Proiect Cercetare.doc

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Determinarea antocianilor din varza roşie prn HPLC Disciplina: Cercetare aplicată

Materandă: Halasu Diana Rebeca SPCCPA, ANUL 1

Cluj-Napoca 2018

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Cuprins:

Rezumat 1.Introducere 2.Materiale şi metode 2.1. Standarde şi solvent 2.2. Procedura de extracţie 2.3. Analiza HPLC a extractului 3.Rezultate şi discuţii 4.Referinţe bibliografice

Rezumat

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Varza roşie este o legumă foarte bogată în antociani, care sunt utilizaţi în diferite industrii. Aceştia au numeroase efecte benefice asupra organismului uman, precum: reducerea proceselor inflamatorii şi a stresului oxidativ, , efecte antiangiogenetice, antidiabetice şi stimularea insulinei, etc. În lucrarea de față s-au extras antocianine derivațe din varza roșie și s-au identificat prin utilizarea unui sistem HPLC. Varza rosie conţine 90,5 mg antocianină / 100 g runze proaspete. Scopul acestei lucrări a fost de a dezvolta o metodă rapidă de extracție și analiză a antocianilor în varza roșie. Cuvinte cheie: varză roşie,antociani, coloană monolitică, solvent de extracţie, cromatografie.

1.Introducere Varza roșie (Brassica oleracea L. var. Capitata f. Rubra) aparține familiei Brassicaceae și este o legumă nativă din regiunea mediteraneană și sud-vestul Europei. Studiile privind influența speciilor Brassica asupra sănătății umane au dovedit capacitatea de a preveni bolile cardiovasculare, precum și activitatea lor împotriva unor tipuri de cancer. Printre substanțele care par a fi responsabile pentru aceste proprietăți sunt polifenolii, iar varza roșie este o sursă bogată de compuși fenolici cu antocianii fiind clasa cea mai abundentă. Antocianinele sunt pigmenți vacuolari solubili în apă care, depinzând de pH, pot să aibă culoarea roșie, violet sau albastru. Cuvantul provine din greacă: ἄνθος (anthos) „floare” și κυάνεος/κυανοῦςkyaneos/kyanous „albastru închis”). Cele mai bogate surse de antociani sunt fructele de pădure, precum afinele, soc, aronia, zmeură, legumele (varza roşie, tomatele, sfecla roşie) şi unele cereale. Antocianii prezintă o serie de proprietăţi benefice, dintre care cea mai importantă constă în efectul lor antioxidant. Beneficii importante:

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Antocianii nu se degradează în timpul digestiei şi acţionează asupra celulelor cu care vin în contact, dilatând în mod natural vasele sanguine. Ca dovadă, în cadrul unui experiment s-au descoperit antociani naturali nedegradaţi în urina voluntarilor sănătoşi care au consumat suc de coacăz şi boz. Drept urmare, a-a observat o scădere a activităţii cardiace, minimizarea riscului de infarct, dar şi reducerea stresului oxidativ. Aplicatii potentiale: utilizări terapeutice, sub formă de extracte crude, formule sinergistice; utilizări sub formă de suplimente alimentare; aplicaţii potenţiale în domeniul alimentar (coloranţi, alimente funcţionale); aplicaţii în industria textilă; în industria cosmetica; utilizări ca indicatori acido-bazici în titrimetrie.

2.Materiale şi metode 2.1.Standarde şi solvenţi:  metanol; apă distilată; HCl; acetat de etil;

acid formic; acetonitril.

2.2. Procedura de extracţie Frunzele proaspete de varză au fost mărunţite, omogenizate cu amestecul : metanol / apă distilată / HCI 1% și centrifugate. Supernatantul a fost colectat ca un extract brut de varză roșie. Pentru a obține materia uscată, extractul s-a uscat într-un evaporator rotativ vid într-o baie de apă la 40 ° C. S-a preparat soluţia condensată cu MeOH acidifiat 10% şi apoi s-a purificat pe mini-coloana C18 SPE cu încărcătura ridicată activată anterior cu MeOH. Folosind această metodă probele (1,5 ml) s-au desalinizat cu HCl 0,01% înainte de îndepărtarea fenolilor mici prin clătire cu acetat de etil. Apoi, coloana a fost eluată cu gradienți MeOH acidifiați în următoarea ordine: 10, 20, 50 și 80%. Volumul solvenților utilizați a fost întotdeauna 5 ml pe coloană (~ 3 x volum de probă).

2.3.

Analiza HPLC a extractului

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Profilurile fenolice din extractele de varză roșie purificate au fost determinate utilizând un sistem Knauer HPLC echipat cu: detector UV-Vis si coloană Eurospher-100 C-18 (25 cm x 4,6 mm, 5 μm). Faza mobilă binară a fost formată din apă / acid formic (90:10, v / v) (solvent A) și apă / acetonitril / acid formic (40:50:10, v / v / v) (solvent B). Fenolii au fost împărţiţi în 4 subclase și cuantificați pe baza absorbției maxime UV-Vis a fiecărui grup. Derivații acidului hidroxibenzoic s-au cuantificat la 280 nm și s-au exprimat ca echivalenți de acid galic, derivați ai acidului hidroxicinamic la 320 nm ca echivalenți ai acidului clorogenic, flavonolii la 360 nm ca echivalenți de rutină și antocianii la 520 nm ca echivalenți ai cianidin -3glucozid.

3. Rezultate si discutii Rezultatele HPLC ale extractului metanolic purificat au indicat prezența derivaților de acid cinamic în frunzele de varză roșie. Acesta conține, în principal, acizi hidroxicinamici și antociani care au predominat, constituind 84% din totalul fenolicilor .

Un profil cromatografic tipic al extractului de varză roșie (Figura 1) prezintă vârfurile antocianinelor examinate în acest studiu. Utilizând caracteristicile spectrale de vârf λ440, λvis, λacyl și absorbțiile lor corespunzătoare E440, Evis, Eacyl, a fost posibilă identificarea antocianinelor ca mono- sau biozidă și pentru a determina gradul de acilare aromatică.

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Figura 1. Cromatograma reprezentativă a extractului de varză roşie raportată la 520 nm Utilizarea unei coloane monolitice a oferit posibilitatea de a obține separarea a 24 antociani întrun timp foarte scurt (18 min) (Figura 1). Mai mult, echilibrarea rapidă a coloanei monolitice a condus, de asemenea, la o cantitate mai mare de probe. Metodele raportate în literatură pentru analiza amestecurilor complexe de antociani necesită mai mult de 30 de minute de extracție și preparare de probe și mai mult de 70 de minute de timp de separare a cromatografiei lichide. Prin utilizarea unei metode de extracție sub presiune a solventului și a unei coloane monolitice cuplate la un detector cu diodă, timpul total de extracție și analiză a fost mai mic de 30 de minute. Cantitatea totală de antociani per gram de varză roșie proaspătă, cu metoda PFE optimizată, a fost de 662 μg / g (± 3); cu extracția de control de 30 și 60 min au fost 242 pg / g (± 8) și respectiv 302 pg / g (± 5); și 680 μg / g (± 11) când s-a utilizat extracția convențională cu etanol. Nu în ultimul rând, utilizarea solventului sub presiune pentru extracția antocianilor permite utilizarea unei cantități relativ mici de solvent de extracție, cea mai mare parte fiind apă (94% în volum), împreună cu cantități mici de etanol (5% în volum) și acid formic (1% în volum); fapt care face ca această nouă metodă de extracție să fie mai ecologică decât cele mai convenționale. În concluzie, această lucrare raportează rezultatele unui protocol nou și rapid pentru analiza antocianelor de varză roșie, utilizând tehnologia de extracție cu solvent sub presiune și tehnologia de separare a coloanelor monolitice.

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

4. Referinţe 1. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996912005388 2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S138614251830012X 3. Wieslaw

Wiczkowski,

Dorota

Szawara-Nowak,

JoannaTopolska-

Red

cabbage

anthocyanins: Profile, isolation, identification, and antioxidant activity, 2012 4. MS JIE ZHANG , ZHIDONG WANG1 and XINGGUO LIU- CHARACTERIZATION OF ACYLATED ANTHOCYANINS IN RED CABBAGE VIA COMPREHENSIVE TWO-DIMENSIONAL HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND HPLC, 2016 5. EFFAT RIZK- Evaluation of red cabbage anthocyanin pigments and its potential uses as antioxidant and natural food colorant, 2009 6. Tanya K. Gachovska, David A. Cassada, Jeyamkondan Subbiah, Harshavardhan Thippareddi- Enhanced Anthocyanin Extraction from Red Cabbage Using Pulsed Electric Field Processing, 2010 7. Yijun Chen, Zikun Wang, Hanghang Zhang, Yuan Liu, Shuai Zhang, Qingyan Meng ,Wenjie Liu - Isolation of High Purity Anthocyanin Monomers from Red Cabbage with Recycling Preparative Liquid Chromatography and Their Photostability, 2018 8. Nafiz Oncu, Can Goksel, Arli Zeki Atkosar- Rapid determination of free anthocyanins in foodstuffs using high performance liquid chromatography, 2012.