Proposal Tesis 3 Rev.docx

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAN FRAKSI BIJI BUAH RAMBUTAN (Nephelium lappaceum L.) SECARA IN VITRO HALAMAN JUDUL

USULAN PENELITIAN TESIS

Oleh: Muhammad Jefriyanto Budikafa 16/402579/PFA/01643

PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2018

PERSETUJUAN PROPOSAL

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAN FRAKSI BIJI BUAH RAMBUTAN (Nephelium lappaceum L.) SECARA IN VITRO

Oleh : MUHAMMAD JEFRIYANTO BUDIKAFA 16/402579/PFA/01643

Untuk dipertahankan dihadapan panitia penguji proposal Program Pascasarjana Program Studi Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

Pembimbing Utama

Pembimbing Pendamping

Prof. Dr. Sugeng Riyanto, M.S., Apt.

Dr. Rumiyati, M.Si., Apt.

Tanggal :

Tanggal :

ii

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL................................................................................................ i PERSETUJUAN PROPOSAL ................................................................................ ii DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. v INTISARI............................................................................................................... vi BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 A. Latar Belakang Penelitian ........................................................................... 1 B. Perumusan Masalah..................................................................................... 3 C. Keaslian Penelitian ...................................................................................... 4 D. Manfaat Penelitian....................................................................................... 5 E. Tujuan Penelitian......................................................................................... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 7 A. Telaah Pustaka............................................................................................. 7 1. Rambutan (Nephelium lappaceum L) ..................................................... 7 2. Radikal Bebas ....................................................................................... 10 3. Antioksidan........................................................................................... 11 4. Metode Pengujian Antioksidan ............................................................ 12 5. Ekstraksi dan Pemisahan ...................................................................... 13 6. Identifikasi Senyawa............................................................................. 17 B. Landasan Teori .......................................................................................... 21 C. Kerangka Konsep ...................................................................................... 23 D. Hipotesis .................................................................................................... 24 BAB III METODE PENELITIAN........................................................................ 25 A. Desain Penelitian ....................................................................................... 25 B. Bahan Penelitian ........................................................................................ 25 C. Instrumen Penelitian .................................................................................. 25 D. Jalannya Penelitian .................................................................................... 26 1. Penyiapan ekstrak metanol biji buah Rambutan .................................. 26 2. Fraksinasi ekstrak kental BBR ............................................................. 26

iii

3. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro .................................... 27 a.

Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH ........................ 27

b.

Penangkapan Radikal ABTS ......................................................... 27

c.

Penentuan Daya Reduksi ............................................................... 28

d.

Penentuan Antioksidan dengan β-Karoten – Asam Linoleat......... 28

e.

Penentuan Pengkelatan Logam...................................................... 29

4. Penentuan Kandungan Fenolik Total ................................................... 29 5. Penentuan Kandungan Flavonoid Total ............................................... 30 6. Identifikasi komponen senyawa fraksi teraktif sebagai antioksidan .... 30 a.

Isolasi............................................................................................. 30

b.

Uji kemurnian isolat aktif .............................................................. 31

c.

Identifikasi senyawa isolat ............................................................ 31

E. Analisis Data ............................................................................................. 31 JADWAL PENELITIAN ...................................................................................... 33 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 34

iv

DAFTAR GAMBAR Gambar 1. a. Buah rambutan (Nephelium lappaceum L.)…………………………8 b. Biji buah rambutan…………………………………………………..8

v

INTISARI Rambutan (Nephelium lappaceum, L) adalah tanaman dataran rendah dan dapat ditemukan di negara-negara Indonesia, Filipina, dan Amerika Latin. Biji dan kulit buah rambutan merupakan salah satu limbah yang jumlahnya cukup banyak, sehingga jika biji dan kulit buah rambutan ini dimanfaatkan dapat mengurangi limbah yang ditimbulkan, oleh karena itu beberapa peneliti mencoba memanfaatkannya sebagai suplemen makanan yang mengarah ke makanan fungsional dengan menentukan aktivitasnya misalnya sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk untuk melihat potensi biji buah rambutan (BBR) sebagai antioksidan alami untuk dapat digunakan sebagai bahan pangan fungsional dan melakukan penentuan kandungan fenolik total dan flavonoid total ekstrak dan fraksi-fraksi biji buah rambutan kemudian akan dilakukan identifikasi terhadap komponen senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dari fraksi teraktif dari biji buah rambutan. Biji buah rambutan dibersihkan, dicuci kemudian dikeringkan dan diserbukkan. Serbuk yang diperoleh dimaserasi dengan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipartisi dengan pelarut petroleum eter, diklorometan dan etil asetat. Ekstrak dan ketiga fraksi selanjutnya diuji aktivitas antioksidannya secara in vitro melalui serangkaian uji kemampuan fraksi untuk menangkap radikal DPPH dan ABTS, mereduksi besi (III), mengkelat logam dan uji pemucatan beta-karoten serta dilakukan penentuan kandungan fenolik total dan flavonoid totalnya. Fraksi teraktif sebagai antioksidan kemudian akan dilakukan identifikasi komponen senyawanya dengan menggunakan metode spektrofotometri. Kata Kunci : Biji Buah Rambutan, Antioksidan, Fenolik Total, Flavonoid Total, Identifikasi, Spektrofotometri

vi

Commented [SC1]: Kasih singkatannya, soalnya gak ada daftar singkatan Commented [SC2]: Ini juga

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Penyakit degeneratif seperti kanker, penyakit jantung koroner dan penuaan dini masih menjadi penyakit dengan angka kejadian yang tinggi sampai saat ini. Penyakit ini telah diketahui dapat dipicu oleh stress oksidatif yang diinduksi oleh radikal bebas. Radikal bebas dapat didefinisikan sebagai molekul atau fragmen molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan dalam orbital atom atau molekul (Halliwell dan Gutteridge, 1989 dalam Valko dkk.,

Formatted: Highlight

2007). Elektron yang tidak berpasangan ini biasanya memberi tingkat reaktivitas

Commented [SC3]: Sumber sekunder gini sebaiknya dihindari, tulis aja yang depan

yang cukup besar terhadap radikal bebas. Reaksi yang ditimbulkan oleh radikal ini

Formatted: Highlight

akan berlanjut terus menerus dan akan menimbulkan kerusakan-kerusakan sel apabila terjadi di dalam tubuh (Valko dkk., 2007; Wahdaningsih dkk., 2011). Cara yang paling efektif untuk menetralkan atau melawan radikal bebas serta mengurangi terjadinya kerusakan sel pada tubuh yang diakibatkan oleh proses oksidasi radikal bebas adalah menggunakan zat antioksidan (Djordjevic dkk., 2011). Keberadaan cadangan antioksidan dalam tubuh manusia dalam jumlah yang tidak berlebihan, karenanya tubuh membutuhkan antioksidan eksogen. Seiring dengan perkembangan zaman, pemanfaatan sayuran dan buah-buahan yang mengandung senyawa antioksidan semakin meningkat. Antioksidan berperan penting dalam melindungi tubuh dari serangan radikal bebas. Radikal bebas tersebut merupakan spesies reaktif yang memulai reaksi yang merusak molekul organik yang penting secara biologis dan dianggap sebagai penyebab beberapa masalah kesehatan termasuk kanker, penyakit jantung dan proses penuaan itu 1

sendiri (Halliwell dan Gutteridge, 1989; Anagnostopoulou dkk., 2006). Antioksidan dapat diperoleh secara sintetik atau dari bahan alam, yang masingmasing dikenal dengan antioksidan sintetik dan antioksidan alami. Senyawa antioksidan sintetik yang telah digunakan saat ini yaitu, butil hidroksi toluen (BHT), butil hidroksi anisol (BHA), dan ter-butil hidroksi quinon (TBHQ) telah terbukti afektivitasnya, namun senyawa-senyawa antioksidan sintetik ini dilaporkan menimbulkan efek toksik dan mutagenik (Alnajar dkk., 2012). Hal tersebut menimbulkan kekhawatiran terhadap antioksidan sintetik, sehingga antioksidan alami menjadi alternatif. Senyawa antioksidan alami banyak tersebar pada beberapa jenis tumbuhan, sayur-sayuran, biji-bijian, buah-buahan bahkan kulit buah-buahan. Untuk penggantian antioksidan sintetis konvensional dalam makanan dengan produk alami, tumbuhan, sayur-sayuran dan buah-buahan dianggap sebagai sumber yang menjanjikan. Karena itu, perhatian difokuskan pada karakterisasi sifat antioksidan ekstrak dari beberapa bahan tanaman dan identifikasi komponen yang bertanggung jawab terhadap aktivitas tersebut (Valentão dkk., 2002). Buah rRambutan dapat dikonsumsi secara segar atau yang telah diproses, sehingga banyaknya limbah dari kulit buah rambutan (KBR) dan biji buah rambutan (BBR) tidak bisa dihindari, oleh karena itu beberapa peneliti mencoba memanfaatkannya sebagai suplemen makanan yang mengarah ke makanan fungsional dengan menentukan aktivitasnya. Buah rRambutan dilaporkan mempunyai aktivitas antiradikal, antioksidan dan antibakteri. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa diantara berbagai ekstrak dan fraksinya, fraksi etil asetat mempunyai aktivitas penangkapan radikal, kandungan fenolik serta

2

kandungan flavonoid yang tertinggi sehingga berpotensi dimanfaatkan sebagai food supplement . Fraksi etil asetat dilaporkan mempunyai aktivitas penangkapan radikal DPPH (2,2’-difenil-1-pikrilhidrazil) dengan nilai IC50 sebesar 2,732 µg/mL; sementara kuersetin yang digunakan sebagai kontrol positif mempunyai IC50 sebesar 1,998 µg/mL (Permatasari dan Rohman, 2016). Pengujian aktivitas antioksidan alami terutama yang diperoleh dari buah dan sayuran seringkali dihubungkan dengan kandungan fenolik total dan flavonoid total untuk mengetahui korelasi antara aktivitas antioksidan dan kandungan keduanya. Berdasarkan hal ini, maka akan dilakukan pengukuran kandungan fenolik dan flavonoid dan mengorelasikannya dengan antioksidannya sebagaimana telah dilakukan oleh beberapa peneliti kemudian akan dilakukan identifikasi terhadap komponen senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dari fraksi teraktif dari biji buah rambutan (Rohman dkk., 2006). B. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah dijelaskan, dapat dirumuskan beberapa permasalahan yaitu: 1. Seberapa besar aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ekstrak metanol dan fraksi-fraksi biji buah rambutan (N. lappaceum L.) melalui serangkaian uji kemampuan fraksi untuk menangkap radikal DPPH dan ABTS, mereduksi besi (III), mengkelat logam berat dan uji pemucatan beta-karoten ? 2. Bagaimana korelasi antara aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan fraksifraksi biji rambutan (N. lappaceum L.) dengan kandungan fenolik dan flavonoid totalnya ?

3

3. Bagaimana struktur kimia dari senyawa yang terdapat dalam fraksi biji buah rambutan yang memiliki aktivitas antioksidan paling aktif ? C. Keaslian Penelitian Berdasarkan penelusuran pustaka, ditemukan beberapa penelitian mengenai biji

buah

rambutan.

Biji

rambutan

mempunyai

senyawa

metabolit

sekunder fenol, flavonoid dan tanin (Yuda dkk., 2015). Menurut Thitilertdecha dkk (2008) ekstrak eter, metanol, air dari kulit dan biji rambutan yang dievaluasi memiliki aktivitas antioksidan dan antibakteri berasal dari kandungan fenolik. Berbagai uji aktivitas antioksidan, termasuk dengan metode pemucatan β-karoten dan aktivitas penangkapan

radikal bebas menunjukkan bahwa ekstrak kulit

rambutan menunjukkan aktivitas antioksidan lebih tinggi daripada ekstrak biji rambutan. Khasanah (2011) melakukan uji aktivitas penangkapan radikal ekstrak etanol, fraksi-fraksi dari kulit buah dan biji rambutan dengan menggunakan metode DPPH. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas paling tinggi pada fraksi etil asetat kulit rambutan dengan nilai IC50 = 4,29 µg/mL. Aktivitas tersebut lebih tinggi daripada vitamin E (IC50 vitamin E= 8,48 µg/mL). Penelitian mengenai manfaat biji rambutan dan pemanfaatan biji buah rambutan masih belum banyak dilakukan sehingga hanya menjadi limbah. Pada penelitian ini akan dilakukan ekstraksi sampel biji rambutan dengan pelarut metanol untuk melihat kandungan dan aktivitas dari ekstrak metanol serta melakukan fraksinasi dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter, diklorometan dan etil asetat dan diuji aktivitas antioksidannya secara in vitro kemudian dilakukan

4

identifikasi komponen senyawa dari fraksi teraktif sehingga dapat diketahui manfaat biji rambutan sebagai sumber antioksidan alami. D. Manfaat Penelitian Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas seperti kanker, penyakit jantung koroner dan penuaan dini merupakan salah satu penyakit degeneratif yang dapat dicegah melalui konsumsi buah, sayur ataupun by product-nya yang beraktivitas antioksidan. Berdasarkan hal ini maka sangatlah penting untuk mengeksplorasi secara ilmiah tanaman/buah-buahan yang saat ini diyakini oleh masyarakat dapat mencegah penyakit degeneratif seperti rambutan. Manfaat yang ingin diperoleh dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui potensi dari ekstrak metanol dan fraksi-fraksi biji buah rambutan sebagai antioksidan melalui serangkaian uji kemampuan fraksi untuk menangkap radikal DPPH dan ABTS, mereduksi besi (III), mengkelat logam dan uji pemucatan betakariten sehingga akan dapat diketahui fraksi mana yang paling aktif sebagai antioksidan. Selain itu juga dilakukan penentuan kandungan fenolik total dan kandungan flavonoid total ekstrak dan fraksi-fraksi biji buah rambutan untuk melihat hubungan dari aktivitas antioksidan terhadap kandungan kedua komponen tersebut kemudian dilakukan identifikasi komponen senyawa dari fraksi biji buah rambutan yang memiliki aktivitas antioksidan paling aktif dibandingkan fraksi lainnya. E. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini secara umum adalah untuk melihat potensi biji buah rambutan (BBR) sebagai antioksidan alami untuk dapat digunakan sebagai bahan

5

pangan fungsional (yang mana selain dapat dikonsumsi sebagai bahan pangan juga dapat digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah berbagai penyakit degeneratif seperti penyakit kanker dan jantung koroner). Secara khusus, tujuan penelitian ini adalah: 1. Menentukan aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi-fraksi secara in vitro melalui serangkaian uji kemampuan fraksi untuk menangkap radikal DPPH dan ABTS, mereduksi besi (III), mengkelat logam dan uji pemucatan beta-karoten sehingga akan dapat diketahui fraksi mana yang paling aktif sebagai antioksidan. 2. Melakukan penentuan kandungan fenolik total dan flavonoid total ekstrak dan fraksi-fraksi biji buah rambutan, karena sebagaimana diketahui, kedua kelompok senyawa ini merupakan sumber antioksidan yang poten sehingga dapat diketahui hubungan akitivitas antioksidan dengan kandungan kedua kelompok senyawa tersebut. 3. Melakukan identifikasi komponen senyawa dari fraksi biji buah rambutan yang memiliki aktivitas antioksidan paling aktif.

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Telaah Pustaka 1. Rambutan (Nephelium lappaceum L) a. Morfologi Rambutan (Nephelium lappaceum, L) adalah tanaman dataran rendah dan dapat ditemukan di negara-negara Indonesia, Filipina, dan Amerika Latin. Tanaman ini tumbuh dengan baik pada suhu 30-500 m dpl dan membutuhkan iklim yang lembab dengan curah hujan tahunan sekitar 1500-2500 mm. Waktu berbunga rambutan membutuhkan waktu sekitar 3 bulan di musim kemarau Pohon rambutan tumbuh hingga 15-25 m, dengan jenis percabangan simpodial. Batangnya berkayu, bulat, dan putih. Daunnya berbentuk tunggal, berserakan, berbentuk oval, ujung datar, ujung dan alasnya meruncing, menyirip, dan hijau dengan tangkai silindris. Ukuran daunnya sekitar 10-20 cm dan lebar 510 cm. Bunga disusun dalam tandan di ujung dahan, harum, berukuran kecil, dan hijau muda. Bunga jantan dan bunga betina tumbuh terpisah di satu pohon. Buahnya buni dengan panjang 4-5 cm dan berbentuk oval dengan daging tebal. Kulitnya berwarna hijau dan menjadi kuning atau merah saat matang. Biji berbentuk elips dengan kulit biji berkayu dan dibungkus lapisan putih transparan yang bisa dimakan dan mengandung banyak air dengan rasa asam sampai manis. Rambutan biasanya berbunga pada akhir musim kemarau dan saat buah terbentuk pada musim hujan, sekitar bulan November sampai Februari (Samsuraida dkk., 2009; Lestari dkk., 2013)

7

b. Klasifikasi Tanaman Klasifikasi tanaman rambutan dalam taksonomi tanaman adalah sebagai berikut: Kingdom

: Plantae

Divisi

: Traceophyta

Sub Divisi

: Spermatophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Ordo

: Sapindales

Famili

: Sapindaceae

Genus

: Nephelium L.

Spesies

: Nephelium lappaceum L.

(ITIS

Standard

Report

Page:

Nephelium lappaceum, 2017)

(a) (b) Gambar 1. a. Buah rambutan (Nephelium lappaceum L.) (Wall, 2011) b. Biji buah rambutan

c. Kandungan Kimia dan Khasiat Tanaman Rambutan mengandung karbohidrat, protein, kalsium, vitamin C, besi, fosfor, mineral makro dan mikro, dan lemak. Kulit buah mengandung flavonoid, tanin dan

8

saponin. Biji mengandung lemak dan polifenol sedangkan daunnya mengandung tanin dan saponin. Kulit kayu mengandung tanin, saponin, flavonoid, zat pektis dan zat besi (Okonogi dkk., 2007). Rambutan dinikmati sebagai buah segar, namun bisa juga digunakan untuk manisan, sorbet, jus atau anggur. Bagian yang dapat dimakan (100 g) mengandung 80 g air, 1 g protein, 0,4 g lemak, 2,9 g glukosa, 3,1 g fruktosa, 9,8 g sukrosa, 70 g asam askorbat, serat makanan 2,7 g, 0,8 g niasin, 0,02 mg tiamin, 0,06 mg riboflavin, 140 mg kalium, sodium 2 mg, magnesium 10 mg, besi 0,1 mg, dan seng 0,6 mg (Wall dkk., 2011). Rambutan tumbuh di Hawaii memiliki kandungan asam askorbat berkisar antara 22 sampai 47 mg/100 g edible fresh weight (FW). Kadar asam askorbat kultivar 'R162' dan 'Silengkeng' masing-masing adalah 47,8 mg/100 g dan 39,1 mg/100 g FW (Wall, 2006). Nilai asupan referensi diet (DRI) untuk vitamin C adalah 100 mg untuk pria dewasa dan 75 mg untuk wanita dewasa. Oleh karena itu, konsumsi sekitar 10-12 buah rambutan bisa memberi DRI rata-rata orang dewasa. Rambutan juga merupakan sumber mineral yang baik. Buah (100 g) mengandung 135 sampai 249 mg kalium, 0,16 sampai 0,20 mg tembaga, dan 0,07 sampai 0,38 mg mangan, memberikan 20% DRI untuk Cu, 8-10% DRI untuk Mn, dan 2-6% dari DRI untuk mineral K, P, Fe dan Zn (Wall dkk., 2011). Buah Rambutan dilaporkan mempunyai aktivitas antiradikal, antioksidan dan antibakteri (Thitilertdecha dkk., 2008; Thitilertdecha dan Rakariyatham, 2011) disebabkan oleh kandungan senyawa fenoliknya, anti-herpes simplex virus type 1 (Nawawi dkk., 1999), dan anti-hiperglikemik karena kandungan geraniin (Palanisamy dkk., 2011).

9

2. Radikal Bebas Radikal bebas adalah spesies kimia reaktif yang memiliki satu elektron tak berpasangan dalam orbital terluar mereka (Togo, 2004; Losada-Barreiro dan BravoDíaz, 2017). Konfigurasi elektronik ini sangat energik, membuat radikal bebas menjadi tidak stabil secara kimia dan sangat reaktif. Ketika diproduksi dalam makanan atau jaringan biologis, mereka bereaksi dengan mudah dengan molekul di dekatnya seperti lipid, karbohidrat, protein dan asam nukleat, yang menghasilkan spesies non-radikal dan radikal yang berbeda, yang pada umumnya sangat berbahaya bagi manusia (Valko dkk., 2007; Losada-Barreiro dan Bravo-Díaz, 2017). Di berbagai bidang biologi dan kedokteran, radikal bebas lebih dikenal sebagai ROS atau spesies nitrogen reaktif (RNS) (Firuzi dkk., 2011). Radikal bebas adalah fragmen molekul / molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, yang kehadirannya biasanya sangat reaktif. ROS yang paling penting adalah radikal hidroksil, anion radikal superoksida, Oksida nitrat dan radikal peroksil, dan juga spesies non-radikal seperti hidrogen peroksida, oksigen singlet, asam hipoklorida dan peroksinitrit (Poprac dkk., 2017). Radikal bebas dapat dihasilkan dari sumber endogen dan/atau eksogen (Halliwell, 2011). Sumber radikal endogen yang paling penting adalah enzim rantai pernafasan mitokondria, oksidase NADPH, xanthine oxidase (XO), dan NOS endotelial disfungsional (eNOS). Selain itu, logam bebas-redoks-aktif (tidak terikat) seperti besi dan tembaga dapat menghasilkan radikal bebas melalui dekomposisi katalitik hidrogen peroksida (reaksi Fenton) (Valko dkk., 2007)

10

Efek berbahaya dari radikal bebas dapat ditangkal oleh zat yang dikenal sebagai antioksidan. Sel hidup mengandung sejumlah besar spesies antioksidan dengan berat molekul rendah (misalnya, vitamin E dan C, karotenoid, flavonoid, dll.) Dan enzim antioksidan dengan berat molekul lebih besar, keduanya berfungsi untuk mencegah atau memperbaiki kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Enzim antioksidan yang paling penting adalah SOD, katalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), dan sistem TRX (Lehoux, 2006) 3. Antioksidan Antioksidan adalah molekul dengan berat molekul rendah yang cukup stabil untuk

masing-masing

menetralisirnya,

menyumbangkan

sehingga

elektron

ke

mengurangi kemampuan

radikal radikal

bebas dan bebas untuk

menyebabkan kerusakan. Antioksidan ini menunda atau menghambat kerusakan sel terutama melalui kemampuan penangkapan radikal bebas mereka (Halliwell, 1995; Archibong dkk., 2018). Antioksidan bisa menjadi molekul kompleks seperti dismutases superoksida, atalases dan peroxiredoxins, atau yang lebih sederhana seperti asam urat dan glutathione. Seperti yang telah dibahas, aktivitas antioksidan mungkin berada dalam struktur sel (Gutteridge dan Halliwell, 2010). Dua mekanisme tindakan utama telah diusulkan untuk antioksidan (RiceEvans dan Diplock, 1993; Archibong dkk., 2018). Yang pertama adalah mekanisme pemecahan rantai dimana antioksidan utama menyumbangkan sebuah elektron ke hadirnya radikal bebas dalam sistem. Mekanisme kedua melibatkan penghilangan inisiator spesies ROS / reaktif (antioksidan sekunder) dengan katalis inisiasi rantai pendinginan. Antioksidan dapat memberi efek pada sistem biologis dengan

11

mekanisme yang berbeda termasuk sumbangan elektron, khelasi ion logam, antioksidan, atau dengan regulasi ekspresi gen (Archibong dkk., 2018) Beberapa antioksidan ini, termasuk glutathione, ubiquinol, dan asam urat, diproduksi selama metabolisme normal di tubuh (Shi dkk., 1999). Antioksidan ringan lainnya ditemukan dalam makanan. Meskipun ada beberapa sistem enzim di dalam tubuh yang mengais radikal bebas, antioksidan mikronutrien utama adalah vitamin E (α-tokoferol), vitamin C (asam askorbat), dan β-karoten (Levine dkk., 1999; Archibong dkk., 2018). Tubuh tidak bisa memproduksi mikronutrien ini, sehungga harus dikonsumsi melalui makanan sehari-hari. 4. Metode Pengujian Antioksidan Beberapa metode analisis telah dikembangkan untuk menentukan aktivitas antioksidan secara in vitro, yang dapat dikategorikan ke dalam 2 kelompok (i) pengukuran yang mendasarkan pada kemampuan menangkap radikal, dan (ii) pengukuran yang mendasarkan pada efek penghambatan oksidasi lipid. Meskipun suatu senyawa uji menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi dengan salah satu metode, tidak selalu akan memberikan hasil yang sama baiknya dengan menggunakan metode lainnya sehingga disarankan untuk mengukur aktivitas antioksidan dengan berbagai macam metode. Uji penangkapan radikal yang sering digunakan adalah dengan menggunakan radikal organik DPPH ABTS.+ (Prior dkk., 2005). Penggunaan DPPH untuk metode penangkapan radikal mempunyai keuntungan yaitu: mudah digunakan, mempunyai tingkat sensitivitas yang tinggi, dan dapat menganalisis sejumlah besar sampel dalam jangka waktu yang singkat (Kikuzaki dkk., 2002). Sistein, glutation, asam askorbat, tokoferol, senyawa-

12

senyawa aromatik polihidroksi seperti hidrokuinon, pirogalal, dan asam galat serta senyawa-senyawa amin aromatis seperti p-fenilen diamin dan p-amino fenol mampu mereduksi dan memucatkan warna DPPH karena kemampuannya memberikan atom hidrogen pada radikal DPPH (Kumar dan Gupta, 2002). 5. Ekstraksi dan Pemisahan a. Maserasi Ekstraksi merupakan pemisahan bagian tanaman obat (dan hewan) dengan menggunakan pelarut selektif melalui prosedur standar. Produk yang diperoleh dari tanaman adalah campuran metabolit yang relatif kompleks, dalam keadaan cair atau semipadat atau dalam bentuk bubuk kering, dan dimaksudkan untuk penggunaan oral atau eksternal (Remington, 2005 dalam Kumar dkk., 2011). Metode ekstraksi melibatkan pemisahan bagian aktif obat dari jaringan tanaman dari komponen inaktif/inert dengan menggunakan pelarut selektif. Selama ekstraksi, pelarut membaur ke dalam bahan padat dan melarutkan senyawa dengan polaritas serupa . Dalam maserasi (untuk ekstrak cairan), tangkapan tanaman utuh atau kasar disimpan dalam kontak dengan pelarut dalam wadah stopper untuk jangka waktu tertentu dengan agitasi yang sering sampai bahan larut dilarutkan. Metode ini paling sesuai untuk digunakan dalam kasus obat thermolabile (Ncube dkk., 2008). Variasi metode ekstraksi biasanya ditemukan pada periode ekstraksi, pelarut yang digunakan, pH, suhu, ukuran partikel dan rasio pelarut terhadap sampel. Semakin lama kontak antara pelarut dan bahan semakin banyak komponen yang diekstraksi sampai semua bahan mungkin telah diekstraksi. Periode ekstraksi dapat

13

dipersingkat dengan menggiling bahan tanaman menjadi lebih halus karena hal ini akan meningkatkan luas permukaan untuk ekstraksi sehingga meningkatkan laju ekstraksi. Mengaduk campuran bahan pelarut tanaman juga akan meningkatkan laju ekstraksi.. Beberapa penelitian melaporkan bahwa rasio ideal pelarut terhadap sampel yang telah kering adalah 10: 1 (v/w) (Das dkk., 2010). b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan senyawa organik dan anorganik sehingga dapat dianalisis dan dipelajari. Kromatografi adalah metode tepat digunakan untuk mengamati campuran dan pelarut. Kromatografi didasarkan pada migrasi diferensial (Kondeti dkk., 2014). Semua bentuk kromatografi bekerja dengan prinsip yang sama. Kromatografi terdiri dari fase diam (solid atau cairan yang didukung solid) dan fase gerak (cairan atau gas). Campuran dilarutkan dalam cairan yang disebut fase gerak, yang membawanya melalui struktur yang menahan bahan lain yang disebut fase diam. Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen campuran. Berbagai konstituen campuran bergerak pada kecepatan yang berbeda, menyebabkan komponen tersebut berpisah satu sama lain. Pemisahan ini didasarkan pada pembagian diferensial antara fase bergerak dan fase diam. Ada berbagai jenis kromatografi seperti kromatografi kolom, kromatografi kertas, di antaranya kromatografi lapis tipis (KLT) adalah teknik laboratorium yang banyak digunakan dan serupa dengan kromatografi kertas. KLT melibatkan fase diam dari lapisan tipis adsorben seperti silika gel, alumina, atau selulosa pada substrat inert datar. Dibandingkan kromatografi kertas, KLT memiliki keuntungan

14

lebih cepat, pemisahan yang lebih baik, dan pilihan antara adsorben yang berbeda (Kumar dkk., 2013). Kromatografi lapis tipis menggunakan pelat kaca tipis yang dilapisi dengan aluminium oksida atau silika gel sebagai fasa padat. Fase gerak adalah pelarut yang dipilih sesuai dengan sifat komponen dalam campuran. Prinsip TLC adalah distribusi senyawa antara fasa padat padat (lapisan tipis) yang diaplikasikan pada gelas atau pelat plastik dan fasa gerak cair yang bergerak di atas fasa padat. Sejumlah kecil senyawa atau campuran diaplikasikan ke titik awal tepat di atas dasar plat KLT. Pelat ini kemudian dikembangkan di suatu wadah yang berisi eluen tepat di bawah tingkat di mana sampel diaplikasikan. Pelarut disusun melalui partikel-partikel di plat melalui aksi kapiler, dan saat pelarut bergerak di atas campuran, masing-masing senyawa tetap berada dalam fase padat atau larut dalam pelarut dan naik ke atas plat. Senyawa tersebut bergerak ke atas piring atau tetap berada di belakang tergantung pada sifat fisik senyawa individu tersebut dan karenanya bergantung pada struktur molekulernya, terutama kelompok fungsional (Bele dan Khale, 2011). c. Kromatografi Kolom Kolom kromatografi dalam kimia adalah metode yang digunakan untuk memurnikan senyawa kimia individual dari campuran senyawa. Hal ini sering digunakan untuk aplikasi preparatif pada skala dari mikrogram hingga kilogram. Kolom kromatografi preparatif klasik, adalah tabung kaca dengan diameter dari 5 mm sampai 50 mm dan tinggi 5 cm sampai 1 m dengan keran dan beberapa jenis filter (kaca frit atau kaca wol plug - untuk mencegah kerugian dari fase diam) di

15

bagian bawah. Dua metode umumnya digunakan untuk membuat kolom: metode kering, dan metode basah. Teknik ini biasanya membutuhkan gel silika mesh 70 230 (63 - 200 μm). Kolomnya tersedia dengan tabung kaca sederhana, panjang dan diameternya bervariasi. Tabung ini biasanya memiliki kran yang terpasang untuk mengendalikan aliran pelarut, dan mungkin memiliki pelat berlapis untuk mendukung adsorben. Beberapa kolom mungkin memiliki tabung hampa udara yang menempel di bagian atas kolom untuk bertindak sebagai reservoir pelarut. Variasi dalam ukuran memungkinkan untuk memilih kolom terbaik untuk pemisahan. Kolom berdiameter besar akan digunakan untuk jumlah senyawa yang lebih banyak. Resolusi kolom tergantung pada diameter dan panjang adsorben di kolom. Resolusi dapat ditingkatkan dengan bertambahnya panjang, dan menurun dengan diameter yang meningkat. Dengan demikian, 25 g adsorben akan memberikan pemisahan yang lebih baik pada kolom diameter 1 cm daripada kolom berdiameter 2 cm. Jika campuran yang akan dipisahkan mengandung senyawa berwarna, maka monitoring kolom sangat sederhana. Band berwarna akan bergerak ke bawah kolom bersama dengan pelarut dan saat mendekati akhir kolom, band berwarna dikumpul dalam wadah. Warna dapat dijakdikan sebagai panduan. Akan tetapi kebanyakan molekul organik tidak berwarna sehingga dalam hal ini reaksi harus dipantau dengan KLT. Tempatkan setiap fraksi pada plat KLT. Empat atau lima fraksi dapat terlihat pada plat KLT tunggal. Elusi plat dan gunakan tempat atau titik yang diamati untuk menentukan senyawa mana yang ada di masing-masing fraksi yang

16

dikumpulkan. Mengamati beberapa bahan awal atau produk (jika tersedia) pada plat KLT sebagai standar akan membantu dalam identifikasi (Kondeti dkk., 2014). 6. Identifikasi Senyawa Identifikasi kimia adalah kombinasi antara prosedur eksperimental dan perhitungan dan operasi intelektual yang diikuti oleh pengambilan keputusan analis sebagai ahli dan mencari kesamaan setidaknya dua sifat / fitur yang berbeda antara analit dan salah satu senyawa kimia yang diketahui dan perbedaan yang sesuai. antara analit dan senyawa lainnya (Milman, 2005). Identifikasi kimia dianggap memberi analit (sinyal analitis) ke salah satu rangkaian senyawa kimia individual yang diketahui atau ke kelompok / kelas senyawa berdasarkan pada sifatnya yang sesuai (Milman dan Konopelko, 2000). Identifikasi analit harus dibedakan dari pendeteksiannya, yang pada intinya merupakan penemuan sinyal analitik tanpa pengakuan yang menentukan sifatnya (Bethem dkk., 2003). Prosedur deteksi dan identifikasi disatukan dalam analisis kimia kualitatif a. Spektrofotometri UV-VIS Spektroskopi ultraviolet (UV) adalah teknik spektroskopi optik yang menggunakan cahaya pada rentang visible, ultraviolet, dan inframerah dekat. Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa yang menyerap dalam larutan dan panjang lintasan. Jadi, untuk jalur panjang yang tetap, spektroskopi UV/VIS dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi senyawa yang menyerap dalam larutan. Hal ini diperlukan untuk mengetahui seberapa cepat perubahan absorbansi dengan konsentrasi.

17

Sebuah molekul atau ion akan menunjukkan penyerapan di daerah yang terlihat atau ultraviolet ketika radiasi menyebabkan transisi elektronik di dalam strukturnya. Dengan demikian, penyerapan cahaya oleh sampel di daerah ultraviolet atau terlihat disertai dengan perubahan keadaan elektronik molekul dalam sampel. Energi yang dipasok oleh cahaya akan mempromosikan elektron dari orbital keadaan dasar ke energi yang lebih tinggi, orbital keadaan tereksitasi atau orbital anti-ikatan. Secara potensial, tiga jenis orbital keadaan tanah dapat dilibatkan adalah orbital molekul σ (bonding), π (bonding), dan orbital atom n (non-bonding) Selain itu, dua jenis orbital anti ikatan dapat dilibatkan dalam transisi yaiut σ* (sigma star) orbital dan π* (pi star) orbital (Tidak ada orbital anti ikatan n* karena elektron n tidak membentuk ikatan) (Shah dkk., 2015). b. Spektrofotometri Inframerah (IR) Spektroskopi inframerah adalah teknik yang didasarkan pada vibrasi atom suatu molekul. Spektrum inframerah umumnya diperoleh dengan melewatkan radiasi infra merah melalui sampel dan menentukan fraksi dari radiasi yang terjadi diserap pada energi tertentu. Energi dimana setiap puncak dalam spektrum yang terabsorpsi muncul sesuai dengan frekuensi vibrasi sebagian molekul sampel. Spektroskopi inframerah kuantitatif dapat memberikan keuntungan tertentu dibandingkan teknik analisis lainnya. Pendekatan ini dapat digunakan untuk analisis satu komponen campuran, terutama bila senyawa dalam campuran samasama bersifat kimiawi atau memiliki sifat fisik yang sangat mirip (misalnya isomer struktural).

Dalam

contoh

ini,

analisis

menggunakan

spektroskopi

ultraviolet/visible, misalnya, sulit karena spektrum komponennya akan hampir

18

identik. Analisis kromatografi mungkin terbatas penggunaannya karena pemisahan, misalnya isomer, sulit dicapai. Spektrum inframerah isomer biasanya sangat berbeda di daerah sidik jari. Keuntungan lain dari teknik inframerah adalah bahwa hal itu dapat bersifat non-destruktif dan memerlukan jumlah sampel yang relatif kecil (Stuart, 2004). Daerah inframerah terdiri dari 3 jenis yaitu inframerah-dekat, inframerahpertengahan dan inframerah-jauh. Absorpsi yang diamati di daerah inframerahdekat (13.000-4000 cm-1) adalah overtone atau kombinasi dari regangan ikatan dasar yang terjadi di wilayah 3000-1700 cm-1 . Ikatan yang terlibat biasanya berupa ikatan C-H, N-H stretch atau O-H (Weyer dan Lo, 2006). Spektrum inframerah pertengahan (4000-400 cm-1) dapat dibagi menjadi empat wilayah dan sifat frekuensi kelompok umumnya dapat ditentukan oleh wilayah di mana ia berada. Daerah-daerah tersebut digeneralisasi sebagai berikut: daerah peregangan X-H (4000-2500 cm-1), daerah ikatan rangkap tiga (2500-2000 cm-1), daerah ikatan rangkap dua (2000-1500 cm-1) dan daerah sidik jari (1500-600 cm-1) (Stuart, 2004). Wilayah inframerah-jauh didefinisikan sebagai daerah antara 400 dan 100 cm-1. Daerah ini lebih terbatas daripada pertengahan inframerah untuk korelasi spektrastruktur, namun memberikan informasi mengenai getaran molekul yang mengandung atom berat, getaran kerangka molekuler, torsi molekul dan getaran kisi kristal (Griffiths, 2006). c. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (GC-MS) Kromatografi Gas - Spektrometri Massa (GC-MS) adalah teknik analitik yang menggabungkan sifat pemisahan kromatografi gas-cair dengan fitur pendeteksian

19

spektrometri massa untuk mengidentifikasi zat berbeda dalam sampel uji. GC digunakan untuk memisahkan komponen volatil dan termal stabil dalam sampel sedangkan GC-MS akan membentuk fragmen-fragmen untuk diidentifikasi berdasarkan massanya. Penambahan spektrometer massa di dalamnya mengarah ke GC-MS/MS (Kataria, 2011). GC mensyaratkan analit untuk memiliki tekanan uap signifikan antara 30 dan 300°C. Pengidentifikasian didasarkan pada pencocokan waktu retensi terhadap database yang telah tersedia. GC-MS mewakili massa partikel tertentu (Da) dengan jumlah (z) muatan elektrostatik (e) yang dibawa partikel. Istilah m/z diukur dalam DA/e. GC-MS umumnya menggunakan teknik electron impact (EI) dan chemical ionization (CI). Fitur utama dari ion molekuler yang ditingkatkan, meningkatkan konfigurasi dalam identifikasi sampel, meningkatkan secara signifikan berbagai komponen labil termal dan volatilitas rendah yang dapat diterima untuk analisis, analisis lebih cepat, sensitivitas yang lebih baik terutama untuk senyawa yang sulit dianalisis dan banyak fitur dan pilihan lainnya memberikan alasan kuat untuk menggunakan GC-MS di berbagai bidang (Chauhan, 2014). d. Spektrofotometri NMR Resonansi Magnetik Inti (NMR) adalah teknik spektroskopi yang mendeteksi energi yang diserap oleh perubahan dalam keadaan spin nuklir. NMR merupakan salah satu metode analisis yang paling sering digunakan pada analisis kimia modern untuk penentuan struktur molekul organik. Penerapan spektroskopi NMR untuk mempelajari protein dan asam nukleat juga telah memberikan informasi unik mengenai dinamika dan kinetika kimiawi dari sistem ini. Salah satu fitur penting

20

dari NMR adalah bahwa ia menyediakan informasi, pada tingkat atom, mengenai dinamika protein dan asam nukleat pada rentang skala waktu yang sangat luas, mulai dari detik sampai piko detik. Selain itu, NMR juga dapat memberikan informasi struktural tingkat atom dari protein dan asam nukleat dalam larutan (Darbeau, 2006). Pergeseran kimia NMR adalah langkah pertama untuk menentukan struktur molekul dari suatu senyawa. Baik pergeseran kimia NMR 1H dan

13

C telah

digunakan secara rutin untuk tujuan ini. Selain penggunaan spektrum NMR dalam memperoleh informasi struktural, juga digunakan untuk menyelidiki interaksi ikatan hidrogen (Nanda dan Damodaran, 2018). B. Landasan Teori Rambutan (Nephelium lappaceum L) termasuk ke dalam famili Sapindaceae. Rambutan merupakan buah tropis yang sangat menarik yang terdistribusi secara luas di Asia tenggara terutama di Indonesia, Malaysia dan Thailand (Thitilertdecha dkk., 2008). Buah rambutan dapat dikonsumsi secara segar atau yang telah diproses, sehingga banyaknya limbah dari kulit buah rambutan (KBR) dan biji buah rambutan (BBR) tidak bisa dihindari, oleh karena itu beberapa peneliti mencoba memanfaatkannya sebagai suplemen makanan yang mengarah ke makanan fungsional dengan menentukan aktivitasnya. Buah Rambutan dilaporkan mempunyai aktivitas antiradikal, antioksidan dan antibakteri (Thitilertdecha dkk., 2008; Thitilertdecha dan Rakariyatham, 2011) disebabkan oleh kandungan senyawa fenoliknya, anti-herpes simplex virus type 1 (Nawawi dkk., 1999), dan anti-hiperglikemik karena kandungan geraniin (Palanisamy dkk., 2011).

21

Ekstrak etanol kulit buah rambutan dikaporkan mengandung asam elagat, corilagin dan geraniin (Thitilertdecha dkk., 2010). Palanisamy dkk (2011) juga mengisolasi geraniin dari limbah kulit Rambutan. Senyawa-senyawa ini dilaporkan bertanggung jawab pada aktivitas antiradikal dan antioksidannya. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa diantara berbagai ekstrak dan fraksinya, fraksi etil asetat mempunyai aktivitas penangkapan radikal, kandungan fenolik serta kandungan flavonoid yang tertinggi sehingga berpotensi dimanfaatkan sebagai food supplement. Fraksi etil asetat dilaporkan mempunyai aktivitas penangkapan radikal DPPH (2,2’-difenil-1-pikrilhidrazil) dengan nilai IC50 sebesar 2,732 µg/mL; sementara kuersetin yang digunakan sebagai kontrol positif mempunyai IC50 sebesar 1,998 µg/mL (Permatasari dan Rohman, 2016). Biji rambutan mengandung polifenol dan beberapa senyawa golongan flavonoid yang telah berhasil diisolasi dari ekstrak etanol biji rambutan yaitu senyawa flavonol tersubstitusi gula pada posisi 7-O dengan gugus hidroksil pada posisi 3, 5, dan 4’, senyawa flavonol tersustitusi pada 3-O dan 7-O dengan gugus hidroksil pada posisi 5 dan 4’; dan senyawa flavonoid tersubstitusi pada 5-O (Asrianti dkk., 2006) Uji aktivitas penangkapan radikal ekstrak etanol, fraksi-fraksi dari kulit buah dan biji rambutan dengan menggunakan metode DPPH menunjukkan aktivitas paling tinggi pada fraksi etil asetat kulit rambutan dengan nilai IC50 = 4,29 µg/mL. Aktivitas tersebut lebih tinggi daripada vitamin E (IC50 (Khasanah, 2011).

22

vitamin E=

8,48 µg/mL)

C. Kerangka Konsep

Biji Buah Rambutan

Ekstraksi dengan Metanol

Fraksinasi dengan Petroleum Eter, Diklorometan dan Etil Asetat

Uji Antioksidan secara In Vitro:  Penentuan aktivitas penangkapan radikal DPPH  Penangkapan radikal ABTS  Penentuan daya reduksi  Penentuan Antioksidan dengan β-Karoten – Asam Linoleat  Penentuan Pengkelatan Logam

Penentuan kandungan fenolik dan flavonoid total

Isolasi komponen senyawa fraksi teraktif

Uji Kemurnian Isolat Aktif:  Metode titik lebur  Metode KLT

Identifikasi senyawa isolat:  Kromatografi Gas (cair)-spektrometer Massa  Spektrofotometer FTIR  Spektrometer NMR Analisis Hasil

23

D. Hipotesis 1. Ekstrak metanol dan fraksi-fraksi biji buah rambutan (N. lappaceum L.) memiliki aktivitas antioksidan yang ditentukan melalui serangkaian uji kemampuan untuk menangkap radikal DPPH dan ABTS, mereduksi besi (III), mengkelat logam berat dan uji pemucatan beta-karoten. 2. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan fraksi-fraksi biji rambutan (N. lappaceum L.) memiliki korelasi dengan kandungan fenolik dan flavonoid totalnya. 3. Komponen senyawa dari fraksi biji buah rambutan yang paling aktif sebagai antioksidan dapat diidentifikasi dengan metode spektroskopi.

24

Commented [SC4]: Ini sebnarnya belum menjawab pertanyaan tapi gak apa lah

BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan desain penelitian true eksperimental design (eksplorasi). B. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan yaitu biji buah rambutan yang diperoleh dari Kecamatan Mowila, Kabupaten Konawe Selatan, Provinsi Sulawesi Tenggara, Metanol teknis, etil asetat, diklorometan, petroleum eter, akuades, akuabides, asam formiat, asam asetat glasial, 2,2-difenil-pikrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO), Trolox (Sigma Aldrich), metanol pro analisis (Merck; Darmstadt, Germany), asam galat (Wako Pure chemical Industies), rutin (Sigma Aldrich), kuersetin (Sigma Aldrich), reagen Folin-Ciocalteau (Merck), bufer fosfat 0,2 M (pH 6,6), kalium ferisianida, besi(III) klorida, besi(II) klorida, vitamin C, asam triklorasetat (TCA), asam linoleat, asam tiobarbiturat (TBA), tween 40, EDTA, β-karoten, ferrozine, silika gel GF254, silika gel 80-120 mesh, pereaksi semprot sitoborat dan FeCl3, pereaksi uap ammonia, Na2CO3 7%, NaNO2 10%, AlCl3 10% dan NaOH 10%. C. Instrumen Penelitian Instrumen penelitian yang digunakan yaitu oven, blender, Erlenmeyer, corong pisah, kertas saring, vacuum rotary evaporator (IKA 10 Basic), bejana kromatografi, pipa kapiler, lampu UV254 dan UV366, penangas air, delivery pipet (Gilson pipetmen), inkubator, eksikator, sentrifuse, fortex, serangkaian alat vacum

25

Commented [SC5]: Ditambahi kapan dipanennya apakah saat buah berwarna hijau atau berwarna merah atau sudah merah bingit

Commented [SC6]: Ini gak perlu mirin yang lainnya juga yaa Formatted: Font: Not Italic Commented [SC7]: Seperti ini kasih kota sama negara Formatted: Font: Not Italic

liquid chromatography, kolom gravimetri, oven dan peralatan gelas. Alat untuk pengujian antioksidan: tabung reaksi, labu takar, dan pipet mikro. Spektrofotometer UV-VIS (Spectronic® 20 geneysTM), spektrometer IR (PERKIN ELMER FTIR 100), GC-MS (GCMS-QP2010S SHIMADZU). D. Jalannya Penelitian

Commented [SC8]: Punya LPPT itu Thermo Commented [SC9]: Punya lPPT itu thermo

1. Penyiapan ekstrak metanol biji buah Rambutan Biji buah rambutan (BBR) dibersihkan dari kulit arinya, lalu dicuci dengan air mengalir, kemudian dipotong-potong dan dikeringkan dengan cara dipanaskan di oven dengan suhu 65oC selama ±2 hari (sampai kering), lalu diserbuk. Serbuk

Commented [SC10]: Justifikasi kadar lembab/kadar air berapa? Jgn sampai kering gt

BBR dimaserasi 4 hari dengan 10 bagian metanol. Maserat dipisahkan dengan cara filtrasi dan filtrat yang dihasilkan dikumpulkan. Diulangi proses maserasi

Commented [SC11]: Predikat jangan di depan

(remaserasi) selama 2 hari dengan jumlah pelarut setengah dari jumlah maserasi pertama. Campuran disaring kembali dengan kertas saring, filtrat pertama dan kedua dikumpulkan. Selanjutnya seluruht filtrat dipekatkan dengan vacum rotary evaporator untuk menguapkan pelarutnya, sehingga diperoleh ekstrak kental metanol BBR. 2. Fraksinasi ekstrak kental BBR Ekstrak kental metanol BBR difraksinasi dengan petroleum eter (PE), diklorometan dan etil asetat. Masing-masing fraksi PBB, fraksi diklorometan dan fraksi etil asetat biji buah rambutan yang diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator. Fraksi yang diperoleh selanjutnya diuji aktivitas antioksidannya, kandungan fenolik dan kandungan flavonoid totalnya.

26

Commented [SC12]: PE atau PB?

3. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro a. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH Sebanyak 50 μL sampel uji dengan berbagai konsentrasi (Konsentrasi konsentrasi yang memberikan nilai IC50 yakni konsentrasi ekstrak/fraksi yang memberikan persen aktivitas penangkapan radikal sebesar 50% dibanding kontrol melalui suatu persamaan garis regresi linier/non-linear), ditambah dengan 1,0 mL DPPH 0,4 mM, dan 3,950 mL metanol. Campuran selanjutnya divorteks dan dibiarkan selama 30 menit. Larutan selanjutnya diukur absorbansinya serapannya pada panjang gelombang 517 nm terhadap blanko (yang terdiri atas 50 μL ekstrak dan 4,950 mL metanol). Dilakukan juga pengukuran absorbansi kontrol yang terdiri atas 1,0 mL DPPH dan 4,0 mL metanol. Sebagai pembanding digunakan vitamin E dan Vitamin C yang keduanya sudah diketahui sebagai antioksidan sebagaimana dilakukan oleh Kikuzaki dkk., (2002). Persen (%) penangkapan radikal =

(A o  A 1 ) x 100 Ao

Yang mana: Ao adalah absorbansi kontrol (tidak mengandung fraksi uji) dan A1 merupakan absorban dengan adanya sampel uji atau senyawa pembanding.

Commented [SC13]: Mending tulis sebagai keterangan aja dibandign gini ada kata yang mana itu lhoh

b. Penangkapan Radikal ABTS ABTS (7 mM dalam buffer natrium asetat 20 mM pH 4,5) ditambah dengan oksidan kalium persulfat 2,45 mM untuk menghasilkan radikal ABTS˙+ yang stabil dengan warna biru-hijau diikuti dengan inkknubasi selama 12-16 jam dalam ruangan gelap pada suhu 4°C. Larutan selanjutnya diencerkan hingga diperoleh nilai absorbansi 0,7 ± 0,01 pada panjang gelombang 734 nm untuk menghasilkan reagen uji. Aktivitas penangkapan radikal ABTS dilihat dengan mereaksikan 3 mL 27

Commented [SC14]: Mending tulis aja serapan, klo absorbansi ada akhir an asi kaya suatu proses e.g. standarisasi

reagen uji dengan sampel ekstrak/fraksi kemudian diinkubasikan pada suhu 30°C selama 30 menit. Adanya aktivitas penangkapan radikal akan menyebabkan intensitas warna ABTS˙+ menjadi menurun. Persentase penghambatan dihitung terhadap kontrol dan dibandingkan dengan kurva standar trolox pada kisaran 1- 100 mM (Wootton-Beard dkk., 2011) c. Penentuan Daya Reduksi Uji penentuan daya reduksi dilakukan dengan metode FRAP. Reagen FRAP disiapkan dengan membuat campuran buffer asetat 300 mmol/L (pH 3.6), 10 mmol/L 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniasiklopenta-1,4-diena klorida (TPTZ) (dalam 40 mmol/L HCl), dan feri klorida 20 mmol/L (10: 1: 1, v/v/v). terhadap 4,5 mL reagen ini ditambahkan 150 μL sampel ekstrak/fraksi. Setelah didiamkan selama 5 menit, absorbansi diukur pada panjang gelombang 593 nm. Bblanko terdiri dari reagen FRAP. Absorbansi akhir dari masing-masing sampel dibandingkan dengan absorbansi yang diperoleh dari kurva standar dari besi sulfat (FeSO4.7H2O) dengan rentang konsentrasi 200-1000 μmol/L. Hasil analisis diekspresikan dalam nmol Fe2+/mg ekstrak kering (Djordjevic dkk., 2011). d. Penentuan Antioksidan dengan β-Karoten – Asam Linoleat larutan baku kerja campuran β-karoten – asam linoleat disiapkan (0,5 mg βkaroten dalam 1 mL kloroform) dan ditambah sebanyak 25µL asam linoleat dan 200 mg tween 40. Kloroform diuapkan dengan evaporator vakum. Selanjutnya sebanyak 100 mL akuades yang dijenuhkan dengan oksigen (30 menit dengan kecepatan 100 mL/menit) ditambahkan dengan penggojokan kuat; Sebanyak 2,5 mL campuran ini didispersikan ke dalam tabung uji dan sejumlah sampel uji

28

(ekstrak.fraksi) ditambahkan, lalu sistem emulsi diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar. Prosedur yang sama juga dilakukan terhadap control positif BHT. Setelah periode inkubasi, absorbansi campuran diukur pada panjang gelombang 490 nm (Tepe dkk., 2006). e. Penentuan Pengkelatan Logam Sejumlah sampel uji (ekstrak/fraksi) ditambah dengan 0,05 mL FeCl2 2mM. Reaksi diawali dengan penambahan 0,2 mL ferrozin 5mM, campuran divortex selama 10 detik kemudian dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit. Setelah larutan mencapai kesetimbangan, absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 562 nm. Persentase penghambatan kompleks Fe2+-ferrozin dihitung sebagai berikut: Persen (%) penghambatan kelat =

A°−A1 A°

X100

Yang mana A0 adalah absorbansi kontrol (tidak mengandung ekstrak/fraksi) dan A1 adalah absorbansi dengan adanya sampel uji. Etilen diamin tetraasetat (EDTA) digunakan sebagai pembanding (Yu dkk., 2006). 4. Penentuan Kandungan Fenolik Total Diambil (20; 30; 40; 50 dan 60) µL larutan asam galat 1mg/mL, masingmasing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambah dengan 0,4 mL reagen Folin-Ciocalteu dan dibiarkan selama 5-8 menit. Larutan ditambah Na2CO3 7% sebanyak 4 mL dan akuabidestilata sampai tanda tera. Dilakukan pengukuran operating time salah satu larutan baku dan dilakukan untuk menentukan panjang gelombang maksimal. Seluruh seri konsentrasi larutan baku dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimalnya yaitu 750 nm terhadap blanko yang terdiri

29

dari akuabidestilata dan reagen Folin-Ciocalteu. Untuk analisis sampel, ditimbang sejumlah tertentu larutan sampel, dimasukkan ke labu takar 10 mL, dilanjutkan seperti pada kurva baku. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai % b/b ekivalen asam galat (% b/b EAG) (Rohman dkk., 2006). 5. Penentuan Kandungan Flavonoid Total Diambil (100; 200; 300; 400; 500 dan 600) µL larutan rutin 1 mg/mL, masingmasing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Larutan ditambah 4 ml akuabidestilata dan 0,3 mL larutan NaNO2 10%, lalu dibiarkan selama 6 menit. Setelah itu larutan ditambah dengan 0,3 mL AlCl3 10% dan dibiarkan selama 5 menit. Larutan ditambahkan dengan 4 mL NaOH 10% dan akuabidestilata sampai 10,0 mL. Dilakukan pengukuran operating time salah satu larutan baku dan dilakukan scanning untuk menentukan panjang gelombang maksimal. Seluruh seri konsentrasi larutan baku dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimalnya, yaitu 512 nm terhadap blanko (semua larutan diatas tanpa rutin). Untuk analisis sampel diambil sejumlah tertentu larutan sampel, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dilanjutkan seperti pada kurva baku. Kandungan flavonoid total dinyatakan sebagai % b/b ekivalen rutin (% b/b ER) (Rohman dkk., 2006). 6. Identifikasi komponen senyawa fraksi teraktif sebagai antioksidan a. Isolasi Fraksi teraktif sebagai antioksidan ditotolkan pada lempeng KLT preparatif dengan fase diam silica gel dan fase gerak berupa fase gerak dari hasil optimasi. Bercak kemudian disemprot dengan larutan DPPH. Bercak yang menunjukkan

30

pemucatan warna paling cepat dan paling intens selanjutnya dikerik kemudian dimurnikan dan dilakukan prosedur identifikasi. b. Uji kemurnian isolat aktif Uji kemurnian isolat teraktif dilakukan menggunakan 2 metode yaitu titik lebur dan KLT. Titik lebur kKristal diperiksa dengan alat Buchi Melting Point B540, dengan cara sedikit kristal diletakkan di dalam kapiler lalu diamati. Suhu dinaikkan secara perlahan dari suhu kamar. Suhu dicatat pada saat kristal mulai meleleh dan suhu pada saat kristal menjadi cair semua (meleleh semua). Pemeriksaan diulangi dengan mengatur suhu ± 10 °C di bawah titik lebur yang diperoleh dengan diatur kenaikan suhu 1 °C/menit secara perlahan lahan. Pemeriksaan diulang sebanyak 3 kali. Uji kemurnian isolat aktif dengan KLT dilakukan dengan menggunakan 3 jenis sistem eluen dengan indeks polaritas yang berbeda-beda. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan fase diam silica gel GF254, sedangkan fase geraknya menggunakan sistem pelarut dengan tingkat polaritas yang berbeda-beda. Deteksi bercak dilakukan secara visual dengan lampu UV pada 254 dan 366 nm. c. Identifikasi senyawa isolat Senyawa hasil pemurnian selanjutnya diidentifikasi dengan kromatografi gas (cair)-spektrometer massa, spektrofotometer FTIR dan spektrometer NMR. E. Analisis Data Data yang diperoleh dilakukan analisis dengan menggunakan persamaan regresi linear/non-linear untuk memperoleh nilai IC50, juga dilakukan analisis data secara statistik menggunakan analisis statistik ANOVA. Untuk karakterisasi

31

senyawa digunakan beberapa analisis yaitu untuk data spektrum IR dilakukan analisis berdasarkan daerah serapan tiap puncak yang teramati; sedangkan spektrum GC-MS dianalisis berdasarkan retensi waku dan hasil fragmentasi, dan untuk spektrum NMR dianalisis berdasarkan jumlah dan jenis puncak yang muncul pada frekuensi yang ditentukan.

32

JADWAL PENELITIAN Bulan Tahapan Kegiatan

Februari 1

2

3

Maret 4

1

Persiapan alat dan bahan Studi Pustaka Pengambilan sampel Pembuatan ekstrak dan Fraksinasi ekstrak Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro Identifikasi komponen senyawa aktif Analisis Data Penulisan naskah tesis

33

2

3

April 4

1

2

3

Mei 4

1

2

3

4

DAFTAR PUSTAKA

Alnajar, Z.A.A., Abdulla, M.A., Ali, H.M., Alshawsh, M.A., dan Hadi, A.H.A., 2012. Acute Toxicity Evaluation, Antibacterial, Antioxidant and Immunomodulatory Effects of Melastoma malabathricum. Molecules, 17: 3547–3559. Anagnostopoulou, M.A., Kefalas, P., Papageorgiou, V.P., Assimopoulou, A.N., dan Boskou, D., 2006. Radical scavenging activity of various extracts and fractions of sweet orange peel (Citrus sinensis). Food Chemistry, 94: 19– 25. Archibong, A.E., Rideout, M.L., Harris, K.J., dan Ramesh, A., 2018. Oxidative stress in reproductive toxicology. Current Opinion in Toxicology, 7: 95– 101. Asrianti, M., Ruslan, K., dan Nawawi, A., 2006. 'Telaah Fitokimia Biji Rambutan (Nephelium lappaceum L.)', , Skripsi, . Sekolah Farmasi ITB, Bandung. Bele, A.A. dan Khale, A., 2011. An overview on thin layer chromatography. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2: 256. Bethem, R., Boison, J., Gale, J., Heller, D., Lehotay, S., Loo, J., dkk., 2003. Establishing the fitness for purpose of mass spectrometric methods. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14: 528–541. Chauhan, A., 2014. GC-MS Technique and its Analytical Applications in Science and Technology. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques, 5: . Darbeau, R.W., 2006. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy: A Review and a Look at Its Use as a Probative Tool in Deamination Chemistry. Applied Spectroscopy Reviews, 41: 401–425. Das, K., Tiwari, R.K.S., dan Shrivastava, D.K., 2010. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agents: current methods and future trends. Journal of medicinal plants research, 4: 104–111. Djordjevic, T.M., Šiler-Marinkovic, S.S., dan Dimitrijevic-Brankovic, S.I., 2011. Antioxidant Activity and Total Phenolic Content in Some Cereals and Legumes. International Journal of Food Properties, 14: 175–184. Firuzi, O., Miri, R., Tavakkoli, M., dan Saso, L., 2011. Antioxidant therapy: current status and future prospects. Current medicinal chemistry, 18: 3871–3888. Griffiths, P.R., 2006. Far-Infrared Spectroscopy, dalam: Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd.

34

Gutteridge, J.M.C. dan Halliwell, B., 2010. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochemical and Biophysical Research Communications, 393: 561–564. Halliwell, B., 1995. How to Characterize an Antioxidant: An Update. Halliwell, B., 2011. Free radicals and antioxidants – quo vadis? Trends in Pharmacological Sciences, 32: 125–130. Halliwell, B. dan Gutteridge, J.M.C., 1989. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press. 'ITIS

Standard Report Page: Nephelium lappaceum', , 2017. URL: https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&sear ch_value=506073#null (diakses tanggal 7/1/2018).

Kataria, S., 2011. Gas chromatography-mass spectrometry: applications. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archive, 2: . Khasanah, A., 2011. 'Uji Aktivitas Penangkap Radikal Ekstrak Etanol, FraksiFraksi Dari Kulit Buah Dan Biji Rambutan (Nephelium Lappaceum L.) Serta Penetapan Kadar Fenolik Dan Flavonoid Totalnya', , Skripsi, . Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta. Kikuzaki, H., Hisamoto, M., Hirose, K., Akiyama, K., dan Taniguchi, H., 2002. Antioxidant Properties of Ferulic Acid and Its Related Compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 2161–2168. Kondeti, R.R., Mulpuri, K.S., dan Meruga, B., 2014. Advancements in column chromatography: A review. World Journal of Pharmaceutical Sciences, 2: 1375–1383. Kumar, M.H.V. dan Gupta, Y.K., 2002. Antioxidant property of Celastrus paniculatus Willd.: a possible mechanism in enhancing cognition. Phytomedicine, 9: 302–311. Kumar, M.K., Kaur, G., dan Kaur, H., 2011. Phytochemical screening and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia, 1: . Kumar, S., Jyotirmayee, K., dan Sarangi, M., 2013. Thin layer chromatography: a tool of biotechnology for isolation of bioactive compounds from medicinal plants. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 18: 126–132. Lehoux, S., 2006. Redox signalling in vascular responses to shear and stretch. Cardiovascular Research, 71: 269–279.

35

Lestari, S.R., Djati, M.S., Rudijanto, A., dan Fatchiyah, F., 2013. Production And Potency Of Local Rambutan At East Java As A Candidate Phytopharmaca. AGRIVITA Journal of Agricultural Science, 35: 270–276. Levine, M., Ramsey, S.C., Daruwala, R., Park, J.B., dan Wang, Y., 1999. Criteria And Recommendations For Vitamin C Intake 281: . Losada-Barreiro, S. dan Bravo-Díaz, C., 2017. Free radicals and polyphenols: The redox chemistry of neurodegenerative diseases. European Journal of Medicinal Chemistry, 133: 379–402. Milman, B.L., 2005. Identification of chemical compounds. Trends in Analytical Chemistry, 24: 493–508. Milman, B.L. dan Konopelko, L.A., 2000. Identification of chemical substances by testing and screening of hypotheses I. General. Fresenius’ journal of analytical chemistry, 367: 621–628. Nanda, R. dan Damodaran, K., 2018. A review of NMR methods used in the study of the structure and dynamics of ionic liquids: NMR studies of ionic liquids. Magnetic Resonance in Chemistry, 56: 62–72. Nawawi, A., Nakamura, N., Hattori, M., Kurokawa, M., dan Shiraki, K., 1999. Inhibitory Effects of Indonesian Medicinal Plants on the Infection of Herpes Simplex Virus Type. Phytother. Res, 13: 37–41. Ncube, N.S., Afolayan, A.J., dan Okoh, A.I., 2008. Assessment techniques of antimicrobial properties of natural compounds of plant origin: current methods and future trends. African journal of biotechnology, 7: . Okonogi, S., Duangrat, C., Anuchpreeda, S., Tachakittirungrod, S., dan Chowwanapoonpohn, S., 2007. Comparison of antioxidant capacities and cytotoxicities of certain fruit peels. Food Chemistry, 103: 839–846. Palanisamy, U.D., Ling, L.T., Manaharan, T., dan Appleton, D., 2011. Rapid isolation of geraniin from Nephelium lappaceum rind waste and its antihyperglycemic activity. Food Chemistry, 127: 21–27. Permatasari, L. dan Rohman, A., 2016. 2,2’-diphenil-1-picrylhydrazil (DPPH) Radical Scavenging Activity of Extracts and Fractions of Rambutan (Nephelium lappaceum L.) Peel. Research Journal of Phytochemistry, 10: 75–80. Poprac, P., Jomova, K., Simunkova, M., Kollar, V., Rhodes, C.J., dan Valko, M., 2017. Targeting Free Radicals in Oxidative Stress-Related Human Diseases. Trends in Pharmacological Sciences, 38: 592–607.

36

Prior, R.L., Wu, X., dan Schaich, K., 2005. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 4290–4302. Remington, J., 2005. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. Lippincott Williams & Wilkins. Rice-Evans, C.A. dan Diplock, A.T., 1993. Current status of antioxidant therapy. Free Radical Biology and Medicine, 15: 77–96. Rohman, A., Riyanto, S., dan Utari, D., 2006. Aktivitas antioksidan, kandungan fenolik total dan kandungan flavonoid total ekstrak etil asetat buah Mengkudu serta fraksi-fraksinya. Majalah Farmasi Indonesia, 17: 136– 142. Shah, R.S., Shah, R.R., Pawar, R.B., dan Gayakar, P.P., 2015. UV-Visible Spectroscopy- A Review. International Journal of Institutional Pharmacy and Life Sciences, 5: . Shi, H., Noguchi, N., dan Niki, E., 1999. Comparative Study On Dynamics of Antioxidative Action of A-Tocopheryl Hydroquinone, Ubiquinol, and ATocopherol Againts Lipid Peroxidation 27: 334–346. Stuart, B., 2004. Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications. John Wiley and Sons, United Kingdom. Tepe, B., Sokmen, M., Akpulat, H.A., dan Sokmen, A., 2006. Screening of the antioxidant potentials of six Salvia species from Turkey. Food Chemistry, 95: 200–204. Thitilertdecha, N. dan Rakariyatham, N., 2011. Phenolic content and free radical scavenging activities in rambutan during fruit maturation. Scientia Horticulturae, 129: 247–252. Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., dan Rakariyatham, N., 2010. Identification of Major Phenolic Compounds from Nephelium lappaceum L. and Their Antioxidant Activities. Molecules, 15: 1453–1465. Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., dan Rakariyatham, N., 2008. Antioxidant and antibacterial activities of Nephelium lappaceum L. extracts. LWT Food Science and Technology, 41: 2029–2035. Togo, H., 2004. Preface, dalam: Advanced Free Radical Reactions for Organic Synthesis. Elsevier Science, Amsterdam, hal. vii. Valentão, P., Fernandes, E., Carvalho, F., Andrade, P.B., Seabra, R.M., dan de Lourdes Bastos, M., 2002. Studies on the antioxidant activity of Lippia citriodora infusion: scavenging effect on superoxide radical, hydroxyl 37

radical and hypochlorous acid. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25: 1324–1327. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T.D., Mazur, M., dan Telser, J., 2007. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39: 44–84. Wahdaningsih, S., Setyowati, E.P., dan Wahyuono, S., 2011. Free Radical Scavenging Activity Of (Alsophila glauca J. Sm). Traditional Medicine Journal, 16: 156–160. Wall, M.M., 2006. Ascorbic acid and mineral composition of longan (Dimocarpus longan), lychee (Litchi chinensis) and rambutan (Nephelium lappaceum) cultivars grown in Hawaii. Journal of Food Composition and Analysis, 19: 655–663. Wall, M.M., Sivakumar, D., dan Korsten, L., 2011. Rambutan (Nephelium Lappaceum L.), dalam: Postharvest Biology and Technology of Tropical and Subtropical Fruits. Woodhead Publisihing Limited, Cambridge, hal. 312–333. Weyer, L. g. dan Lo, S.-C., 2006. Spectra– Structure Correlations in the NearInfrared, dalam: Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. Wootton-Beard, P.C., Moran, A., dan Ryan, L., 2011. Stability of the total antioxidant capacity and total polyphenol content of 23 commercially available vegetable juices before and after in vitro digestion measured by FRAP, DPPH, ABTS and Folin–Ciocalteu methods. Food Research International, 44: 217–224. Yu, H., Liu, X., Xing, R., Liu, S., Guo, Z., Wang, P., dkk., 2006. In vitro determination of antioxidant activity of proteins from jellyfish Rhopilema esculentum. Food Chemistry, 95: 123–130.

38