puede determinar la concentración de proteínas debido a la absorbancia y transmitancia que estas tienen de la energía radiante incidente sobre ellas. Obteniendo la transmitancia de cada sustancia se pudo calcular la absorbancia, y así poder conocer la concentración de proteínas contenidas en ellas. Las concentraciones obtenidas fueron 4.70%p/p en el extracto acuoso y 4. 41%p/p en el extracto salino, por lo tanto, si hay presencia de proteínas en los extractos de la muestra vegetal, se afirma el resultado obtenido en las pruebas de metales pesados y en el resultado obtenido en la prueba de Biuret por segunda vez. Se puede decir que las proteínas se diluyen más en el extracto acuoso que en el extracto salino, ya que las altas concentraciones de sales contenidas en la solución tienden a precipitar a las proteínas, tal fenómeno se conoce como “saltingout” y por esto se observa una menor concentración en el extracto acuoso que en el extracto salino.

CONCLUSIONES  Los dos tipos de extracción acuosa y salina en la muestra vegetal de frijol, se realizaron para garantizar el máximo porcentaje de proteínas solubilizadas, esto quiere decir, las proteínas que no se extraen con el medio acuoso son extraídas con el medio salino y viceversa. Del tipo de extracción en esta muestra en definitiva se espera que las proteínas sean globulares pues a diferencia de las fibrosas éstas solubilizan en soluciones acuosas y salina. Antes de continuar con las siguientes pruebas, debemos identificar la presencia de proteínas; la prueba realizada a nuestra muestra mostro positivo indicándonos la presencia de esta biomolecula.  Con los aminoácidos libres obtenidos por los hidrolizados de proteínas, aplicamoslas pruebas de caracterización cualitativa de aminoácidos. Al saber primeramente que tenemos proteinas con las pruebas de precipitacion proteica o biuret, se realizara la prueba de aminoacidos, sabiendo que hay aminoacidos aromaticos, fenolicos, thioaminoacidos, el grupo amidazol, entre otros. Las pruebas positivas a nuestra muestra fueron las de: Xantoproteica (aromaticos) y Sulfuro (thioaminoacidos).  Las dos técnicas utilizadas en el laboratorio (cromatografía y espectrofotometría) fueron muy útiles en la identificación de las clases de aminoácidos. La parte de la cromatografía es un análisis cualitativo, para esta tecnica fue utilizada la cromatrografia en capa fina, usando como adsorbente el silicagel, luego se calcularon las rf. la espectrofotometría es un análisis cuantitativo de los aminoácidos aplicada a la muestra vegetal designada. En el espectrofotometro se midieron las tramitancias y luego se calcularon con despejes las absorbacias de las muestras.

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ANEXOS.

Figura 12. tubos de ensayo de solución patrón con prueba de ninhridina.[Fotografía de Alexander Imuchac]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 9. extracción de proteínas [Fotografía de Rubén Monzón]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 13. tubos de ensayo de los hidrolizados con prueba de ninhidrina.[Fotografía de Alexander Imuchac]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica Figura 10. tubos de ensayo con prueba de biuret[Fotografía de Alexander Imuchac]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 11. tubos de ensayo con prueba de metales pesados [Fotografía de Alexander Imuchac]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 14. tubos de ensayo de soluciones patrón con prueba xantropoteica.[Fotografía de Brayan Santos]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 15. tubos de ensayo de los hidrolizados con prueba xantropoteica.[Fotografía de Brayan Santos]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Cálculos empleados para la obtención de la absorbancia 𝑨(𝒆𝒂) = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈(𝟔𝟗) = 𝟎. 𝟏𝟔 𝑨(𝒆𝒔) = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈(𝟕𝟎) = 𝟎. 𝟏𝟓 𝑨(𝒂𝒍) = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈(𝟔𝟕) = 𝟎. 𝟏𝟕 𝑨(𝒎𝒅) = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈(𝟔𝟔) = 𝟎. 𝟏𝟖 Figura 16. tubos de ensayo con la solución patrón y los hidrolizados con la prueba de Millón. [Fotografía de Rubén Monzón]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Cálculos empleados para la %concentración (p/p) 𝐶(𝑒𝑥) =

0.16 ∗ 5 𝑝 = 4.70% 0.17 𝑝

𝐶(𝑒𝑠) =

0.15 ∗ 5 𝑝 = 4.41% 0.17 𝑝

𝑝 𝐶𝑎𝑙 = [5.00% ] 𝑝 Figura 17. tubos de ensayo con la solución patrón y los hidrolizados con la prueba de sulfuro. [Fotografía de Rubén Monzón]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

Figura 18. tubos de ensayo para la prueba de espectrofotometría.[Fotografía de Brayan Santos]. (Guatemala 2019). Laboratorio de bioquímica.

𝐶(𝑚𝑑) =

0.18 ∗ 5 𝑝 = 5.29% 0.17 𝑝