Proyecto Final

Subsidio a la Investigación en Bioquímica Molecular y Proteómica 2008

Proyecto Final 2008:

Neovascularización en un modelo murino de Shock séptico

Autores: Federico Mauas Pablo Kuleff

Directora: Dra. Eulalia de la Torre

Laboratorio de Inmunofarmacología tumoral Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO) CONICET Facultad de Medicina-UBA 2008

RESUMEN

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Neovascularización en un modelo murino de Shock séptico La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes, en cambio, la vasculogénesis es el proceso de formación de vasos sanguíneos a partir del ensamblaje de angioblastos. Por otro lado, el shock séptico inducido por infecciones bacterianas, afecta al miocardio y al sistema

vascular

sanguíneo.

El

daño

es

causado

por

los

propios

microorganismos infectantes o sus endotoxinas y puede ser potenciado por el infiltrado de células del sistema inmune en el miocardio. No se conoce el rol de los miocardiocitos ni el de las células del sistema inmune en la angiogénesis inflamatoria durante el shock séptico. Teniendo en cuenta que el proceso de neovascularización puede contribuir al agravamiento o a la reparación del tejido cardiovascular dañado, nos propusimos investigar la angiogenicidad de los miocardiocitos y de los macrófagos peritoneales en un modelo de infección aguda por lipopolisacárido de E. coli en ratones BALB/c. Nosotros demostramos que los miocardiocitos murinos son inductores de angiogénesis y el tratamiento de estas células in vitro con LPS estimula la liberación de moléculas que participan del proceso angiogénico. Además, los macrófagos peritoneales son inductores de angiogénesis y la infección con LPS potencia el efecto pro-angiogénico lo que los habilitaría como moduladores de dicha respuesta en el miocardio.

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ABSTRACT

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Neovascularization in a murin model of Septic Shock. The angiogénesis is the formation of new blood vessels from other preexisting; however, the vasculogenesis is the process of formation of blood vessels from the assembly of angioblasts. On the other hand, the septic shock induced by bacterial infections, affects to the myocardium and the sanguineous vascular system. The damage is caused by the infecting microorganisms themselves or their endotoxins and it can be enhanced by the infiltration of cells of the immune system in the myocardium. The role of both myocardiocytes and the cells of immune system in the inflammatory angiogenesis during the septic shock is not known. Considering that the neovascularization process can contribute to the worsening or the repair of the damaged cardiovascular tissue, we set out to investigate the angiogenicity of myocardiocytes and peritoneal macrophages in a model of acute infection by E. coli lipopolysaccharide in BALB/c mice. We demonstrated that the murin myocardiocytes induce the angiogenesis and the treatment of these cells in vitro with LPS stimulates the release some molecules that participates in the angiogenic process. In addition, the peritoneal macrophages were angiogenic per se and the infection with LPS potentate the pro-angiogénic effect which qualify them like modulators of this answer in the myocardium.

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ÍNDICE

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RESUMEN……………………………………………………………………… 2 ABSTRACT…………………………………………………………………...... 4 ÍNDICE…………………………………………………………………………... 6 INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 9 1. NEOVASCULARIZACION…………………………………………………. 10 1.2. Aspectos generales de la angiogénesis………………………...….. 10 1.3. Etapas del proceso angiogénico...................................................... 11 1.4. Shock séptico y neovascularización............................................... 14 1.5. Neovascularización y productos inflamatorios……………………..16 OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS............................................17 MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..19 2. ANIMALES USADOS EN LOS ENSAYOS............................................20 3. OBTENCIÓN DE LOS MIOCARDIOCITOS...........................................20 4. OBTENCIÓN DE MACRÓFAGOS.........................................................21 5. ENSAYO DE ANGIOGÉNESIS IN VIVO................................................22 5.1. Preparación de Homogenato de piel................................................24 6. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.......................................................24 7. INMUNODETENCIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR-A; PECAM-1 Y METALOPROTEASA-9...............................25 7.1. Ensayos de western blot (Wb)…………...........................................25 7.2. Obtención del tumor de 14 días...................................................... 26 8. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS OXIDO NÍTRICO SINTASAS..................................................................................................27 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO......................................................................27

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10. REACTIVOS GENERALES................................................................ 28 11. EQUIPAMIENTO.................................................................................29 RESULTADOS………………………………………………………………….30 12. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS......................31 13. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS........................... 37 14. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.....................................................39 DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 42 15. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS..................... 43 16. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS........................... 43 17. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.................................................... 45 CONCLUSIONES…………………………………………………………...…. 46 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………48

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INTRODUCCIÓN

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El concepto de angiogénesis surgió en los años 70. Fue el estadounidense Judah Folkman (24 de febrero de 1933 - 14 de enero de 2008) quien empezó a hablar del mecanismo de la angiogénesis. 1. NEOVASCULARIZACIÓN

1.2. Aspectos generales de la angiogénesis La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes y comprende una secuencia de eventos que es fundamental para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo embrionario, la reparación de heridas, la formación del cuerpo lúteo y del endometrio uterino en el ciclo menstrual durante la adultez. En cambio, la vasculogénesis es el proceso de formación de vasos sanguíneos a partir del ensamblaje de angioblastos, precursores endoteliales diferenciados, en una red vascular primitiva. Subsecuentemente, las células endoteliales proliferan y el lecho vascular naciente se expande y remodela formando una red madura que posibilita la circulación sanguínea, siendo éste el proceso que se denomina angiogénesis (Carmeliet P, 2000). Además, colaboran otras células de soporte, como los pericitos y células musculares que favorecen la maduración y el funcionamiento de los vasos sanguíneos. Entre estas células existe una matriz extracelular (MEC) especializada que se denomina lámina basal. En controlada

condiciones mediante

fisiológicas, el

equilibrio

la

angiogénesis de

factores

está

estrictamente

anti-angiogénicos

y

proangiogénicos. Un cambio en el balance a favor de los factores proangiogénicos puede conducir a un crecimiento inadecuado de los vasos sanguíneos, desempeñando un papel esencial en una serie de patologías: la ateroesclerosis, la artritis reumatoidea, la psoriasis, la retinopatía diabética y el crecimiento tumoral. Así por ejemplo, en la artritis el crecimiento de un pannus

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vascular puede estar mediado por una concentración excesiva de factores angiogénicos producidos por los macrófagos (Mfs) infiltrantes, otras células del sistema inmune o células inflamatorias. Asimismo, otras patologías como la isquemia del miocardio o de los miembros inferiores, mejorarían mediante la promoción de la formación de vasos sanguíneos funcionales por factores pro-angiogénicos (Carmeliet P, 2003).

1.3. Etapas del proceso angiogénico La angiogénesis clásica o brotación es un proceso complejo que consta de varias etapas que están muy reguladas en el tiempo y en el espacio. Cada paso implica una complicada interrelación entre reactividad celular, factores solubles y componentes de la MEC. Diversas señales son capaces de iniciar el proceso angiogénico, principalmente el estrés metabólico y la hipoxia pero también la respuesta inmune o inflamatoria. En un intento de simplificación, el proceso angiogénico puede esquematizarse en cuatro etapas, cada una de las cuales supone un posible blanco para su intervención farmacológica (Fig. 1). Puede comenzar por la activación de las células endoteliales bajo la acción de una serie de citoquinas angiogénicas y de otros mediadores fisiológicos. Entre los factores de crecimiento promotores de la angiogénesis que están mejor caracterizados, se destacan algunos factores de tipo polipeptídico tales como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento placentario (PlGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Fig. 1 A). Otros mediadores solubles de la angiogénesis son el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el óxido nítrico (NO). La activación del endotelio quiescente por acción de las citoquinas mencionadas suele tener lugar mediante la unión a sus respectivos

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receptores del tipo tirosina quinasa. Algunos de estos receptores se expresan preferentemente en células endoteliales, como es el caso de los dos receptores de VEGF, denominados VEGFR-1/Flt-1 y VEGFR-2/Flk-1 (Yancopoulos GD y col., 2000). También se ha descrito un tercer receptor del tipo tirosina quinasa, el VEGFR-3, relacionado estructuralmente con los anteriores y que parece estar expresado en el endotelio linfático.

Una vez que las células endoteliales se activan por acción del estímulo angiogénico, su fenotipo cambia notablemente. Además de producirse un cambio en su forma, de plana a redondeada, se produce la liberación de una serie de proteasas que le permitirán degradar su membrana basal. Para esto se requiere la separación de los pericitos que recubren la pared del vaso sanguíneo. Aunque diversas familias de proteasas han sido implicadas en el proceso de la angiogénesis, las que parecen tener un papel más importante son el activador del plasminógeno y las metaloproteasas de la MEC (MMPs). Estas últimas participan en situaciones que requieren angiogénesis, tales como

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la artritis y la cicatrización de heridas. Algunos factores angiogénicos, tales como VEGF, FGF, TNF- e interleuquina-1 (IL- 1) estimulan la producción de MMP-1, MMP-3 y MMP-9 por las células endoteliales. Durante la angiogénesis, la acción degradadora ejercida por las enzimas proteolíticas participa en al menos tres pasos del proceso: ruptura de la membrana basal, migración de las células endoteliales y formación del lumen vascular (Fig. 1 B). En respuesta al estímulo angiogénico, las células endoteliales migran desde el lecho vascular hacia dicho estímulo, invadiendo el tejido conectivo y el parénquima (Fig. 2 A). El proceso de diferenciación de las células endoteliales para dar lugar a la formación de capilares no está completamente caracterizado, aunque debe estar perfectamente controlado de modo que las células endoteliales que proliferan no ocluyan el lumen de los capilares que se van formando. A medida que el nuevo brote se forma, algunas de las células vuelven al estado de reposo para formar las paredes de los nuevos capilares y

comienzan a

producir la MEC y la membrana basal necesarias para estabilizarlos (Fig. 2 B) (Rundhaug JE, 2005).

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1.4. Shock séptico y neovascularización El shock séptico es una de las enfermedades más complejas, que sobreviene al manejo de una infección severa y cuyas manifestaciones son la hipotensión y la falla multiorgánica. El daño de las células cardíacas puede conducir a la muerte por fallo cardíaco. Esta enfermedad, que es un proceso inflamatorio sistémico, es la principal causa de muerte en los pacientes internados en las unidades de cuidados intensivos. Las bacterias Gram- y sus toxinas son un grupo de patógenos que causan esta enfermedad (Parrillo JE, 1993). El LPS (lipopolisacárido), que es una endotoxina derivada de las paredes celulares de bacterias Gram- con actividad inflamatoria, es un potente estimulador de la respuesta efectora, principalmente de los macrófagos en el sistema inmune. Cuando ingresa en un organismo se asocia a una proteína de unión al LPS (LBP), el complejo LPS-LBP interactúa con el CD14 que es un receptor que sintetizan y expresan los macrófagos. Luego el complejo LPS-LBP-CD14 activa al receptor tipo Toll 4, el cual desencadena diferentes cascadas de señalización que llevan a la activación de distintos factores de como el NF-kB y AP-1, que promueven la transcripción de genes de numerosas moléculas inflamatorias como son el Factor de necrosis tumoral (TNF) o Interleuquinas (IL) generando una respuesta inflamatoria local o sistémica (Karima R y col., 1999) (Figura 3). Si bien se conocen los blancos de la secuencia patogénica en el shock séptico

(Toxinas

bacterianas

→

activación

de

proteínas

plasmáticas;

monocitos/macrófagos, células endoteliales → liberación de mediadores proinflamatorios → depresión del miocardio; vasodilatación →disfunción orgánica por efectos metabólicos) poco se conoce a cerca del efecto de los patógenos sobre la capacidad angiogénica de los macrófagos en esta enfermedad.

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Cascada de señalización

Activación de factores de trascripción Transcripción de genes Respuesta inflamatoria

Figura 3: Vía de señalización del LPS.

Se ha demostrado en un modelo in vitro, que frente a estímulos que favorecen la angiogénesis, los macrófagos pueden adquirir marcadores endoteliales (CD34+) e insertarse en estructuras tubulares semejantes a vasos sanguíneos (Schmeisser A y col., 2001). En nuestro laboratorio demostramos que los macrófagos son células promotoras de la angiogénesis tumoral en un modelo murino de cáncer de mama por liberación de VEGF-A y productos inflamatorios como PGE2 (de la Torre E y col., 2005)

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1.5. Neovascularización y productos inflamatorios Las señales que inician y sostienen la angiogénesis son múltiples y complejas: incluyen citoquinas y factores de crecimiento como: VEGF, TGFβ, FGF, PDGF, angiopoyetinas, IL-8, secretados por las células inflamatorias (mastocitos, macrófagos, etc.) que infiltran el tejido inflamado. Entre estos mediadores el más estudiado es el VEGF-A, que se sintetiza por estímulos como la hipoxia o la isquemia. Cuando este mediador se une a sus receptores de los subtipos 1 y 2 estimula la movilización de precursores endoteliales sanguíneos de médula ósea vía MMP-9, la quimiotaxis de monocitos que estimulan la arteriogénesis cardíaca, efectos antiapoptóticos sobre las células endoteliales y la vasodilatación y reperfusión cardíaca vía NO (Molin D y Post MJ, 2007). Estos resultados provienen de modelos experimentales de isquemia y reperfusión quirúrgica, pero no se tienen antecedentes en modelos de shock por infección aguda con LPS bacteriano. En una respuesta inflamatoria frente a patógenos, se considera a la modulación de la expresión de NOS-2, COX-2 y MMPs como parte de la maquinaria defensiva que se pone en marcha en esa circunstancia. Estas enzimas modulan otro aspecto no menos importante de la respuesta inflamatoria como es la angiogénesis y/o arteriogénesis cardíaca, que es un mecanismo compensatorio al daño del tejido y cuyo desarrollo y manejo farmacológico son escasamente conocidos en estas enfermedades.

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OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS

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El shock séptico inducido por infecciones bacterianas afecta al miocardio, a las células del sistema inmune y a la microcirculación. El daño es causado por los propios microorganismos o sus endotoxinas induce la liberación de sustancias vasoactivas, a nivel de capilares, vénulas y arteriolas promoviendo, un fenómeno vascular trombótico. Teniendo en cuenta que el proceso de neovascularización puede contribuir al agravamiento o a la reparación del tejido dañado, en un modelo murino de infección aguda por LPS nos proponemos:



Investigar la capacidad de los miocardiocitos para inducir neovascularización o Cuantificar la respuesta neovascular in vivo. o Determinar la expresión de VEGF-A y CD-31.



Caracterizar el papel de los macrófagos como inductores de la respuesta angiogénica o Cuantificar la respuesta vascular inducida por macrófagos o Determinar la expresión de VEGF-A y CD-31



Estudiar la participación de proteínas inflamatorias durante el proceso angiogénico o Carcacterizar la expresión y actividad de Oxido Nitrico Sintasa 2 (NOS-2) o Caracterizar la expresión y actividad de metaloproteasa-9

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MATERIALES Y MÉTODOS

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2. ANIMALES USADOS EN LOS ENSAYOS. Se utilizaron ratones hembra de la cepa BALB/c endocriados de 3 meses de edad, provistos por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Los animales fueron mantenidos siguiendo los procedimientos indicados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH, 1986). 3. OBTENCION DE MIOCARDIOCITOS. Ratones BALB/c de 1 a 3 días de vida fueron sacrificados y los corazones removidos asépticamente y mantenidos en solución salina de Hanks a pH 7,4 en hielo. Luego de 3 lavados, se disgregaron en pequeños fragmentos. Las células fueron disociadas con tripsina 0.25% peso/vol en HBSS y mantenidas a 37°C. Se descartaron aquellas de la primera digestión, mientras que a las de las digestiones siguientes se les agregó un mismo volumen de HBSS frío con Ca2+ - Mg2+ HBSS (g/l): 0.14 CaCl2, 0.047 MgCl2, 0.049 MgSO4, 0.35 NaHCO3 y 1 D-glucosa, pH 7,4 hasta obtener todas las células aisladas. La suspensión celular obtenida se centrifugó a 200 xg durante 8 min. y luego se resuspendió en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB). Para excluir las células no musculares, se colocaron las células aisladas en placas de cultivo a 37° C durante 2 h bajo una atmósfera saturada en agua y 5% CO 2. Luego, se recolectaron las células no adheridas y se colocaron en placas de cultivo a una densidad de 105 células/cm2 en 10% SFB-DMEM. Luego de 24 h se les cambió el medio por otro conteniendo 0,1% SFB-DMEM (Auki MP y col., 2004). En los ensayos in vitro los miocardiocitos (MC) fueron tratados con 1, 10 y 100 µg/ml de lipopolisacárido (LPS) de E. coli (serotipo 026:B6; Lote 50K4117) que se cultivaron durante 24 h. Luego se obtuvieron los sobrenadantes de cultivos y se realizaron lisados celulares utilizando 400 µl de buffer de lisis: NaCl 100 mM, EGTA 10 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8, Tritón X-100

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1%, PMSF 1 mM, leupeptina 10 µg/ml, aprotinina 10 µg/ml. Después de 30 min. en hielo, se centrifugaron a 10.000 rpm por 10 min. a 4°C. Las muestras se conservaron a –80 ºC y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976). 4. OBTENCION DE MACRÓFAGOS. Se inocularon 5 ml de medio D-MEM:F12 con 10% de SFB en forma intraperitoneal (i.p.). Por lavado peritoneal se recuperaron suspensiones celulares que se dejaron adherir al plástico en placas de Petri durante 2 h. a 37°C. Luego de realizar 2 lavados con PBS, las células adheridas (Mfs) de animales sin tratamiento o tratados con 100 µg/ml de LPS de E. coli se recuperaron por raspado y se resuspendieron en medio de cultivo (Fig. 4). La viabilidad de las células se determinó por el ensayo de exclusión con azul Trypán y sólo se utilizaron suspensiones con una viabilidad mayor al 95%.

Inoculación i.p. de LPS

Sacrificio y obtención de células peritoneales (6 ó 24 h. post-inoculación)

Adhesión al plástico durante 2 h. a 37ºC.

Mfs Obtención de macrófagos por raspado Mfs+LPS

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Figura 4: Obtención de macrófagos (Mfs) peritoneales.

5. ENSAYO DE ANGIOGÉNESIS IN VIVO Se utilizó un ensayo semejante al de angiogénesis inducida por células tumorales (TIA). (Monte M y col., 1997) En el mismo, se inocularon hembras BALB/c por vía intradérmica (i.d.) en ambos flancos con 3x105, 4x105, 5x105 ó 106 de MC o con Mfs, obtenidos como se indicó en los items 2 y 3 respectivamente, en un volumen total de 0,1 ml de medio D-MEM:F12 sin SFB y se agregó azul Tripán para localizar el sitio de inoculación. En el caso de los Mfs, fueron tratados con LPS 100 µg/ml durante 24 h. e inoculados. También se utilizaron controles sin tratamiento. El ensayo es singeneico para evitar reacciones inmunológicas debidas a diferencias antigénicas entre el receptor y las células inoculadas. Luego de 5 días, los animales se sacrificaron con éter y se separó por disección la piel de los tejidos adyacentes. La respuesta vascular se observó en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección WILD. El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm2 de piel.

Para ello se fotografiaron los sitios de inoculación, se

proyectaron sobre una cuadrícula y se contó el número total de vasos (Fig. 5). La densidad de vasos (δ) se determinó por la fórmula:

δ=

Σ Número de vasos en cada cuadrado Número total de cuadrados

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Mfs o Mfs+LPS (in vitro)

Mfs en suspención

i.d.

Sacrificio (5 días post-inoculación)

Exposición de la cara interna de la piel y obtención de fotografías

Conteo de los vasos sanguíneos sobre una cuadrícula Cálculo de la δ (Número de vasos / mm2)

Figura 5: Esquema del ensayo de angiogénesis in vivo en un modelo singeneico.

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5.1. Preparación de homogenatos de piel Se obtuvieron muestras de piel del sitio de inoculación desprovistas de pelo, de animales inoculados con MC o Mfs tratados o no con LPS 100 µg/ml y piel proveniente de animales sin tratamiento (control). Para obtener los homogenatos se sacrificaron los animales 5 días después de la inoculación y se retiro la piel que rodea al sitio inoculado. Las muestras se homogeneizaron en buffer: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH: 7,4, EDTA 1 mM, SDS 0,1%, Triton X-100 1%, PMSF 1 mM, deoxicolato de sodio 1%, leupeptina 5 µg/ml, aprotinina 5 µg/ml a 4°C. Los homogenatos se guardaron a –80°C y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976).

6. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS Se inocularon ratones hembra con LPS 0,1 mg en 0,1 ml de PBS. Los animales se sacrificaron 6 ó 24 h. post-inoculación y se obtuvieron los Mfs peritoneales, que se cultivaron adheridos a placas de Petri. Luego de 24 h. se obtuvieron los sobrenadantes de cultivos y se prepararon lisados celulares. Para esto se lavaron los Mfs 2 veces con PBS frío y resuspendidos en 400 µl de buffer de lisis: NaCl 100 mM, EGTA 10 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8, Tritón X-100 1%, PMSF 1 mM, leupeptina 10 µg/ml, aprotinina 10 µg/ml. Después de 1 h. en hielo, se centrifugaron a 10.000 rpm por 10 min. a 4°C. Las muestras se conservaron a –80 ºC y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976).

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7. INMUNODETECCIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE ENDOTELIO VASCULAR-A, PECAM-1 Y METALOPROTEASA-9 La producción de VEGF-A, PECAM-1 y MMP-9 se determinó en homogenatos de piel obtenidos en 4.1. y en los lisados celulares obtenidos en 5. En estos últimos también se estudio la expresión de NOS2 y CD40. 7.1. Ensayos de Western blot (Wb) Se sembraron 30 µg de proteínas por calle de los homogenatos de piel, lisados celulares y sobrenadantes de cultivo. Luego se sometieron a una electroforesis en geles de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 7,5% ó 10%. También se sembraron estándares de peso molecular conocido. Las muestras se sometieron a una electroforesis a 80 v en un gel concentrador y a 100 v en un gel separador. La composición del gel concentrador es: TrisHCl 0,125 M, SDS 0,1%, acrilamida/bis acrilamida 13%, persulfato de amonio 0,1%, TEMED 0,1%; pH:6,8; y la del gel separador de SDS-PAGE al 7,5 % es: Tris-HCl 0,375 M, SDS 0,1%, acrilamida/bis acrilamida 25%, persulfato de amonio 0,1%, TEMED 0,1%; pH:8,8. Para el gel separador de SDS-PAGE al 10 % se utilizaron: Trís-HCl 0,375 M; SDS 0,1%; acrilamida/bis acrilamida 30%; persulfato de amonio 0,1%, TEMED 0,1%; pH: 8,8). Luego de la electroforesis, las proteínas se transfirieron por el método líquido a una membrana de nitrocelulosa durante 1 h aproximadamente a 100 v en buffer de transferencia: Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% (v/v), pH: 8,2. Para verificar la eficiencia de la transferencia las membranas de nitrocelulosa se colorearon con rojo Ponceau. Después de varios lavados con Tris-HCl 20 mM y NaCl 500 mM (TBS) se incubaron las mismas con solución

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de bloqueo TBS con Tween 20 al 0,05% (TBS-T) que contiene 5% de leche descremada durante 1 h. a temperatura ambiente. Posteriormente las membranas se incubaron durante 18 h. con los anticuerpos policlonales obtenidos en cabra contra VEGF-A, PECAM-1, MMP9, NOS2 y CD40 todos de origen murino, diluido en TBS-T con 5% de leche descremada. Luego de cuatro lavados con TBS-T se agregó el segundo anticuerpo policlonal contra IgG de cabra hecho en conejo conjugado con peroxidasa diluido 1:40000 en TBS-T con 5% de leche descremada durante 1 h. con agitación. Después de lavar tres veces con TBS-T, se revela mediante la técnica de quimioluminiscencia para la cual se utiliza como sustrato una solución de luminol. Tras incubar la membrana unos minutos en solución de revelado se eliminó el exceso de reactivo, procediéndose a la exposición en oscuridad sobre una película radiográfica. En todos los casos, como control negativo se sembró una calle que no fue incubada con el primer anticuerpo. Los pesos moleculares de las bandas proteicas se identificaron por comparación de sus Rf con los estándares de peso molecular conocidos. La cuantificación se realizó por densitometría en un analizador de imágenes computarizado. La expresión de la proteína actina se utilizó como control de carga constante en cada calle en todos los ensayos realizados. La concentración proteica de las bandas se expresó en unidades de densidad óptica por mm2 (D.O./mm2). 7.2. Obtención del tumor de 14 días. Los ratones portadores de tumor se obtuvieron por inoculación subcutánea (s.c.) en el flanco de 4x105 células LMM3, derivada de una metástasis pulmonar del adenocarcinoma mamario murino M3 de aparición espontánea en la cepa BALB/c previamente caracterizadas en el Instituto de Oncología A. H. Roffo (Urtreger A y col., 1997), en 0,1 ml de D-MEM sin SFB. Transcurridos 14 días se sacrificó al animal y se obtuvo el tumor, el cual se

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homogenizó en buffer: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH: 7,4, EDTA 1 mM, SDS 0,1%, Triton X-100 1%, PMSF 1 mM, deoxicolato de sodio 1%, leupeptina 5 µg/ml, aprotinina 5 µg/ml a 4°C. El homogenato se guardó a –80°C y la concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976). Dicha muestra se utilizó como control positivo en todos los ensayos de Wb realizados.

8. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ÓXIDO NÍTRICO SINTASAS Se utilizaron placas de 6 pozos y se sembraron los MC o los Mfs que se incubaron a 37ºC en 1 ml de D-MEM:F12 con o sin agregado de 5% de SFB, respectivamente. Después de 24 h. la actividad de NOS se determinó midiendo la concentración de nitrito (NO-2) en los sobrenadantes de cultivo por medio del ensayo de Griess. Para esto se tomaron 100 µl del sobrenadante de cultivo de las células y se agregó igual volumen del reactivo de Griess, que consiste en partes iguales de ácido sulfanílico al 1% en ácido acético al 30% y naftiletilendiamina al 0,1% en ácido acético al 60% (Green LC y col, 1982). La variación de color se detectó midiendo la absorbancia a 540 nm en un lector de ELISA. La concentración de las muestras se determinó por extrapolación de los valores obtenidos de una curva standard realizada a partir de una solución acuosa 2 M de NaNO2. Los resultados se expresaron en concentración micromolar de nitrito por miligramo de proteína (µM /mg de prot.).

9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se utilizaron los ensayos de Kruskal Wallis o Tukey para comparar el valor de las medias y las diferencias entre ellas se consideraron significativas cuando p<0,05.

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10. REACTIVOS GENERALES -

Acetato de sodio (Merck)

-

Ácido acético (Berna).

-

Ácido clorhídrico (Merck).

-

Ácido etilenglicoltetracético (Merck).

-

Ácido sulfanílico (Merck.

-

Ácido sulfúrico (Cicarelli).

-

Acrilamida (Promega).

-

Albúmina sérica bovina (Sigma).

-

Anticuerpo policlonal obtenido en cabra contra PECAM-1 de origen murino (Santa Cruz Biotechnology).

-

Anticuerpo policlonal obtenido en cabra contra VEGF-A de origen murino (Santa Cruz Biotechnology).

-

Anticuerpo policlonal obtenido en cabra contra NOS2 de origen humano (Santa Cruz Biotechnology).

-

Anticuerpo policlonal obtenido en cabra contra IgG de conejo conjugado con peroxidasa (Sigma).

-

Aprotinina (Sigma).

-

Azida sódica (Merck).

-

Azul tripán (Sigma).

-

Bicarbonato de sodio (J.T. Baker).

-

Bis/poliacrilamida (Bio Rad).

-

Cloruro de magnesio (Merck).

-

Cloruro de sodio (Merck).

-

D-MEM (GIBCO).

-

Deoxicolato de sodio (Sigma).

-

Ditiotreitol (Sigma).

-

Dodecil sulfato de sodio (Sigma).

-

Estándares de peso molecular (Bio Rad).

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-

Etanol (Soria).

-

Éter etílico (Biopack).

-

Etilendiaminotetracético (Merck).

-

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma).

-

Glicina (Invitrogen).

-

Leupeptina (Sigma).

-

Metanol (Cicarelli).

-

Naftilendeamina (Sigma).

-

Nitrato de sodio (Merck).

-

Nitro azul de tetrazolio (Sigma).

-

N, N, N`, N`-di-dimetilaminoetanol (Bio Rad).

-

Ortovanadato de sodio (Sigma).

-

Persulfato de amonio (ICN Biomedicals Inc.).

-

Suero fetal bovino (GENSA).

-

Trietilamina (Merck).

-

Tripsina (GIBCO).

-

Tris-HCl (Promega Corporation)

-

Tritón X-100 (J.T. Baker).

-

Tween 20 (Sigma).

-

Urea (Fluka).

11. EQUIPAMIENTO Estufa de Cultivo Forma Scientific. Homogenizador IKA T25 Digital Ultraturrax. Espectrofotómetro GBCO UV/VIS 911. Lector de Elisa BIO-RAD. Centrifuga Sorvall RC-SB. Fuente para electroforesis en minigeles BIO-RAD. Mini Protean 3 System BIO-RAD. Micropipetas HT.

29

RESULTADOS

30

12. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS La neovascularización o angiogénesis es un proceso que permanece quiescente en la vida adulta excepto durante procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario y la reparación de heridas, procesos que se encuentran altamente regulados. Por el contrario en situaciones patológicas como la psoriasis, el cáncer o el shock séptico, proceso inflamatorio agudo generado por infección, la angiogénesis pierde su regulación. Por lo tanto se evaluó la capacidad angiogénica de MC obtenidos por digestión enzimática de corazones de neonatos de la cepa BALB/c. En la Figura 6 se muestra que la inoculación de 5x105 ó 106 MC induce un aumento significativo del número de vasos sanguíneos (5x105: 1,85±0,21; 106: 2,19 ± 0,45; n=4) con respecto al control de piel normal (1,01±0,13; n=4). En el panel inferior se muestran fotografías del sitio angiogénico de la piel inoculada con MC (b-c), observándose que dichas células producen una marcada formación de microvasos con “loops” con respecto a la piel normal.

2

Nº de vasos/mm de piel

3

** *

2

1

0

5

Control

3.10

5

5.10

6

10

MIOCARDIOCITOS

31 b

Figura 6: Angiogénesis inducida por miocardiocitos. Los resultados se expresaron como Nº de vasos/mm2 de piel. Los valores son promedios ± E.S. de n=4 *p<0,01 y **p<0,001 vs. Piel normal A (Control) (panel superior). Fotografía del sitio angiogénico: a) Control; neovascularización inducida por b) 5x105 MC y c) 106 MC (panel inferior). 117 kDa PECAM-1 2 Los D.O./mm ensayos de3,1angiogénesis se con el estudio de la 2,8 2,3 complementaron 6,1

expresión de PECAM-1 (CD31) una 5.10 molécula que T14 se expresa particularmente 5 Control 3.105 106 en los vasos sanguíneos de reciente formación. Para esto se realizaron homogenatos de muestras de piel obtenidas en los ensayos de angiogénesis. B VEGF-A

85 kDa -

Por Wb demostramos que los MC producen un aumento significativo en 2 D.O./mm

_

_

2,5

Control

3.10

5.10

_

la expresión de la proteína PECAM-1 con respecto a la piel normal (Fig. 7 A). 5 5 6 10

T14

Cabe destacar que en todos los ensayos de Wb se utilizó como control positivo el homogenato de tumor proveniente de animales con 14 días de portación del C

tumor LMM3 (T14). 92 kDa -

MMP-9

D.O./mm2

5

3 3,2

2

2,6

3,6

Control

3.105

5.105

106

T14

D 42 kDa -

ACTINA Control

3.105

5.105

106

T14

32

Figura 7: Expresión de A) PECAM-1, B) VEGF-A, C) MMP-9 en homogenatos de piel inoculada con miocardiocitos. D) La expresión de actina se usó como control de carga constante en cada calle. Análisis densitométrico de las bandas expresado en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (D.O./mm2) (panel inferior). Se muestra un ensayo representativo de tres semejante.

Teniendo en cuenta que el VEGF-A es una molécula indispensable para inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos y constituye un marcador de angiogénesis, se estudió la expresión de dicha proteína por Wb. Se observó un aumento en la expresión de VEGF-A a 85 kDa, aproximadamente, cuando se inocularon 5x105 MC, que está ausente en el control (Fig. 7 B).

33

Las MMPs son una familia de endopeptidasas dependientes de zinc capaces de clivar mediadores inflamatorios y degradar componentes de la membrana basal y de la MEC. Varias de las MMPs son moléculas características de procesos fisiológicos normales pero su expresión y actividad se incrementa durante la inflamación. Por lo tanto se investigó la expresión de la proteína MMP-9 en los homogenatos de piel del sitio angiogénico. En la Figura 7 C se observó un aumento de la expresión de dicha proteína con respecto al control. Cabe destacar que la inoculación con 5.105 y 106 MC indujo la expresión de una segunda banda que esta ausente en el control. Como demostramos los MC son angiogénicos pero no se conoce el efecto de la presencia de patógenos sobre el proceso de neovascularización cardíaca.

Teniendo

en

cuenta

esto,

mimetizamos

la

presencia

de

microorganismos al tratar los MC en cultivo con diferentes concentraciones de LPS durante 24 h. Luego se realizaron lisados celulares y se investigó la expresión de VEGF-A y MMP-9. La Figura 8 muestra que se produce un aumento en la expresión de ambas proteínas con un efecto máximo cuando los MC son tratados con 10 µg/ml de LPS.

34

A VEGF-A

45 kDa D.O./mm2

0,3

0,5

1,1

0,6

Control

1

10

100

LPS µg/ml B MMP-9

92 kDa -

D.O./mm2

0,8

Control

0,6

1,7

1

10

1,5

100

LPS µg/ml C 42 kDa -

ACTINA Control

1

10

100

LPS µg/ml Figura 8: Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) VEGF-A y B) MMP-9 en lisados de miocardiocitos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda. C) La expresión de actina se usó como control de carga constante en cada calle. El panel inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría medido en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres semejantes.

Por otro lado, se sabe que altos niveles de NO contribuyen a la hipotensión sistémica y disfunción miocárdica asociada con la sepsis. Por lo tanto, estudiamos la actividad y expresión de NOS2, que es una enzima que se induce durante la respuesta inflamatoria frente a patógenos, en los sobrenadantes y lisados de MC, respectivamente. Observamos que la expresión de dicha enzima se induce al tratar los MC con LPS, con una expresión máxima de 10 µg/ml de LPS (Fig. 9 A) concordante con una actividad máxima de la enzima medida como producción de nitritos (Control: 17,5±0,05; 10 µg/ml LPS: 24,6±0,4; n=5) (Fig. 9 C).

35

A NOS2

130 kDa -

D.O./mm2

_

_

0,8

0,5

Control

1

10

100

LPS µg/ml B CD40

40 kDa 2

D.O./mm

_

0,6

Control

1

1,8

10

LPS µg/ml C

(uM/mg de proteína)

Producción de NO2

-

30

*

*

20

10

0 Control

1

10

100

LPS (µg/ml)

Figura 9: Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) NOS2 en lisados de miocardiocitos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda. El panel inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres semejantes. B) Miocardiocitos tratados o no con diferentes concentraciones de LPS. La actividad de NOS fue medida como producción de NO2- (µM/mg de proteína). * p<0,01 vs MC sin tratamiento (Control), de acuerdo con el test Tukey.

Además, estudiamos la expresión de CD40 en MC, pues recientemente se ha demostrado que esta molécula es un marcador de inflamación. Observamos que se induce la expresión de esta proteína en los MC cuando son tratados con LPS (Fig. 9 B).

36

13. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS Es sabido que durante la respuesta inflamatoria, los neutrófilos y los macrófagos infiltran rápidamente el tejido cardíaco pero poco se conoce acerca del efecto de los patógenos sobre la capacidad angiogénica de los Mfs. Por lo tanto se investigó si la estimulación con LPS de los Mfs in vitro, potencia la capacidad angiogénica de dichas células. Para esto se obtuvieron Mfs peritoneales de animales de la cepa BALB/c. Dichas células se cultivaron y se estimularon con la concentración efectiva máxima de LPS, 100 µg/ml, durante 24 h. y luego se inocularon en ambos flancos de las hembras BALB/c en una concentración de 3x105, 4x105 ó 5x105 en 0,1 ml de medio de cultivo. En la Figura 10 observamos que a concentraciones bajas de Mfs existe una tendencia positiva en la formación de vasos sanguíneos que se hace significativa cuando se inoculan 5x105 Mfs (1,78±0,25; n=4) con respecto al control (1,13±0,20; n=4). La estimulación de los Mfs con LPS potenció el efecto neovascular que se observó a concentraciones bajas de Mfs (3x105 Mfs: 1,39±0,05, 3x105 Mfs+LPS: 2,13±0,23; 4x105 Mfs: 1,35±0,13, 4x105 Mfs+LPS: 2,18±0,19; n=4).

2

N° de vasos/mm de piel

3 #

#

*

2

1

0 Control

LPS 5

3x10

LPS 5

4x10

LPS 5

5x10

Macrófagos Figura 10: Angiogénesis inducida por macrófagos tratados o no con LPS 100 µg/ml. Los resultados se expresaron como Nº de vasos/mm2 de piel. Los valores son promedios ± E.S. de n=4 *p<0,05 vs. Piel normal (Control) y # p< 0,01 vs. sin tratamiento con LPS.

37

Para confirmar los resultados del ensayo in vivo se estudió la expresión de PECAM-1. En la Figura 11 A observamos un aumento de la expresión de dicha proteína cuando se inocularon 5x105 Mfs tratados con LPS. Al estudiar la expresión VEGF-A, marcador angiogénico, observamos que el estímulo con la misma concentración de LPS tanto con 3x105 y con 5x105 Mfs, indujo un aumento de la expresión de VEGF-A en la piel del sitio de inoculación aproximadamente a 85 kDa (Fig. 11 B). De igual manera se produjo un aumento de la expresión MMP-9 al estimular los Mfs con LPS (Fig. 11 C). A PECAM-1

117 kDa D.O./mm2

23

24,7

23,3

Control

25

28

LPS

LPS

3.105

5.105

B VEGF-A

85 kDa D.O./mm2

_

_

1

Control

_

2

LPS

LPS

3.105

5.105

C 92 kDa D.O./mm2

MMP-9 2,1

1,8

3,2

1,2

3,2

3,8

6,5

4

3,4

6,6

Control

LPS 3.10

5

LPS 5.10

5

D 42 kDa -

ACTINA Control

LPS 3.105

LPS 5.105

Figura 11: Expresión de A) CD31, B) VEGF-A, C) MMP-9 en homogenatos de piel inoculada con macrófagos tratados o no con LPS 100 µg/ml. La expresión de D) actina se uso como control de carga constante en cada calle. Análisis densitométrico de las bandas expresado en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (DO / mm2) (panel inferior). Se muestra un ensayo representativo de tres semejante.

38

14. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS Para investigar el papel que cumplen los Mfs durante una respuesta inflamatoria aguda decidimos utilizar un modelo de shock séptico en ratones BALB/c. Se obtuvieron Mfs peritoneales de animales inoculados con 0,1 mg/ratón de LPS a diferentes tiempos, 6 o 24 h. post-inoculación, de los cuales se obtuvieron los sobrenadantes de cultivo y se realizaron lisados celulares. En la Figura 12 se muestra que tanto la expresión de VEGF-A como la de MMP-9 aumentan con el tiempo de exposición al LPS (B-C). También corroboramos que la molécula PECAM-1 sólo se expresa en los vasos sanguíneos y no en los Mfs (A). Los Mfs, mastocitos y neutrófilos liberan distintos mediadores que pueden afectar la función cardíaca durante la endotoxemia y la sepsis. Por lo tanto estudiamos la expresión y actividad de la proteína NOS2, en lisados celulares y sobrenadantes de cultivo, de Mfs provenientes de animales estimulados con 0,1 mg/ratón de LPS. Observamos que a las 6 h. se produce un aumento significativo en la expresión de NOS2. Esta proteína no se expresa en Mfs sin tratamiento (Fig. 13 A). Estos resultados concuerdan con una máxima actividad de la enzima medida como producción de nitritos (Control: 10,3±1,1; 6 h: 15,02±0,90) (Fig. 13 C).

39

A 117 kDa D.O./mm2

PECAM-1 _

_

_

Control

6 h

24 h

LPS 0,1 mg/ratón B VEGF-A

65 kDa D.O./mm2

_

Control

1,2

6 h

8,8

24 h

LPS 0,1 mg/ratón C 92 kDa D.O./mm2

MMP-9 _

1,3

1,9

Control

6 h

24 h

LPS 0,1 mg/ratón D 42 kDa -

ACTINA Control

6 h

24 h

LPS 0,1 mg/ratón

Figura 12: A) Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) CD31, B) VEGF-A y C) MMP-9 en lisados de macrófagos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda. D) La expresión de actina se usó como control de carga constante en cada calle. El panel inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría medido en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres semejantes.

40

A NOS-2

130 kDa D.O./mm2

_

10,1

0,5

Control

6 h

24 h

LPS 0,1 mg/ratón B CD-40

40 kDa D.O./mm2

0,9

2,1

2,0

Control

6 h

24 h

LPS 0,1 mg/ratón C

(uM/mg de proteína)

Producción de NO 2-

18

*

12

6

0 Control

6 h

24 h

48 h

LPS 0,1 mg/ratón

Figura 13: Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) NOS2 y B) CD40 en lisados de macrófagos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda. El panel inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría medido en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres semejantes. C) Macrófagos provenientes de animales inoculados con 0,1 mg LPS/0,1 ml PBS. La actividad de la NOS fue medida como producción de NO2- (µM/mg de proteína). * p<0,01 vs Mfs normales (Control), de acuerdo con el test Tukey.

Además, estudiamos la expresión de CD40 en Mfs, como marcador inflamatorio y observamos un aumento en la expresión de esta proteína en los Mfs que provenían de animales tratados con LPS (Fig. 13 B).

41

DISCUSIÓN

42

15. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR LOS MIOCARDIOCITOS La angiogénesis se ha convertido en un área de gran importancia en la investigación científica debido a que está involucrada en varios procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros resultados demostraron que los MC murinos inducen una fuerte respuesta angiogénica per se en un modelo in vivo, ya que producen un incremento en el número de vasos que se acompañó con un aumento en la expresión de PECAM-1, VEGF-A y MMP-9. En relación con esto, Walsh K y Shiojima I (2007) reportaron que la angiogénesis coronaria durante el crecimiento cardíaco en el desarrollo postnatal normal y la hipertrofia observada en los atletas, la cual es referida como fisiológica debido a que esta forma de hipertrofia no está asociada con daño en la contractilidad cardiaca, es mediada por la secreción de factores angiogénicos liberados por los MC. Por otra parte evidenciamos que LPS potencia la respuesta angiogénica producida por los MC. Puesto que los vasos que observamos en la piel durante la angiogénesis, son tortuosos, su formación durante la infección no favorecería la perfusión sanguínea en el miocardio durante una infección con bacterias Gram-. Es necesario demostrar si la naturaleza de los vasos que se forman en el miocardio es semejante o diferente de la que observamos en la piel. Nosotros demostramos que el tratamiento de MC con LPS induce la expresión de NOS2 conjuntamente con un aumento en los niveles de NO. De acuerdo con esto, se ha demostrado que el LPS induce apoptosis de células cardíacas en una manera dependiente de NOS2 y daña la contractilidad cardíaca (Iwai-Kanai E y col., 2002; Ullrich R y col., 2000).

16. ANGIOGENESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS En nuestro laboratorio demostramos previamente que Mfs provenientes de animales portadores de tumor son angiogénicos per se y potencian la neovascularización que inducen las células tumorales en un modelo de

43

adenocarcinoma mamario murino (Davel L y col., 2002). Además estas células cumplen un papel significativo en varias enfermedades infecciosas e inflamatorias humanas. Nosotros demostramos que existe una tendencia a la formación de vasos a medida que aumenta el número de Mfs inoculados, que se hace estadísticamente significativa cuando se inyecta una dosis de 5x105 Mfs. Por otro lado observamos que los Mfs tratados con LPS potenciaron el efecto neovascular que observamos a concentraciones bajas de Mfs. El aumento de la respuesta angiogénica concordó con un incremento en la expresión de PECAM-1 y de VEGF-A en la piel inoculada con Mfs tratados con LPS. El gen de VEGF-A puede generar por un mecanismo de corte y empalme alternativo 4 formas distintas que se denominan VEGF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF 206, el número indica la cantidad de aminoácidos en la molécula. El VEGF165 es la forma molecular predominante tanto en células normales como malignas. Es una glicoproteína básica homodimérica de 45 kDa con capacidad de unión a la heparina y/o a proteína de la MEC (Ferrara N y col., 2003). La isoforma que nosotros encontramos tiene un peso molecular de 85 kDa que podría ser una forma de VEGF unida a heparina o a proteínas de la MEC. Xiong M y col. demostraron que Mfs murinos producen VEGF sin requerir la adición de ningún estímulo externo. Sin embargo, este nivel constitutivo de producción de VEGF se incrementó por estimulación de las células con IFNγ/LPS. En tumores esta descripto que el incremento del NO contribuye a la angiogénesis tumoral por regulación positiva del VEGF (Xu W y col., 2002). Es sabido que durante la endotoxemia se produce liberación de MMPs por leucocitos polimorfonucleares (Jochum M y col., 1984; Nakamura T y col., 1998). Sin embargo el rol que tiene estas enzimas en la sepsis y shock séptico no es claro. Debois B y col. (2002) demostraron que ratones deficientes en MMP-9 fueron más resistentes al shock séptico que sus controles, lo que indica que la inhibición específica de MMP-9 podría constituir un posible blanco terapéutico. Además, es sabido que el NO produce una supresión del inhibidor endógeno de la MMP-9 (TIMP-1) lo que aumenta en forma indirecta la actividad de la enzima (Ridnour LA y col., 2007). Por otro lado, es sabido que las MMPs

44

se sintetizan como pro-proteínas que se activan por clivaje ejercido por otras proteasas (Chow AK y col., 2007). Por este motivo es probable que la segunda banda que observamos por Wb en los homogenatos de piel, que está ausente en la piel normal, se debe a un aumento en la síntesis de esta forma de zimógeno.

17. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS Los resultados obtenidos al tratar los animales con LPS, en una dosis sub-letal, indican que los Mfs aumentan la producción de factores angiogénicos y proteasas de manera análoga a lo observado en ensayos in vitro. Observamos que a las 6 h. post-inoculación, se produce un aumento en la expresión de NOS2 concomitantemente con un incremento en la producción de NO y a las 24 h. se incrementan niveles de VEGF y MMP-9, lo que revelaría el papel regulador del NO sobre estas 2 moléculas. La expresión de CD40, una molécula que se utiliza como marcador inflamatorio, aumentó a las 6 h de igual manera que la NOS2. También ha sido documentado que la activación de CD40 por su ligando, es crítica para una respuesta inmune efectiva contra patógenos intra y extracelulares y además, tiene efecto pro-angiogénico debido a que induce la expresión de VEGF y MMPs en monocitos y linfocitos T, respectivamente (Melter M y col., 2000; Mach F y col., 1999). La expresión de CD40 no sólo está limitada a células de la línea hematopoyética como los Mfs, sino que también se observa en una amplia variedad de células diferentes como en las endoteliades, neuronales, fibroblastos, etc (Eliopoulos AG y Young LS, 2004). Nosotros demostramos que los MC son capaces de expresar esta molécula cuando son estimulados con LPS.

45

CONCLUSIONES

46

•

Los MC murinos son inductores de angiogénesis y el tratamiento de los MC in vitro con LPS estimula la liberación de moléculas que participan del proceso angiogénico.

•

Los Mfs peritoneales son inductores de angiogénesis y la infección con LPS potencia el efecto pro-angiogénico lo que los habilitaría como moduladores de dicha respuesta en el miocardio.

47

BIBLIOGRAFÍA

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