Pruebas De Esterilidad.docx

INTRODUCCIÓN

Las pruebas de esterilidad tienen como finalidad investigar la presencia de microorganismos en sustancias o preparaciones que requieren ser estériles, usando los medios de cultivo adecuados, por lo tanto en el laboratorio es importante trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Se entiende por esterilización los procedimientos por los cuales se eliminan todas las formas vivas de microorganismos, sean patógenos o no, que se hallen en un material. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves, en la siguiente indagación daremos más información sobre ellos.

OBJETIVOS Objetivo General:

 Indagar a cerca de la forma de realizar pruebas de esterilidad en el laboratorio.

Objetivos Específicos:

 Inferir sobre el funcionamiento del autoclave.  Explicar sobre la propagación de medios de cultivo.  Detallar las condiciones necesarias para el almacenamiento de los medios de cultivo

PRUEBAS DE ESTERILIDAD La prueba de esterilidad tiene fundamento en la detección de formas viables de microorganismos, en medios de cultivo adecuados para el crecimiento de bacterias, hongos y levaduras que se encuentran como contaminantes en productos estériles. Recomendaciones especiales para la prueba de esterilidad Para evitar una contaminación accidental la prueba debe llevarse a cabo en condiciones asépticas por lo que periódicamente se realizará el control ambiental de las áreas de trabajo, así como del equipo y material empleados. Los envases de las muestras deben desinfectarse previamente a su análisis. A los productos envasados al vacio, se les debe introducir aire filtrado a través de algodón estéril. Si el producto tiene diluyente o algún aplicador anexo, también debe cumplir la prueba de esterilidad. Se debe llevar a cabo una prueba en blanco como testigo, paralela a los análisis de las muestras. AUTOCLAVE La esterilización, tanto del material y medios contaminados, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves. ¿Qué es el autoclave? El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro, es un recipiente metálico de paredes gruesas con cierre hermético que permite trabajar con vapor de agua a alta presión y alta temperatura que sirve para esterilizar instrumental (material médico, de laboratorio, etc.) o alimentos. En esencia un autoclave es un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias a aumentar la presión. Un autoclave está constituido básicamente por una cámara rígida y hermética que incluye una puerta con dispositivos de seguridad para permitir introducir los objetos a esterilizar. Esta cámara lleva adosados dispositivos para medida de presión y temperatura y elementos calefactores para mantenerla caliente. Los autoclaves piden un cierto tiempo desde el momento de conectarlos a la red con el fin de estar preparados térmicamente para los ciclos. Los ciclos más habituales que los fabricantes incorporan en estos equipos son: Ciclo de 105 ºC, para la desinfección de líquidos y objetos delicados. No olvidemos que por debajo del 120 ºC, sólo se puede hablar de desinfección, nunca de esterilización. Ciclo de 120 ºC, para la esterilización general del instrumental, guantes y tejidos clínicos. Ciclo de 134 ºC, para la esterilización de material quirúrgico o con riesgo. Ciclo de 143 ºC, llamado también ciclo rápido. Para esterilizar fundamentalmente instrumental cuyo uso pueda ser inmediato o urgente. A todos estos ciclos se le asocia otro llamado de secado que no es tal, ya que en sí mismo no es un ciclo, sino una parte de él y por tanto deberíamos denominarlo más bien como periodo de secado. Este periodo de secado nace de la necesidad de eliminar por evaporación a media temperatura de la inevitable condensación de agua al finalizar el ciclo.

Un instante antes de finalizar un ciclo de 134 ºC, , el interior de la cámara presenta esta temperatura en todos sus puntos debida al vapor. Cuando el ciclo termina el vapor sale rápidamente del interior generando una caída de presión y temperatura muy brusca que produce una condensación inmediata por debajo de los 100 ºC. A esta temperatura todavía queda mucha agua y vapor dentro de la cámara con lo que la condensación se hace evidente. Algunos fabricantes mantienen una temperatura elevada de las paredes de la cámara durante algunos minutos (hasta 20 minutos) con el fin de evaporar esta agua casi en su totalidad. Este objetivo se cumpliría siempre, como ocurre con los objetos sueltos, si no fuera por algunos accesorios utilizados en los procesos de esterilización como son las bolsas de esterilizar. Por ejemplo, las bolsas usadas en odontoestomatología para estos procesos tienen, normalmente, una cara transparente, con el fin de ver el contenido y una cara opaca similar en textura al papel corriente. Este papel está fabricado de un modo especial y su entramado tiene la peculiaridad: de que transpira vapor sobrecalentado de agua por encima de los 100 ºC, pero es impermeable al agua por debajo de este valor. Lo cierto es que se empapan con facilidad obligando a labores de secado fuera del equipo. Cuando comienza la fase de expulsión del vapor y cae la presión y la temperatura en el interior, los poros de la bolsa se cierran atrapando parte del vapor. Este vapor se condensa y produce gotas que junto con el aire atrapado en su interior se convierten en agentes de la corrosión del instrumental. Lo que sí puede ser una buena práctica es elegir bolsas adecuadas en tamaño a lo que queramos esterilizar e intentemos extraer en lo posible el aire de su interior con las propias manos. Vemos que el aire con su contenido en oxígeno es muy dañino para el proceso. Todo lo que se ha dicho es válido para los empaquetados manuales con paños de esterilización. El funcionamiento del autoclave El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases:  Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.  Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización.  Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a poco.

Tipos de ciclos de esterilización Autoclaves clase N: Del inglés NAKED = desnudo, sirven exclusivamente para la esterilización de productos sólidos. Los instrumentos esterilizados no se pueden transportar ni almacenar, debe ser instrumental de uso inmediato. Autoclaves clase B: Del inglés BIG = grande, esterilizan cualquier tipo de carga que puede procesar un gran esterilizador: carga sólida, porosa, hueca, todo ello empaquetado (con simple o doble capa). Esos esterilizadores ya tienen un ciclo específico para probar la penetración del vapor. Para todos los productos envueltos o no envueltos. Sólidos, porosos y de carga hueca tipo A (longitud/diámetro >5). Cumplen las exigencias más elevadas en cuanto a seguridad y funcionamiento. Disponen de ciclos gravitatorios y de vacío, incluyendo ciclos para priones. Disponen de ciclos de test de penetración y de vacío. Tienen procesadores de datos y registro obligatorio de los mismos. Autoclaves clase S: Del inglés SPECIFIC = especificado, son esterilizadores que tienen ciclos definidos por el fabricante, con programas para material sólido empaquetado, material poroso, así como dispositivos con lúmenes de diámetros y longitudes determinados. Son equipos que habitualmente incorporan bomba de vacío. Tipos de carga Los tipos de carga que se pueden introducir en un autoclave para esterilizar son los siguientes: Carga sólida: son artículos no porosos, sin ranuras ni fisuras u otras características que puedan obstaculizar la penetración del vapor en el material, ejemplos de carga sólida son pinzas, limpiadores de sarro, porta agujas, espejo. Carga porosa: material que puede absorber los fluidos, ejemplos de carga porosa serían batas de cirugía y gasas. Carga hueca de tipo A: longitud/diámetro >5mm, ejemplo de carga hueca de tipo A sería una turbina. Carga hueca de tipo B: longitud/diámetro <5mm, un ejemplo de carga hueca de tipo B sería una cánula para cirugía.

Medidas preventivas Se deben seguir en todo momento las indicaciones del manual de instrucciones del equipo, este debe estar al menos en castellano.

Instalación: Situar el equipo cerca de una toma de corriente adecuada al consumo de la máquina. Nivelarlo correctamente mediante las patas o inmovilizar mediante topes, dependiendo del tipo de autoclave, para darle estabilidad. Fijar una manguera en la boca de salida de agua/vapor y fijar el otro extremo a un recipiente o desagüe procurando no obstruir el paso. No instalar este tipo de equipos en zonas en la que se almacenen líquidos inflamables o en zonas de protección especial. Utilización: Antes de cargarlo:  Antes de usar el autoclave, se debe comprobar el interior de la cámara del autoclave por si pudiera haber algún artículo dejado por la última persona que lo usó y que pueda ser un peligro.  Comprobar que el colador de escurrimiento esté limpio.  Comprobar que las gomas de sellar de la puerta no estén deterioradas sino que no presentan defectos visibles y son flexibles. Para cargarlo:  Cargar el autoclave según las recomendaciones del fabricante. No sobrecargar el autoclave.  No cargar en exceso las bandejas, gradillas o cestos, procurando dejar siempre un espacio entre ellos de al menos 1 o 2 cm.  Utilizar recipientes preparados para soportar la temperatura de esterilización y asegurarse de que son compatibles con el proceso de esterilización autoclave.  Los recipientes con líquidos deben estar en una bandeja de plástico resistente al calor con unos 2,5 cm. de agua.  Para prevenir que las botellas exploten durante la presurización, las tapas de los envases con líquidos deben aflojarse antes de cargarlos en el autoclave.  Las piezas individuales de vidrio deben estar en una bandeja de plástico resistente al calor, en una rejilla o estante, nunca deben colocarse directamente en la superficie inferior de la cámara del autoclave.  Comprobar que la puerta del autoclave esté completamente cerrada y con el pasador.  Nunca se debe sobrepasar la presión máxima del equipo (la especificada en manual de instrucciones).  También se debe comprobar, antes de comenzar el ciclo, que se ha seleccionado el ciclo correcto para los artículos que van a ser esterilizados. Al abrirlo:  No abrir el equipo hasta qué el manómetro esté a cero y la válvula de vapor abierta.  Usar el equipo de protección personal adecuado (EPI), incluyendo guantes de protección contra contactos térmicos para coger el material si se encuentra a elevadas temperaturas, bata de laboratorio, protección para los ojos y zapatos cerrados cuando abra la puerta del autoclave después de un ciclo.  Si hay peligro de pinchazos o cortes con artículos punzantes / cortantes usar guantes resistentes al calor y de protección contra riesgos mecánicos.



Cuando el ciclo esté terminado, abrir la puerta lentamente y mantener la cabeza, la cara y las manos alejadas de la puerta. Una vez finalizada la esterilización, hay que tener en cuenta las siguientes consideraciones en función del material que se esterilice:

Sólidos (instrumental). Podrá desvaporizarse rápidamente abriendo la válvula de vapor y vaciando el agua de la cubeta mediante la apertura de la manecilla de desagüe. Líquidos (medios de cultivo, etc.). Dejar que vuelvan a la temperatura ambiental por sí solos o, en último extremo, abriendo muy ligeramente la válvula de vapor. La descompresión rápida de líquidos provoca la rotura de frascos o el derrame de líquidos. NOCIÓN DE PROPAGACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Es el proceso de propagar microorganismos de forma artificial creándoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo. Mediante una siembran, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Desde que comenzó a establecerse la naturaleza microbiana de muchas enfermedades. Se inició un gran interés por el desarrollo de métodos que permitieran propagar y conservar durante largos periodos, a todos aquellos gérmenes causantes de enfermedades con el objetivo de facilitar su estudio morfológico, fisiológico y ecológico. Hoy en día se han desarrollados numerosos métodos para la obtención de cultivos puros y mixtos de muchas especies microbiológicas. Condiciones de almacenamiento de los medios de cultivo La mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados y éstos se deben conservar de la siguiente forma:  

Frescos, secos, sin luz solar y algunos en nevera (Ej. Salmonella). Aperturas y cierres los menos posibles para que los productos no capten humedad.

Cuando los medios son preparados tanto por empresas como por el propio Laboratorio, se deben almacenar teniendo en cuenta:  

La temperatura ha de estar entre 2-8ºC. Se conservarán entorno a 4-6 semanas. Si es necesario refundir, se hará al baño María o en autoclave 5 min.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno

adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medias sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. 3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 6- Ph: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 7- Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios. 8- Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante) La evolución de los medios de cultivo Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución. La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

CONCLUSIÓN La esterilización es un proceso fundamental en distintos sectores, en este caso indagamos respecto al área de laboratorios al momento de tomar muestras pues para evitar una contaminación accidental la prueba debe llevarse a cabo en buenas condiciones. Los envases de las muestras deben desinfectarse previamente a su análisis. Un aparato que comúnmente se utiliza es el autoclave. El autoclave es un instrumento usado para esterilizar material de laboratorio, funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida. La esterilización, tanto del material y medios contaminados, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro. En síntesis un autoclave es un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias a aumentar la presión. La propagación de medios de cultivo es el proceso de crear microorganismos de forma artificial creándoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo. Desde que se inició este método se logró propagar y conservar durante largos periodos a gérmenes que causan enfermedades con el propósito de facilitar el estudio y la forma de reproducción. Para poder mantener un cultivo de bacterias de manera estable y que no se contamine se deben conservar deshidratados y de preferencia secos y que no les dé directamente la luz solar, en neveras dependiendo de que sea.

EGRAFIA

https://www.quiminet.com/articulos/prueba-de-esterilidad-34285.htm https://www.educarex.es/pub/cont/com/0055/documentos/10.../El_autoclave.pdf http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm https://www.ecured.cu/Cultivo_de_microorganismos#Medio_de_cultivo https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/esterilizaciondesinfeccion-y-antisepsis/autocave