Rcp

En 1986, Kary B. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction. Gracias a su trabajo de PCR se le otorgó el PREMIO NOBEL en química en 1993. Es importante destacar el descubrimiento de la Taq polimerasa, pues gracias a esto se pudo realizar la metodologia. Esta técnica revolucionó muchos aspectos de la investigación, entre estos, el diagnóstico de defectos genéticos y del VIH.

Es una metodología que permite amplificar un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma.

DEFINICION “Es un método de síntesis enzimática in vitro de múltiples copias de

una secuencia concreta de DNA (el RNA también puede utilizarse mediante la previa transcripción inversa a cDNA). Este procedimiento permite la detección y el análisis de secuencias génicas específicas en una muestra del paciente, sin necesidad de clonación ni técnicas de manchas Southern o Northern. Los análisis pueden realizarse incluso en una sola célula obtenida de la raíz de un cabello, de las pocas células presentes en raspados bucales o de una gota de sangre seca.

DNA (molecule sencilla)

PCR amplificación

Muchas moleculas

5’

 

3’

-T A C G -A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

5’

 

3’

-T A C G T -A T G C A T G C A T G C * *

5’

3’



-T A C G T A



-A T G C A T G C A T G C * *

5’

3’



-T A C G T A C



-A T G C A T G C A T G C * *

5’

 

3’

-T A C G T A C G -A T G C A T G C A T G C * *

5’

3’



-T A C G T A C G T



-A T G C A T G C A T G C * *

5’

3’



-T A C G T A C G T A



-A T G C A T G C A T G C * *

Primer 1

Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta tem

Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

Fusión 95°C

Hibridización 50-60ºC

Extensión de La cadena 75ºC

2do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC

Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

 







 

Desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Iones de magnesio (Mg 2+ ), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas (la más común es la Taq Polimerasa, perteneciente a la arqueobacteria Thermus aquateus). ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las tres etapas que conforman un ciclo.

Las altas temperaturas de desnaturalización aplicadas en cada ciclo de amplificación. Por lo cual se utilizó la Taq. polimerasa procedente de la Thermus aquaticus. Su actividad óptima se logra a una temperatura de 70 a 75°C aunque resiste temperaturas superiores a 90°C y mantiene su actividad enzimática después de la temperatura de desnaturalización por lo que no necesita ser reemplazada en cada ciclo. Con esta enzima es posible amplificar fragmentos de hasta 10000 bases a una velocidad de extensión de unos 150 nucleótidos por segundo y molécula de enzima con una probabilidad de error en la copia extremadamente baja.



Se conoce su secuencia Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb) Requieren de un cuidadoso diseño



Reglas de diseño:

  

  

(a) longitud = 18-25 (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´ repetido 5´ 3´

3´

5´

5´ 3´

PCR

3´ 5´

Dímero de primer

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´ repetido 5´ 3´

3´

5´

PCR 5´

3´

5´

3´

no hay extensión

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT

Formación de horquillas

PCR

5´ 3´ 3´

5´

5´ 3´

Productos de PCR no deseados

 Segmento de doble cadena  ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal  Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

El

PCR consta de 3 pasos importantes: DESNATURALIZACION HIBRIDACION

“Annealing”-

Anillamiento O UNION DEL

CEBADOR A LA CADENA MOLDE EXTENSION

DE LA CADENA

•

Esta consiste en separar las dos hebras por las cuales esta constituido por medio del rompimiento de puentes de hidrógeno. Esto se puede realizar de varios modos, siendo el mas habitual el CALENTAMIENTO a 94ºC – 95ºC de la muestra.





A continuación se producirá la HIBRIDACION del cebador o primer, es decir el cebador se unirá o se aparea a su secuencia complementaria de ADN molde. Para que esto sea posible , es necesario un descenso de la temperatura , generalmente a 55ºC, aunque pueda variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC . Estos cebadores o primers no solo actuaran como sustrato para la ADN polimerasa, sino que actuaran como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada

Incorporación de Nucleótidos en el extremo 3’ utilizando un prymer por medio de la Taq Pol. Empleando la cadena molde de DNA desnaturalizada

     

Obtención de resultados con una muestra mínima de ADN. En un espacio corto de tiempo genera un elevado número de copias de ADN. Uso en estudios de criminalística cuando el ADN se encuentra degradado. Rapidez Los resultados son informatizados ESPECIFICIDAD



BAJA sensibilidad



ALTA probabilidad de contaminación.

Tiene aplicaciones médicas para el diagnóstico de diversas enfermedades. Algunas de ellas son. -Fibrosis Quística -Hemofilias -Deficiencia de la glucosa 6-P-DH -Mutaciones  También es útil para encontrar parásitos, virus o bacterias en alguna muestra de ADN.  Estudios evolutivos 