Produccion-de-enzimas-microbianas-proyecto-final (1).docx

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PROYECTO DE CURSO PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS AUTORES: -

Bazán Arribasplata Sandra Noemí

-

Romero Romero Kelly Analí

ASESOR: Mg. Mechato Anastacio, Augusto Antonio

GUADALUPE – PERÚ 04/01/2018

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2018

RESUMEN Las enzimas son biocatalizadores, pero también pueden considerarse como aditivos altamente específicos para aplicaciones en alimentos. En este informe se describen aspectos tecnológicos relacionados con la producción de enzimas por procesos fermentativos. Se tratan diversos aspectos que son clave en la elaboración de enzimas: obtención de cepas microbianas, aspectos bioquímicos, cinéticos y de regulación, así como elementos importantes a considerar en el diseño de procesos. Se incluye igualmente la descripción de operaciones unitarias frecuentes en la recuperación.

ABSTRACT

Enzymes are biocatalysts, but they can also be seen as highly specific additives for food applications. This report presents technical aspects related to the production of enzymes by fermentation processes. These are some of the most important aspects in the elaboration of enzymes: obtaining microbial strains, biochemical, kinetic and regulatory aspects, as well as important elements to consider in the design of processes. It also includes the description of the frequent unit operations in the recovery.

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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. GENERALIDADES 1. TÍTULO PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS 2. PERSONAL DE INVESTIGACIÓN 2.1. Nombres y apellidos

: -Bazán Arribasplata Sandra Noemí - Romero Romero Kelly Analí

2.2. Departamento

: Ciencias Agroindustriales

2.3. Facultad

: Ciencias Agropecuarias

2.4. Categoría

: Estudiantes de Ingeniería Agroindustrial

3. ASESOR

3.1. Apellidos y Nombres

: Mechato Anastacio, Augusto Antonio

3.2. Grado Académico

: Magister en Ciencias

3.3. Institución

: Universidad Nacional de Trujillo

3.4. Facultad

: Ciencias Agropecuarias

3.5.

: Ingeniería Agroindustrial

Escuela

4. TIPO DE INVESTIGACIÓN 4.1. De acuerdo a la orientación: Teórico-Aplicativo 4.2. De acuerdo al diseño de la investigación: Explicativa UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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5. ÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN Libre. 6. INSTITUCIÓN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO Escuela de Ingeniería

Agroindustrial

de

la

Facultad

de

Ciencias

Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo.

7.

LOCALIDADE

E

INSTITUCION

DONDE

SE

EJECUTARÁ

EL

PROYECTO

8.

7.1. Institución

: Universidad Nacional de Trujillo - Valle Jequetepeque

DURACIÓN

: 4 meses

- Fecha de Inicio

: Septiembre de 2017

- Fecha de Término :

Agosto

de 2017

9.

HORAS DEDICADAS AL PROYECTO

a Semanas

: 16

b. Horas/Semana

:8

.

Total de horas

: 128

10. RECURSOS

10.1 Personal UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Autor

: -Bazán Arribasplata SandraNoemí -Romero Romero Kelly Analí

Asesor (a)

: Mechato Anastacio, Augusto Antonio

10.2 Locales Laboratorio de

Ingeniería Agroindustrial, Centro experimental de

Ciencias Agropecuarias “Henry Castañeda Rojas”, Universidad Nacional de Trujillo Sede Valle Jequetepeque.

11. FINANCIAMIENTO Propio.

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I. INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas que actúan como aceleradores de las reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos, éstas se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su funcionamiento. Éstas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la alimenticia, por ejemplo, en la obtención de yogurt, o la producción de cerveza o de vino, ya que el proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en los microorganismos que intervienen en su producción. Sin embargo, para mejorar los procesos de producción, pueden utilizarse enzimas aisladas, sin incluir a los microorganismos que las producen. Desde hace unas décadas se dispone de enzimas relativamente puras extraídas industrialmente de bacterias, hongos, plantas y animales, con una gran variedad de actividades, pero hoy en día se han desarrollado más fuentes para la producción de enzimas que permiten su aplicación en diversos procesos, lo cual ha originado un área interdisciplinaria llamada ingeniería enzimática, como nuevo enfoque de la biotecnología.

En la actualidad se ha logrado obtener enzimas más puras, con varias ventajas: acción más específica en su función catalítica; actividad predecible y controlable, uso de concentraciones más elevadas del sustrato.

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II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

2. ANTECEDENTES Las enzimas han sido empleadas en la industria desde hace muchos años. Las principales aplicaciones actuales, así como las perspectivas para el mediano y largos plazos, han sido analizadas por muchos estudiosos, por lo que se en éste informe se analizan los aspectos relacionados con la producción de enzimas a partir de microrganismos. La ingeniería enzimática se inicia en el siglo pasado, cuando Takamine patentó las amilasas (diastasa) producida por hongos en fermentación sólida y Hansen inició, en 1875, una empresa para la extracción de renina de ternera. Takamine se instaló posteriormente en Estados Unidos, alrededor de 1890, para producir la takadiastasa, una mezcla de amilasa y proteasas de Aspergillus oryzae. Para el primer cuarto de este siglo, ya se empleaban enzimas proteolíticas de origen animal y vegetal, habiéndose otorgado una patente de Wallerstein para el uso de papaína en la clarificación en frío der cerveza y la famosa patente a Rohm en 1913 para el uso de tripsina en detergentes. En Francia, en ese mismo año, Boidin y Effront desarrollaron la producción de amilasas de Bacillus subtilis, para ser usadas en la industria textil. El uso de pectinasas en la industria frutícola se inició lentamente en 1930. Sin embargo, es necesario llegar hasta alrededor de 1955 para efectuar el primer escalamiento de un proceso de producción de enzimas por fermentación: la glucoamilasa. Aún durante los 60 las enzimas provenientes de plantas o tejidos animales eran económicamente de mayor importancia que las microbianas. Hasta 1965 las ventas de enzimas de la industria Novo (la más importante en el sector), no pasaban del millón de dólares al año. El explosivo desarrollo de las enzimas proteolíticas de origen bacteriano empleadas en detergentes invirtió más rápido de lo esperado esta situación. Para 1969 las ventas de Novo de enzimas sobrepasaban los 50 millones de dólares. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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La experiencia ganada en este terreno permitió más tarde la aplicación de las técnicas de producción, recuperación, purificación y formulación, a otras enzimas de interés industrial. De especial importancia resulta en este caso la formulación, a otras enzimas de interés industrial. De especial importancia resulta en este caso la formulación del producto, pues fue necesario establecer preparaciones libres de polvos para evitar problemas al personal empleado en las plantas productoras. Es conveniente antes de analizar los sistemas de producción de enzimas, considerar ciertos aspectos de escala, ya que un gran número de técnicas disponibles a nivel de laboratorio, resultan incosteables o técnicamente no factibles a nivel industrial. Dentro de las diversas enzimas comerciales, los mercados hacen que las escalas de producción varíen drásticamente. Así, mientras que la proteasa bacteriana se produce en fermentadores hasta de 450 m3, las enzimas intracelulares son producidas en fermentadores cuyo volumen varía entre 3 y 30 m 3, que permiten manejar entre 1 y 10 Kg de pasta microbiana: a manera de comparación, hasta 1988 los fermentadores para producción de anticuerpos monoclonales no exceden los 2000 litros. Como evidente conclusión, la industria productora de enzimas gira alrededor de varios productos ya que sólo una enzima como la proteasa bacteriana justificaría una planta productora, probablemente alguna de las enzimas amilolíticas también, pero la realidad es que no hay compañía dedicadas a la producción de un único producto enzimático.

II. OBJETIVOS -

Conocer el aporte de los microorganismos más importantes en la producción de enzimas a nivel industrial.

-

Establecer las ventajas de la producción enzimática a partir de microorganismos.

-

Destacar la importancia de la Biotecnología y Bioingeniería en el campo agroindustrial.

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III. JUSTIFICACIÓN La implementación de microorganismos en los diversos procesos biotecnológicos ha incrementado progresivamente, debido a que éstos pueden complementar, y en algunas ocasiones reemplazar los procesos anteriormente usados, causando un menor impacto negativo en la naturaleza y proporcionando más ventajas, ya que representan una disminución en los costos de producción y mayor rendimiento. Son muchas las aplicaciones de los microorganismos, sin embargo, el presente blog está encaminado a la producción de enzimas, actividad de gran importancia en la optimización los procesos que necesitan ser catalizados y en el control de enfermedades por deficiencia enzimática, por ello, es preciso ampliar el conocimiento acerca de dicha acción microbiana en los procesos biotecnológicos de la industria y la salud. La información contenida en éste artículo busca dar a conocer el papel de los microorganismos en la producción de enzimas con la intención de motivar a todas aquellas personas interesadas en el tema a profundizar en este proceso que despierta gran interés en la actualidad.

IV. MARCO TEÓRICO UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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CAPÍTULO I Enzimas Microbianas 3.1 Enzimas Las enzimas son catalizadores de origen biológico. Son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presión, pH, etc. Son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de un compuesto quiral. Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga varias posiciones modificables. Las enzimas se pueden obtener de tres fuentes, tanto de origen animal, vegetal como microbiano (levaduras, hongo y bacterias): la elección de una u otra fuente depende de varios factores como son la estabilidad, especificidad de sustrato, temperatura y pH óptimo, coste, inocuidad, abundancias… Sin embargo, la producción de enzimas a partir de microorganismos presenta ciertas ventajas económicas y técnicas, ya que permite su producción a gran escala con un rendimiento predecible, hay una disponibilidad continua y no hace falta diseccionar animales, por no olvidar que como hay gran versatilidad de microorganismos se puede obtener un gran número de enzimas diferentes. Además, hoy en día gracias a la ingeniería genética se pueden desarrollar mutaciones en el metabolismo de los microorganismos para que estos produzcan más cantidad de enzima. El primer paso para la producción de enzimas es la elección del microorganismo adecuado, lo cual dependerá de las características de la enzima a producir. Una vez elegido el microorganismo, se le deja crecer en condiciones adecuadas de pH, temperatura y aireación. A continuación, se debe extraer la enzima, lo cual depende de si la enzima es extracelular, intracelular o periplasmática (ver figura). De manera que si UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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es extracelular no hay que romper ninguna membrana, pero si es intracelular hay que romper tanto la membrana externa como la interna, y si es periplasmática sólo la membrana externa. Para estos dos últimos casos existen diferentes métodos de rotura celular tanto químicos (con disolventes orgánicos, detergente, choque osmótico) como físicos (sonicación, cizalla líquida o sólida, congelación y descongelación).

Figura 1. Representación esquemática de una bacteria Fuente. M. García, 2002 Una vez extraída la enzima, esta se aísla, es decir se eliminan todos los ácidos nucleicos que han sido liberados al medio tras la rotura celular, y partículas sólidas como fragmentos de membrana y células parcialmente rotas. Después se concentra y enriquece y por último se purifica. La producción de enzimas microbianas a nivel industrial se lleva a cabo por 2 métodos: a) Fermentación en superficie (método Koji): solo para obtener enzimas extracelulares b) Cultivo sumergido: se lleva a cabo en grandes fermentadores o biorreactores que controlan perfectamente las condiciones de cultivo. En la actualidad se producen gran cantidad de enzimas microbianas utilizadas en múltiples áreas: industria alimentaria, textil, farmacéutica y papelera. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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3.1.1

Enzimas Microbianas

Las enzimas microbianas, en la última década, han sido empleadas en industrias que van desde alimentos hasta la biología molecular. Debido a que muchos microorganismos son una fuente excelente de producción de enzimas, en la actualidad, esta fuente ha sido una matriz para el desarrollo de nuevos productos industriales (Thieman y Palladino, 2010). Las enzimas microbianas son un grupo de proteínas que aceleran las reacciones químicas (Gurung et al., 2013). Las enzimas microbianas han sido probadas en múltiples áreas como la medicina, textiles, biosoluciones, et al. Uno de los primeros procesos fue en la biología molecular en donde se utilizó polimerasas de ADN y enzimas de restricción procedentes de bacterias (Thieman y Palladino, 2010). Aisladas de E. coli, las polimerasas de ADN se usan en técnicas de ADN recombinante (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013). La descomposición de moléculas que realizan las enzimas microbianas determina su función. Por ejemplo, la enzima celulasa, descompone la celulosa, un polisacárido que se encuentra en las plantas. Además, se la utiliza para suavizar y desteñir pantalones, esto gracias a derivados provenientes de Trichoderma reesei y Aspergillus niger. Esta celulasa degradan parte de los filamentos de algodón que se quedan en los pantalones dando como resultado una tela más suave (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). Tambien, el uso de la enzima proteasa subtilisina, proveniente de Bacillus subtilis, en la actualidad es parte importante de varios detergentes, cuya función es degradar y quitar manchas de origen proteico en prendas de vestir (Martínez y García, 2014). Además, un cierto número de enzimas bacterianas se utilizan tambien para emplear alimentos, tales como las enzimas que descomponen carbohidratos llamadas amilasas, que degradan almidón; proteasas, que degradan otras proteínas; y lipasas, que descomponen grasas (Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015).

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Figura 1. Actividad de la enzima Fuente. K. Aunstrup, 1979

3.1.2

Ventajas del uso de enzimas microbianas

Las enzimas microbianas poseen ventajas como especificidad en las reacciones catalíticas, transformación de una forma de energía a otra, manejo moderado de concentraciones de sustrato. Además, son moléculas de mucha importancia debido a que determinan la pausa en las modificaciones químicas (Anbu, 2015). En aspectos como la fermentación disminuyen el gasto energético y valor de producción (Wackett, 2015). También, poseen mayor capacidad de adatarse a un medio y por ende poseen un alto potencial de formación de colonias, con el fin, de mejorar la capacidad catalítica y proveer beneficios mutuos de actividad enzimática 3.1.2.1 Gran capacidad catalítica y sintética La particularidad de muchas enzimas son su dominio catalítico y su especificidad. La catálisis se desarrolla en un lugar específico de la enzima conocida como centro activo. Las proteínas son macromoléculas son eficaces para catalizar alta variedad de reacciones químicas, debido a su eficacia a la hora de unirse a un gran número de moléculas. Además, las enzimas catalizan las reacciones en base a la estabilización de los estados de transición (Stryer, Berg y Tymoczko, 2013).

3.1.2.2 Potencial amilolítico de microrganismos Las enzimas que hidrolizan moléculas de almidón, incluyendo pequeños polímeros de glucosa se denominan amilasas. Estas enzimas pueden ser sintetizadas por UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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animales, plantas y microorganismos. Se dividen en α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas. Estas enzimas poseen beneficios a la biotecnología, industria de textiles y alimentación. Una de las más importantes son las catalíticas: beta-amilasa y isoamilasa que forman parte de gran variedad de bacterias y hongos (Vanegas, Méndez & Murillo, 2015). Además, las enzimas microbianas poseen potencial celulítico y lignolítico de enzimas que aportan beneficios en la obtención de metabolitos que se utilizan de forma industrial, mediante el uso de biodegradación de proteínas de celulosa, almidón y lignina (Buitrago, Sánchez y Guerrero, 2014).

3.1.3 Fuente de enzimas  

Las enzimas pueden ser de origen vegetal, animal y microbiana. Entre las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las proteasas, carbohidrasas, las cuales descomponen residuos de azúcares de carbohidratos superiores, a-



amilasas y b-amilasa Entre las enzimas de tipo animal están las esterasa (Lipasa se produce en la mucosa gástrica, el páncreas, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales óseo,

 3.1.4

muscular, tripsina y quimotripsina se produce en el páncreas) Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias, arqueas y de hongos. Estabilidad de enzimas

La principal restricción del uso de enzimas como biocatalizadores de proceso radica en su inherente labilidad derivada de su compleja estructura molecular. La estabilidad de una enzima puede definirse como la capacidad de retener su actividad en una condición ambiental determinada. Son importantes la temperatura y la presencia de compuestos químicos inactivantes. Diversas estrategias han sido elaboradas para producir biocatalizadores intrínsecamente más estables y para incrementar la estabilidad durante el proceso catalítico. Entre las estrategias elaboradas para producir enzimas más estables y para incrementar la estabilidad durante el proceso catalítico se encuentra el uso de M.O. extremófilos y de

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organismos mutantes y recombinantes, obtenidos por técnicas de mutagénesis dirigida e ingeniería genética, como fuentes de enzimas de elevada estabilidad. Otra estrategia para asegurar la estabilidad es el uso de enzimas soportadas o contenidas en matrices y el uso de enzimas en medios de reacción no convencionales. Las enzimas inmovilizadas pueden ser notablemente más estables que sus contrapartes solubles, al reducirse la movilidad molecular y crearse un microambiente eventualmante protector.

3.1.5

Enzimas Extracelulares

Todos los organismos producen enzimas de actividad muy variada y en general en cantidades bajas para sus procesos celulares. Un caso particular es el de los microorganismos que pueden producir algunas enzimas en concentraciones muy altas y las excretan al medio. Las enzimas extracelulares son capaces de digerir muchos materiales poliméricos insolubles como celulosa, almidón, proteínas; cuyos monómeros son utilizados como nutrientes por los microorganismos.

3.1.6

Uso de enzimas

Una cantidad importante de las enzimas se utilizan en alimentos, para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumo humano, se deben de cumplir una serie de requisitos legales, que se centran en que tal microorganismo debe figurar en la llamada lista “GRAS” (generally aknowledged as secure), es decir, que haya demostrado una larga historia de seguridad. También se utilizan enzimas para producir sustancias de uso médico e industrial, sin tener que usar microorganismos completos, esto tiene como ventaja que evita problemas de contaminación y reduce pasos de separación. 3.1.7

Extremozimas

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Los microorganismos extremófilos son capaces de crecer a altas temperaturas, en algunos casos por encima de la temperatura de ebullición del agua. Los hipertermófilos son capaces de crecer a estas temperaturas tan altas porque producen moléculas estables al calor, incluidas enzimas. Se utiliza el nombre de extremozima para referirse a enzimas que funcionan a temperaturas extremadamente altas, pero también a aquellas que funcionan bien a cualquier condición, frío o altas concentraciones salinas o ph ácidos. Muchos procesos industriales funcionan mejor a altas temperaturas, por lo que las extremozimas provenientes de microorganismos hipertermófilos se están haciendo cada vez más atractivas como biocatalizadores para las aplicaciones industriales y también para uso en investigación, que requieren enzimas. Muy conocidas son la Taq y Pfu polimerasas que se utilizan en la reacción de la PCR. 

Otras extremozimas producidas por M.O. hipertermófilos son: proteasas, celulasas, pululanasas y xilanasas extremadamente termoestables. Thermococcus litoralis, relacionado con Pyrococcus woesei produce una pululanasa catalíticamente más activa a 118oC. Pyrococcus furiosus produce una ferredoxina, proteína ferro-sulfurada implicada en transporte electrónico, activa a temperaturas similares y que no se desnaturaliza hasta 140oC.

 

Otras extremozimas son activas a bajas temperaturas, enzimas psicrófilas. Otras son activas en presencia de altas concentraciones de sales (de halófilos) o activas a pH muy altos o muy bajos (de alcalófilos y acidófilos respectivamente y muy seguramente serán utilizadas en los próximos años a nivel industrial en situaciones que requieren biocatálisis en condiciones extremas.

3.1.8

Enzimas inmovilizadas

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Para su utilización en procesos industriales, es mejor utilizar una enzima en forma inmovilizada. La inmovilización no sólo hace más fácil realizar la reacción en condiciones a gran escala, sino que además estabiliza la enzima frente a la desnaturalización. Existen tres formas de realizar la inmovilización: 1. Formación de enlaces transversales (polimerización) de las moléculas de la enzima. 2. La unión de las moléculas de enzima entre si se suele hacer mediante reacción química con un agente bifuncional formador de enlaces transversales, como el glutaraldehido, reaccionando grupos aminos con este reactivo. 3. Si se hace la reacción adecuadamente, la enzima puede mantener la mayor parte de su actividad. 

En algunos casos no es necesario usar la enzima purificada.



Las células ricas en enzimas pueden ser inmovilizadas y realizar el proceso industrial en forma continua.



Bacillus coagulans que produce glucosa isomerasa, se utiliza para la producción de jarabe de cereales rico en fructosa.



El jarabe rico en fructosa se hace pasar a través de columnas que contienen las células inmovilizadas y se produce el jarabe de fructosa.



Las instalaciones son más pequeñas.

3.1.9

Enzimas recombinantes

Utilizando DNA recombinante ha sido posible producir una serie de enzimas de gran utilidad en la actualidad. La producción de enzimas por microbiología industrial era ya un negocio floreciente antes de la era del DNA recombinante, pero precisamente la I.G. se adapta perfectamente a los objetivos de mejora de esta biotecnología comercial, y empezó a usarse de modo casi inmediato en cuanto estuvieron a punto las técnicas. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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La ingeniería genética está realizando progresos importantes en la producción de enzimas recombinantes en microorganismos. Para garantizar la seguridad de su uso debe controlarse que los microorganismos de donde se extraen no sean patógenos, ni fabriquen compuestos tóxicos. Los ideales son aquellos que tienen una larga tradición de uso en los alimentos como las levaduras de la industria cervecera y los fermentos lácticos. Bacillus, Aspergillus y Sacharomyces son tres especies de microorganismos bien conocidas, su manipulación es segura, son de crecimiento rápido y producen grandes cantidades de enzimas, generalmente mediante fermentación. El medio de cultivo óptimo para estos microorganismos es igualmente bien conocido, lo que reduce los costos de experimentación. Cuando una enzima nueva es identificada en un microorganismo, el gen que codifica para la misma puede ser transferido a cualquiera de las especies anteriores. De esta manera se puede producir mayor cantidad de dicha enzima en el tanque de fermentación. El producto obtenido, la enzima recombinante, es de mayor pureza, lo cual contribuye a una mejor calidad del producto. •

En la industria alimentaria:  Quimosina recombinante (rennina) para la elaboración de quesos. Muy empleada en EE.UU y Gran Bretaña (90% de los quesos duros), sustityendo a la escasa quimosina de terneros y a la biotecnológica tradicional obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothia parasitica). La quimosina recombinante se obtiene en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados.  Somatotropina bovina recombinante parece estimular la producción de leche de vacas en los EE.UU. (aprobada por la FDA en 1994)

•

En la industria de detergentes:

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 La Lipolasa® de Novo-Nordisk (ahora Novozymes) es la primera enzima recombinante aprobada para detergentes. El gen de esta lipasa, aislado de hongo filamentoso Humicola se transfirió a Aspergillus oryzae.  La cutinasa de Fusarium, buena degradadora de ácidos grasos, se expresa por ingeniería genética en la levadura Saccharomyces cerevisiae. •

Entre las proteasas, hay que destacar la subtilisina de Bacillus licheniformis y B. amyloquefaciens, que ayuda a eliminar manchas de sangre, comida, etc. Por ingeniería de proteínas ha sido posible mejorar las ya de por sí buenas cualidades de la subtilisina, creando variantes resistentes a la oxidación por peróxido de hidrógeno

derivado

de los

perboratos,

resistentes

a

pH

alcalinos

y

termorresistentes.

CAPÍTULO II

3.2 El Microorganismo Los microorganismos pueden ser considerados en términos generales con dos criterios que son antagónicos. Uno corresponde a las actividades útiles que tienen algunos para obtener bienes o servicios y otro completamente distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que están generalmente asociados a la producción de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y que también se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos. El primer aspecto a considerar en el desarrollo de un sistema de producción de enzimas, es desde luego, la selección del microrganismo adecuado para el proceso. Es en este renglón donde se tiene el mayor impacto de los avances recientes de la biotecnología. Consideremos primeramente las características deseables de un microorganismo:

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El microorganismo no debe ser patógeno, ni estar asociado con la producción de toxinas. Los aspectos de reglamentos de la FDA (Food and Drug Administration), consideran GRAS a una enzima producida por un microorganismo GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro). De no ser así, la enzima es catalogada como aditivo y se ve sujeta a largas y costosas pruebas para demostrar su inocuidad lo que puede retrasar la aplicación de un nuevo desarrollo de 5 a 8 años. Por esta razón, un gran número de enzimas comerciales son producidas por A. niger, A. oryzae, B. subtilis. En la Tabla 1, se muestra una lista de ejemplos de microorganismos GRAS.

-

En principio, es preferible que la enzima sea producida extracelularmente. En los procesos de recuperación, además de la etapa adicional de ruptura celular, un extracto crudo de una enzima intracelular, contiene al menos 1500 enzimas y proteínas, mientras que el de una enzima extracelular contiene sólo unas cuantas. A este respecto conviene señalar que la aplicación de células enteras conteniendo alguna actividad enzimática de interés, evita la costosa etapa de recuperación y purificación.

-

La enzima debe ser producida con altos rendimientos, por lo que, en general, el desarrollo del microorganimo implica algún tipo de mutación clásica con rayos UV o bien agentes nitrogenados.

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Aspergillus niger Aspergillus oryzae Rhizopus oryzae Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Morteirella vinaceae Rhizopus niveus Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis kluyveromyces lactis Streptomyces rubiginosus Actinoplanis missouriensis Streptomyces olivaceus Streptomyces

α-amilasa, celulasa, glucoamilasa,lactasa, pectinasa catalasa, glucosa oxidasa, proteasa, lipasa α-amilasa, glucoamilasa, lactasa, lipasa α-amilasa, glucoamilasa, pectinasa α-amilasa, proteasa α- amilasa α- galactosidasa glucoamilasa invertasa lactasa lactasa glucosa isomerasa glucosa isomerasa glucosa isomerasa glucosa isomerasa

olivochromogenes Bacillus coagulans glucosa isomerasa Artrobacter globiformis glucosa isomerasa Micrococcus lysodeikticus catalasa Bacillus cereus renina Endothia parasitica renina Mucor mihei renina, lipasa-esterasa Mucor pusillus renina Tabla 1. Ejemplos de microorganismos productores de alguna enzima cuya aplicación haya sido aceptada como aditivo en alimentos (FDA o CFR) * Fuente. Food and Drug Administration Code of Federal Regulations

-

El costo de producción debe ser razonable, lo que implica que el microorganimo pueda crecer rápidamente, en sustrato grado industrial, consumiéndolos totalmente y con pocos requerimientos específicos. De nuevo para este aspecto, se prefiere a las enzimas constitutivas con respecto sea de algún ion que hiciese imposible la aplicación de la enzima en la industria alimentaria.

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La selección del microorganismo puede hacerse igual, ente en términos de las características deseadas para la enzima. Como ejemplo podemos citar la selección entre microorganismos termofílicos, con objeto de obtener enzimas termoestables (selección a altas temperaturas) o bien en una fuente de nitrógeno proteica que obligue a la inducción de ciertas proteasas (queratinasas).

-

Finalmente, cabe señalar que el impacto de la ingeniería genética en la producción de enzimas está relacionado en parte con la búsqueda de las características antes mencionadas. Los impactos actuales, de trascendencia industrial, tienen alguna de las siguientes características: 

Uso eficiente de nutrientes del medio de cultivo. En este sentido el aprovechamiento de la celulosa y la lignina, representa un área de gran impacto (por ejemplo, se han modificado levaduras de cervecería, para introducir genes que codifiquen para glucoamilasa. De esta forma, es posible producir cervezas ligeras al ser degradadas las dextrinas residuales).



Producción de enzimas microbianas “de origen vegetal o animal” (por ejemplo, el gene que codifica para una proteína idéntica a la quimosina de ternera ha sido clonado en E. coli y en S. cerevisiae). Gist Brocades cuenta ya con renina derivda de la fermentación de Kluyveromyces marxianus var. Lactis modificada genéticamente, Pfizer de E. coli y Genencor de A. oryzae.



Producción de enzimas termoestables. Por mutación dirigida, ha sido posible modificar un aminoácido de superficie, incrementando asi la termoestabilidad

(por ejemplo, isoleucina 3 por cisteína, incrementa la

termoestabilidad de la lisozima).



Sobreproducción de enzima mediante el incremento del número de genes que codifican para su síntesis.

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

Otras características: mayor tolerancia a pH extremos, modificación de la especificidad (proteasas), resistencia a la inhibición por iones (glucosa isomerasa inhibida por iones Ca++), modificación de la estructura para facilitar la inmovilización, etcétera.

3.2.1

Microorganismos productores de enzimas

3.2.1.1 Bacterias 3.2.1.1.1

Bacterias celulolíticas

Son las responsables de la degradación de celulosa en forma constante, colonizan la superficie de restos vegetales; en donde, forman una cubierta extracelular para su adhesión a las paredes celulares de los vegetales y su posterior crecimiento dependiendo de la cantidad de sustrato existente. Como resultado final de la degradación se produce acetato o propionato, algunos ejemplos de este tipo de bacterias son: Fibrobacter succinogenes, Gram-; Ruminococcus albus, Gram+; Ruminococcus flavefaciens, Gram+ (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.2

Bacterias xilanolíticas

Son bacterias menos estudiadas responsables de la biodegradación de xilanos en relación con la celulosa, algunos ejemplos de bacterias son: Butyrivibrio fibrisolvens, Gram+, produce ácidos butírico, fórmico, acético y láctico como producto final de la fermentación; Prevotella ruminicola, Gram- que produce ácidos succínico, acético y fórmico como productos finales (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.3

Bacterias amilolíticas

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Estas bacterias representan entre el 22 al 51% de bacterias viables, su principal sustrato es el almidón, sin embargo, pueden utilizar lactato; son responsables de la degradación de materiales amiláceos en ácidos grasos volátiles. Algunos ejemplos son: Bacteroides amylophilus, Gram-; Streptococcus bovis, Gram+; Selenomonas ruminantium, Gram- (Frioni, 2011). 3.2.1.1.1.4

Bacterias proteolíticas

Son organismos de rápida fermentación de aminoácidos y proteínas a amonio, además, de ser una importante fuente de ácidos grasas volátiles (AGV) y proporcionar amonio como fuente de nitrógeno; dichas bacterias se adhieren a la pared del rumen e hidroliza la urea. Algunas bacterias son: Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium sticklandii y Clostridium aminophilum (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.5

Bacterias hidrolíticas

Organismos que utilizan oligosacáridos y azúcares solubles para la degradación y posterior obtención de energía en forma de ATP, poseen un poder reductor y ferredoxina reducida que es reciclada con la liberación de hidrógeno molecular; ejemplos de estas se encuentran en: Clostridium, Bacteroide, Propionibacterium (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.6

Bacterias metanogénicas

Son Arqueas, organismos primitivos con un pseudopeptidoglicano en su pared que los permite ser resistentes a pH bajos y altas temperaturas; son anaerobios estrictos y son los únicos microorganismos capaces de producir metano gracias a sus distintas enzimas, sin embrago, son dependientes al sustrato que degradan. Pueden ser: Methanobacterium, Methanospirillum y Methanobrevibacter (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.7

Bacterias Acetogénicas

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Organismos especializados en la producción de acetato a través de la reacción de dióxido de carbono e hidrógeno, pueden ser: Acetobacterium, Acetogenium y Clostridium (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.8

Bacterias Sulfatoreductoras

Bacterias que emplean los distintos productos de las fermentaciones para reducir sulfatos en sulfuros, de dicha reacción obtienen energía; pueden ser oxidantes completos si degradan ácidos orgánicos de hasta 18 carbonos u oxidantes incompletos si no pueden seguir degradando (Frioni, 2011).

3.2.1.1.1.9

Bacterias Desnitrificantes

Bacterias que obtienen energía por la oxidación de compuestos orgánicos y del azufre, mediante nitratos; este proceso facilita la remoción del oxígeno, la clase más distribuida en la naturaleza son las Pseudomonas (Frioni, 2011).

3.2.1.2 Protozoos 3.2.1.2.1 Ciliados celulíticos Producen enzimas degradadoras de restos vegetales que fragmentan el material, pocos géneros de Epidinium (Frioni, 2011). 3.2.1.2.2 Ciliados amilolíticos Utilizan el almidón para la producción de energía, sin embargo, estos son responsables de entre el 30 al 40% del lipolisis o el incremento del contenido de ácidos grasos saturados, Son todos los Entodiniomorphes (Frioni, 2011).

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CAPÍTULO III

3.3 MECANISMOS DE BIOSÍNTESIS Para el control de la síntesis de enzimas, las células microbianas disponen de los mecanismos de inducción y represión. El conocimiento de las diversas formas de regulación, a partir de los trabajos de Jacob, ha permitido desarrollar sistemas de alta productividad, no solo a través de procesos de mutación, sino también mediante el manejo del medio ambiente y de la ingeniería genética. 3.3.1

Enzimas Inducibles

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La mayor parte de las enzimas comerciales son inducibles, es decir, requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como inductor. De acuerdo con el modelo de Jacob y Monod, el inductor permite la síntesis de la enzima al unirse con el represor que bloquea al gene operador impidiendo su transcripción. Cabe señalar que existen “inductores gratuitos”, sustancias análogas o de estructura similar al sustrato o al producto, que pueden fingir como inductores. Cuando el sustrato es de tal tamaño que no puede atravesar la pared celular (por ejemplo, celulosa), es entonces el dinero (celobiosa) el que puede actuar como inductor, aunque en estos casos, la concentración de inductor debe mantenerse baja, para evitar la represión catabólica. En la Tabla 2 se muestran algunos ejemplos de enzimas inducibles.

Tabla 2. Algunos ejemplos de enzimas inducibles

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Enzima Dextransacarosa Dextranasa

Microorganismo Leuconostoc mesenteoides Penicillium funiculosum

Inductor sacarosa dextrana dipalmitato de

α- amilasa

Bacillus subtilis

Naringinasa Pululansa Invertasa

Aspergillus niger Klebsiella pneumoniae Pullularia pullulans

isomaltosa almidón maltosa naringina maltosa monopalmitato

Glucosa

Bacillus coagulans

de sacarosa xilosa

isomerasa Pectinasa Tirosinasa

Aspergillus niger Neurospora crassa

pectina L-tirosina

Fuente. López, 2013

3.3.2

Mecanismos De Represión

El mecanismo más común de represión en la síntesis de enzimas, es el conocido como de represión catabólica. Se refiere a la inhibición en la síntesis de enzimas, generalmente inducibles, por intermediarios producidos en el rápido catabolismo de la fuente de carbono. En el ejemplo clásico lo constituye la represión de la lactasa en E. coli por glucosa. Se sabe que el AMP cíclico juega un papel clave en el mecanismo de represión, ya que su concentración intracelular se ve disminuida hasta 1000 veces cuando el microorganismo crece en glucosa y la represión puede ser revertida mediante su reposición al medio. En la Tabla 3, se muestran algunos ejemplos de enzimas sujetas a represión catabólica.

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Tabla 3. Ejemplos de algunas enzimas sujetas a represión catabólica Enzima

Microorganismo

Inductor

Invertasa

Neurospora crassa

glucosa-fructosa

Lactasa

Eschericchia coli

glucosa

Dextransacarasa

Leuconostoc mesenteroides

sacarosa

Celobiasa

Tricoderma viride

celobiosa

Glucosa isomerasa

Streptomyces phaechromogenes

glucosa

Proteasas

Bacillus subtilis

glucosa

Catalasa

Rhodotorula mucilaginosa

glucosa

α- amilasa

Bacillus stearothermophilus

fructosa

Fuente. Martínez, 2014

Un mecanismo menos frecuente de inhibición lo constituye la retrorrepresión, mecanismo mediante el cual la síntesis de enzima se ve reprimida por la presencia de productos finales de biosíntesis. Un ejemplo lo constituye el efecto de ciertos aminoácidos del medio de cultivo en la síntesis de proteínas. 3.3.3

Mejoramiento Genético

Una vez conocidos los mecanismos que regulan la producción de una enzima determinada, se podrá mejorar la productividad a través de procesos de mutación y selección o bien mediante un adecuado manejo del medio ambiente. En la Tabla se representan algunas de las características o estrategias en la obtención de mutantes. Las técnicas clásicas de mutación pueden consultarse en Demain.

Tabla 4. Estrategias en la sobreproducción de enzimas microbianas Enzima inducible

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 Obtención de mutantes con necesidades reducidas o nula de inductor (en los casos de inductores caros). Enzimas sujetas a retrorrepresión  Evitar la presencia de producción finales en el medio de cultivo.  Evitar la acumulación de productos finales mediante la adición de algún inhibidor de la ruta metábolica.  Limitar la disponibilidad de un factor de crecimiento a un mutante auxótrofo.  Eliminación de los productos finales (diálisis, ultrafiltración).  Obtención de mutantes no sujetos a represión por productos finales Enzimas sujetas a represión catabólica  Evitar el uso de la fuente de carbono que ocasiona la represión, sustituyéndola por otra de más lenta asimilación.  Limitar el crecimiento del microorganismo: cultivo en quimiostato o fermentación retroalimentada.  Obtención de mutantes resistentes a la represión catabólica. Fuente. Gutiérrez, 2012

CAPITULO IV PRODUCCIÓN DE ENZIMAS MICROBIANAS 3.4

Producción de enzimas microbianas

Los procesos de producción de enzimas microbianas se realizan mediante cultivos aeróbicos. En general las enzimas se producen en pequeñas cantidades durante la fase de crecimiento activo, pero se acumulan en grandes cantidades en la fase estacionaria del crecimiento. Las enzimas inducibles se producen sólo cuando en el medio se encuentra el inductor (sustrato). Las enzimas microbianas que se producen en mayor cantidad son proteasas, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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utilizadas como aditivos en los detergentes para lavar ropa. También los detergentes contienen amilasas, lipasas, reductasas y otras. Muchas de estas enzimas son producidas a partir de bacterias alcalófilas, especialmente de Bacillus licheniforme. Estas enzimas tienen pH óptimo entre 9 y 10, así permanecen activas al pH alcalino de las soluciones de los detergentes. Por ejemplo:  Amilasas, se producen mediante fermentación y se utilizan en la conversión de cereales en el producto final llamado jarabe de cereales rico en fructosa.  Alfa amilasa provoca ataque inicial al polímero, acortando la cadena y reduciendo la viscosidad del polímero, clarificante.  Glucoamilasa produce monómeros de glucosa, sacarificante.  Glucosa isomerasa realiza la conversión final de glucosa en fructosa, isomerización.  Invertasa se produce a partir del cultivo de Saccharomyces cerevisiae, se utiliza para impedir la cristalización de azúcares, pues convierte sacarosa en azúcares más solubles. También se inyecta en el interior de los caramelos.  Pectinasas, producidas por cepas de Aspergillus, se utiliza para licuar jugos de frutas.  Renina, producida por cepas de Mucor se utiliza para coagular la leche en la producción de quesos.  Proteasas, para ablandar carnes de Bacillus y Aspergillus.  Lactasa, de Kluyveromyces fragilis, para evitar la cristalización de helados. CAPITULO V 3.5 SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTÍNUO 3.5.1

Cultivos celulares

Las células constituyen sistemas de producción muy versátiles y altamente especializados. Sin embargo, para expresar plenamente sus potencialidades, su cultivo requiere de condiciones ambientales y nutricionales muy definidas, tomando en cuenta tanto los factores fisiológicos como los de ingeniería y operación. En esta área se estudia la interrelación entre las condiciones de cultivo y la respuesta fisiológica de la célula, a través del diseño de estrategias optimizadas de cultivo, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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basadas en la mejora del medio, elección de la modalidad de cultivo (cultivo por lote, cultivo por lote alimentado, cultivo continuo) y disposición de las células (libres o inmovilizadas), para la producción de enzimas, proteínas y metabolitos, tanto primarios como secundarios. Para ello se emplean principalmente células microbianas como bacterias, levaduras y hongos filamentosos, que pueden ser cepas nativas como de colección, mutantes y recombinantes. En los últimos años se han incorporado cultivos de células animales recombinantes para la producción de biofármacos, siendo la EIB pionera a nivel nacional en la investigación en este campo. Nuestra Escuela a partir de 1974 ha desarrollado diversos proyectos de investigación en aspectos relacionados con la fisiología y cinética de los microorganismos lixiviantes, la biolixiviación de minerales de baja ley, de relaves y de concentrados de flotación y el uso de biorreactores con agitación mecánica y neumática. En la actualidad se trabaja en la biooxidación de minerales y concentrados refractarios de oro en reactores. Esta tecnología, implementada a gran escala en Australia, Sudáfrica, Ghana y Brasil, permite una mejor recuperación del oro por el proceso de cianuración, cuando el metal se encuentra recubierto de una película de sulfuros insolubles. Se ha cuantificado el efecto de la adición de CO2, la velocidad de transferencia de oxígeno, el efecto de la concentración de mineral en la pulpa, la aireación y la agitación, tanto en la calidad de la suspensión como en la velocidad de biooxidación. También se estudia la operación continua y la configuración de reactores más adecuada.

3.5.2 Sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentados. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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3.5.2.1 Sistemas de cultivo Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor. Velocidad de acumulación=Velocidad de ingreso−Velocidad de salidad +¿ Velocidad de formación−Velocidad de consumo

d ( VCi ) =F 1. Ci 1−F 2.Ci+ Vr fi−Vr ci dt

(1)

Donde V es el es el volumen de cultivo, F1 es caudal de alimentación, F2 el de salida, Ci1 la concentración del componente "i" en la alimentación y Ci la concentración en el caudal de salida, la que, si el cultivo esta bien mezclado, se puede asumir idéntica a la que hay dentro del biorreactor. Los restantes términos, rfi y rci se refieren a la velocidad de formación y consumo del componente "i" respectivamente.

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Figura 2. Esquema de un biorreactor con indicación de los caudales y concentraciones a la entrada y a la salida. La flecha que rodea el eje del agitador significa que el cultivo está perfectamente mezclado. Fuente. K. Aunstrup, 1979

Por otra parte, el volumen de cultivo variará en el tiempo según sean F1 y F2. Suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales resulta:

dV =F 1−F 2 dt

(2)

Ahora bien, dependiendo de como sean F1 y F2 surgen, básicamente, tres sistemas de cultivo:

1. Cultivo continuo Ambos caudales son iguales y por la ec. (2) es V constante, por lo tanto, la ec. (1) se reduce a:

r fi V.

dc i - r ci ¿ =F ( Ci 1−Ci )+V ¿ dt

(3)

2. Batch alimentado

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El caudal de salida, F 2 , es nulo, por lo que V aumentará en el tiempo en función del caudal de entrada. dV =F dt

(4)

y en el balance de materia se anula el término F2 Ci resultando: VC r fi

- r ci ¿ d (¿¿ i) =F . Ci 1+V ¿ dt ¿

(5)

Debe destacarse que en este caso V permanece dentro del operador diferencial pues varia con el tiempo según la ec. (4). Por tal motivo el batch alimentado, y a diferencia del caso anterior, tiene duración limitada en el tiempo ya que el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que posee el biorreactor. 3. Batch Ambos caudales son nulos por lo que V es constante y en la ec. (1) se anulan los términos F1Ci1, F2 Ci . dCi dt

= r fi - r ci

(6)

La duración del cultivo batch es, por supuesto, también limitada en el tiempo y depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch. Analizaremos ahora con más detalle cada uno de los sistemas vistos aplicando en particular los balances de materia a la biomasa, X, al producto, P, y al sustrato limitante de crecimiento, S. Para los dos primeros sólo es necesario considerar la cinética de formación r X y rp respectivamente, con lo cual r ci = 0 en ambos casos. Para el sustrato se tiene el caso inverso y sólo deberá considerarse la velocidad de consumo, rs. Si por las características del proceso, la UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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lisis celular o la descomposición del producto son importantes, deberá incluirse en el balance un término adicional que contemple este aspecto. 3.5.2.2 Sistemas de cultivo por lote o continuo Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F y por un rebalse se mantiene el volumen constante. El caudal de salida contendrá células, medio de cultivo parcialmente agotado y, eventualmente, algún producto. Si alimentamos con medio fresco significa que X1 = 0 y P1 = 0, por lo que sólo deberemos considerar la concentración de sustrato limitante del crecimiento, S1 , en la alimentación. En base a estas consideraciones los balances de materia para X, S y P serán (ver ec. (3)):

En estado estacionario las concentraciones dentro del biorreactor permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero las ecuaciones (7), (8) y (9). De la primera, y teniendo en cuenta que rX = ux, resulta: F =D=μ V

(10)

donde D es la velocidad de dilución. Si se reemplaza u por la ec. (19) resulta que la concentración de S en estado estacionario es:

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donde S representa la concentración en estado estacionario. De la ec. (8) surge:

Por la ecuación (26) es:

además u = D, por lo tanto la concentración de biomasa en estado estacionario es:

Si en particular S es la fuente de carbono y energía, rs:

Cuando ms = 0, la ecuación (14) se reduce a la ecuación (13).

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Figura 3. Cultivo continuo. Concentración de biomasa y de sustrato limitante en estado estacionario a distintos valores de D. Parámetros: −1

l ; S 1=5 g

−1

l

−1

μm=1 h

;

Y ' x/ s=0.5 ; k s 0.05 g

.

La Fig. 3 muestra como varían la concentración de sustrato en estado estacionario en función de la velocidad de dilución. La curva superior corresponde a la ecuación (13) y la inferior a la ecuación (14), pudiéndose observar en este último caso que el efecto del mantenimiento celular se hace notable a bajas velocidades de dilución. En ambos casos puede apreciarse que existe un valor de D por encima del cual es X = 0, con lo cual por la ecuación (13) o (14) es S = S1. Si se reemplaza este valor en la ecuación (11) se obtiene la velocidad de dilución crítica Dc.

Si como ocurre normalmente S1 » Ks se tiene que

Dc

=

μm , lo cual es un criterio

muy útil en el momento de seleccionar un valor de D apropiado, ya que deberá cumplirse que D <

μm . En caso contrario ocurrirá el "lavado" del cultivo, debido a

que la velocidad de salida de las células del biorreactor será mayor que la de crecimiento. Debe tenerse en cuenta que la Fig.3 se representa en caso que pl está dado por la ecuación de Monod, pero si en medio del cultivo hay sustancias inhibidoras del crecimiento (o son formados por microorganismos) o el sustrato limitante es el inhibidor. 3.5.2.2.1 Formación de producto En estado estacionario, la ecuación (9) se reduce a:

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o bien

donde P representa la concentración de producto en estado estacionario. Dependiendo de cómo sea la cinética de formación del producto será la forma de la curva P vs. D. Alternativamente puede emplearse, y de hecho se emplea, el cultivo continuo para elucidar qué tipo de relación existe entre qp y u, ya que como se mencionó, es uno de los factores a tener en cuenta para planear la estrategia de producción, como se verá más adelante cuando se trate la producción de penicilina.

3.5.2.2.2 Determinación de los parámetros de crecimiento El cultivo continuo es sumamente útil para determinar parámetros de crecimiento tales como K s , μ m o Y ' x / s . Así reordenando la ecuación (11) se obtiene Graficando 1/D en función de 1/S, los puntos deberán ajustarse a una recta cuya intersección con el eje 1/D dará el valor de 1/ μm

y la pendiente

K s / μm ; si es que

el cultivo puede ser representado por una cinética como la de Monod. Por otra parte, redondeando la ecuación (14) resulta:

de donde la gráfica de D (S 1 -S) /X en función de D permitirá estimar 1/Y' x/s y ms . Obviamente en este caso el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía.

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3.6

Crecimiento de bacterias

La mayoría de las bacterias se reproducen por medio de una fisión binaria

Figura . Duplicación de células

El tiempo que tardan en formarse 2 células de una célula común se llama tiempo de generación, pero como coincide con el tiempo en que se duplica el número de células se UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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denomina también tiempo de duplicación. Este tiempo varía significativamente según la especie bacteriana y según las condiciones del medio de cultivo. En la Tabla 8.3 se presentan tiempos de duplicación para distintas especies en medios complejos a las temperaturas óptimas de crecimiento. Tabla 5. Tiempos de duplicación

Fuente. Anbu, 2015

CAPITULO VI CINÉTICA DE CULTIVO 6.1 Cinética de cultivo El conocimiento de la cinética de un cultivo permite la predicción del transcurso de la fermentación, la evaluación de las velocidades, rendimientos y productividades y entrega información útil para establecer estrategias de producción y optimización del proceso.

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Figura 4. Curva de crecimiento en cultivo por Lotes Fase de Latencia (a): Se produce inmediatamente después de inoculado el cultivo. Durante ella no hay iniciación de replicación de ADN ni separación de nuevas células. Se reproduce el reacomodo de la composición macromolecular al nuevo ambiente en que se encuentran las células inoculadas.

Figura 5. Fase de latencia

Fase de Crecimiento exponencial o Logarítmico (b): UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Las células se encuentran en plena reproducción a una velocidad que es máxima para el juego de condiciones existentes, por no existir limitación de nutrientes.

Figura 6. Fase de crecimiento exponencial Fase Estacionaria (c): Se alcanza cuando se agota un nutriente, razón por la cual se detiene el crecimiento. En esta fase también puede presentarse una leve pendiente positiva, si el nutriente agotado es la fuente de nitrógeno. Por el catabolismo de carbohidratos y compuestos de reserva.

Figura 7. Fase estacionaria Fase de muerte o decaimiento (d): Esta fase se presenta en aquellos cultivos en los que se inducen enzimas autolíticas en condiciones de inanición.

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Figura 8. Fase de muerte Fase de crecimiento críptico (e): En algunos de los cultivos es posible apreciar una zona de crecimiento lento después de la fase de muerte. El contenido citoplasmático liberado por las células lisadas proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento.

Figura 9. Fase de crecimiento críptico

6.2

Crecimiento microbiano

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"El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo. a.

Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.

b.

División estocástica de la población, o división al azar.

La división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula, duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva los organismos cenóticos). De ésta manera una célula da nacimiento a dos células hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades. En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es ka gemación o botón. Se forma una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño, luego se produce la división en el núcleo y migra hacia el botón. Finalmente crece hasta un tamaño suficiente y posteriormente se separa formando otra célula idéntica a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimientode división celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticas." Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.

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CAPITULO VII CINÉTICA DE FORMACIÓN DE PRODUCTOS MICROBIANOS. CÁLCULO DE RENDIMIENTO Y PODUCTIVIDAD 7.1 Cinética de formación de productos microbianos La diversidad de productos formados por los distintos tipos de microorganismos es sumamente amplia, desde moléculas muy simples como el etanol hasta las muy complejas como pueden serlo una enzima o un antígeno. Formalmente se puede entonces clasificar los productos como: 1. Productos de bajo peso molecular. Estos incluyen a alcoholes, ácidos carboxílicos, aminoácidos, nucleótidos, antibióticos, etc. 2. Productos de alto peso molecular. Los que a su vez pueden dividirse en: 2.1 Componentes estructurales: Polisacáridos, proteínas, antígenos, etc. 2.2 Enzimas: Pudiendo ser éstas intra o extracelulares. La industria química "compite con los microorganismos" tan sólo en la obtención de algunos productos de bajo peso molecular como por ejemplo el etanol o el butanol, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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siendo los demás de dominio exclusivo de los microorganismos y, por otra parte, la única fuente disponible para el hombre. Cualquiera sea el producto que se desee obtener, son varios los aspectos que deben considerarse. Estos según Pirt, pueden resumirse como: I.

Selección de una cepa microbiana apropiada.

II.

Determinación de los valores óptimos de temperatura, pH, presión osmótica. En procesos aerobios, además, es de fundamental importancia conocer el requerimiento de oxígeno a fin de poder satisfacerlo.

III.

Determinación y optimización de los requerimientos nutricionales y de la concentración de biomasa.

IV.

Modificación del genoma tendiente a incrementar la formación del producto deseado.

En el capítulo anterior se vio que la formación de biomasa y de producto son procesos contrapuestos, lo cual, si bien es cierto, podría conducir al error de suponer que el único objetivo en la formación de un producto es maximizar Y p/s. Por otra parte el producto es una consecuencia de la actividad de los microorganismos; luego la presencia de éstos también es importante. Este concepto puede resumirse del siguiente modo: si qp es la velocidad específica de formación de producto podemos poner: (1) al cabo de un tiempo, t, y suponiendo que inicialmente P = 0 será: (2) La ec. (2) indica que tanto la concentración celular como la capacidad biosintética de la misma (qp) son importantes en la obtención de un producto. El concepto que resume ambos aspectos él es de productividad, esto es la cantidad de producto obtenido dividido el tiempo necesario para obtenerlo, la que puede ser mejorada entonces aumentando X, qp o ambos. Puede ocurrir que un aumento de X cause disminución de q p, siendo UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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necesario en tal caso encontrar una solución de compromiso; es decir una combinación que haga máxima la productividad. La clasificación dada al comienzo de este capítulo, no pasa de ser una mera enunciación de todos los productos que se pueden obtener de los microorganismos. Es más útil, al menos para los productos de bajo peso molecular, clasificar los según que función cumplan dentro del metabolismo. Se pueden distinguir así tres grupos: I. II. III.

Productos finales del metabolismo energético. Productos intermedios de metabolismo primario. Productos de metabolismo secundario

I.

Productos finales del metabolismo energético.

Son ejemplos de este grupo el etanol, ácido láctico, acético, butírico, butanol, y otros compuestos asociados a procesos anaerobios. Su formación es consecuencia directa de la degradación de la fuente de carbono para obtener energía. Hemos visto en el capítulo anterior que la energía se emplea tanto para crecimiento como para mantenimiento celular, por lo que en este tipo de productos la velocidad de formación tendrá dos contribuciones: (3) o bien: (4) El primer término del segundo miembro expresa la velocidad de formación de producto debida al crecimiento, y el segundo la debida al mantenimiento. La estrategia para la obtención de estos productos consiste en contar con una concentración celular elevada sometida a condiciones tales que el mantenimiento sea grande, lo cual puede lograrse, como hemos visto, aumentando la tonicidad del medio y también modificando la temperatura. Existe otra alternativa que consiste en limitar el cultivo en nitrógeno de modo tal que las células se vean impedidas de duplicarse al no poder sintetizar más componentes estructurales, y la fuente de carbono se derive, principalmente vía UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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mantenimiento, hacia la formación de producto. Por ejemplo, la obtención del etanol por levadura puede dividirse en dos etapas: en la primera el proceso es aerobio y el medio de cultivo contiene una relación de fuente de carbono a fuente de nitrógeno apropiada para obtener un buen crecimiento. La segunda etapa se realiza en condiciones anaerobias y en un medio con escasa concentración de fuente de nitrógeno y elevada concentración de fuente de carbono, la cual es convertida prácticamente en un 90% en etanol y C02. En este caso la tolerancia de la levadura al etanol es un aspecto importante a considerar. II.

Productos intermedios de metabolismo primario

Pertenecen a este grupo los aminoácidos, los nucleótidos, las vitaminas, los ácidos orgánicos, y pueden incluirse también biopolímeros como enzimas. Los procesos de obtención son aerobios y la formación de estos productos ocurre principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso, lo que se pretende es lograr una regulación anormal del metabolismo tal que la fuente de carbono y energía se derive hacia la formación del producto deseado. Por ejemplo, para la obtención de lisina se emplean cepas de Corynebacteriuin glutamicum que carecen de la enzima Homoserina deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y treonina (ver fig. 10). Además, la enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida por lisina. Esta conjuntamente con la treonina ejercen inhibición concentrada sobe la Aspartatoquinasa de modo tal que aún en este mutante no se acumulará lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre. La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima, lo cual se consigue alimentando el cultivo con este aminoácido y tratando de mantener su concentración en valores muy pequeños. Así se evita la inhibición concertada, con lo cual la lisina, al no ejercer retroinhibición sobre la dihidroxipicolinato sintetasa, se acumula en el medio de cultivo. El ejemplo visto es demostrativo de la importancia que tiene el conocimiento del metabolismo y su regulación en el momento de seleccionar los mutantes apropiados, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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como así también la elección de una técnica de cultivo adecuada en el momento de la producción. En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo, no existe una relación directa entre la generación de energía y la síntesis de los productos de este grupo. Volviendo al ejemplo de la lisina, por cada mol formado se forman cuatro de NADH y se consume uno de ATP, por lo que la formación de lisina está asociada en una formación neta de ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado. La cinética de formación de estos productos es más compleja que los del grupo 1, y no existe hasta el momento ninguna expresión simple que abarque a todos, si bien Roels y Kossen han propuesto la siguiente ecuación para ser ensayada con este tipo de productos. (5)

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Figura

10.

Regulación de la síntesis de lisina en Corynebacteriuin glutamicum

La misma posee gran flexibilidad ya que E puede tomar cualquier valor mayor que cero, lo que permite ajustar distintas relaciones entre q p y u. Por ejemplo si E = 1, la relación entre qp y p es directa; si E = 100 se tiene que q p alcanza va lores cercanos al máximo aún a valores pequeños de u/um . En general, y cualquiera sea el producto, se trata siempre de encontrar que tipo de relación existe entre qp y u, ya que éste es uno de los factores a tener en cuenta en el momento de planear la estrategia dé producción. III. Determinación y optimización de los requerimientos nutricionales y de la concentración de biomasa Pertenecen a este grupo los antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas. Históricamente se ha considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de los metabolitos primarios, aunque tal afirmación se encuentre actualmente en revisión. Cualquiera sea el caso, existen algunas características que diferencian a este grupo del anterior. Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Así muchos antibióticos contienen en su molécula aminoácidos infrecuentes como D-aminoáci dos, N-metil aminoácidos, B-aminoácidos o iminoácidos; o azucares modificados, bajo la forma de dimetil aminoazúcares. Por otra parte estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis. Por ejemplo la adición al medio de cultivo de ácido fenil acético estimula la producción de Bencil penicilina, los ácidos a-aminobutírico y a,ydiaminobutírico son limitantes de la biosíntesis de colistina. En estos casos la supresión de los mecanismos de regulación de la síntesis de los precursores puede resultar en un incremento en la producción. Otra característica interesante es que alguna enzima del metabolismo secundario no posee alta especificidad por el sustrato. Un ejemplo bien conocido es el de la penicilina aciltransferasa del Penicillican chrysogenum, que cataliza el intercambio del resto aaminoadipil de la penicilina N (amino adipil penicilina), por restos acídicos hidrofóbicos (ver Fig. 11). La enzima es específica para uno de los sustratos, el ácido 6amino-penicilánico, mientras que es relativamente inespecífica para el precursor de la cadena lateral, el cual debe poseer el grupo -CH2 - COOH terminal para ser incorporado. Finalmente, y ya en relación a la producción, la mayoría de los productos de este grupo comparten la propiedad de formarse cuando los microorganismos crecen a bajos valores de u. Se cree que una de las causas sería el fenómeno conocido como represión catabólica ya comentado, por el cual estaría reprimida la biosíntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el crecimiento ocurre a valores de u altos, mientras que se desreprimiría a valores de u bajos. Durante años, se utilizó lactosa como fuente carbonada para la obtención de penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo, y la glucosa rápidamente. En la actualidad se emplea esta última como fuente carbonada, pero suministrándola lentamente al cultivo a fin de regular u a valores compatibles con la síntesis de penicilina. El cultivo continuo y el bath alimentado, ya mencionados en el capítulo 2 y que se estudiarán en el capítulo 7, son sistemas de UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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cultivo que permiten regular la velocidad de crecimiento, y por tanto muy apropiados para obtener este tipo de productos.

Figura 11. Distintas penicilinas que pueden obtenerse en función del precursor de la cadena lateral. Fuente. García, 2002

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Los productos de este grupo comparten con el anterior la necesidad de un adecuado suministro de oxígeno para su formación. Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen.

7.2 Cálculo de Rendimiento y Productividad 7.2.1

Estequiometría del crecimiento microbiano

La aplicación de la estequiometría requiere conocer los rendimientos. Estos se definen como la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía). Por ejemplo, el rendimiento celular se define como: (1) X y S representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente. En la práctica, para el cálculo del Yx/s se emplea la expresión:

(2) En el capítulo anterior se vio que para obtener 30 gl -1 de levadura para panificación, se consumían 60 gl-1 de fuente carbonada, luego el rendimiento será:

Si además de microorganismos se forma algún producto en particular, el rendimiento en producto estará dado por: (3)

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Antes de avanzar en el tema, convendrá hacer algunas consideraciones sobre la composición elemental de los microorganismos con respecto a los elementos mayoritarios (C, N, H, O) ya que la misma será el punto de partida para realizar los cálculos estequiométricos. Se ha encontrado que la composición elemental de un microorganismo dado durante un cultivo no se modifica mayormente y, lo que es más, las composiciones elementales de distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. De este modo se puede definir un "microorganismo promedio" como aquél cuya composición es (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85, siendo el contenido de sales aproximadamente 5%. Es importante recalcar que si bien la composición elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, no ocurre lo mismo con la composición macromolecular, esto es: proteínas, ácidos nucleicos, cte., la cual puede variar sensiblemente. Teniendo en cuenta la composición media anterior, es posible escribir la "fórmula mínima" de un microorganismo promedio como: CH 1.79 O0.5 N0.2 (en la que está representado el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prácticos definir "un Cmol de biomasa" como la cantidad de biomasa que contiene un átomo gramo de Carbono. Luego:

Por tanto una concentración de X en gl-1 de biomasa es equivalente a X / 25.8 C-mol de biomasa l-1 , o bien Xox / 12 C-mol de biomasa l-1 . Donde ox es la fracción de Carbono de la biomasa (0.465 para el "microorganismo promedio"). Esta última forma de calcular los C-moles de biomasa es ventajosa ya que sólo requiere conocer ox; un dato que se puede obtener fácilmente de la bibliografía. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer ox = 0.465 sin temor a cometer errores groseros. De forma análoga a la anterior se definen 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, y también 1 C-mol de producto. Por ejemplo, para la glucosa (C 6H12O6) 1 C-mol de glucosa estará representado por CH20 y pesará 30 g, mientras que 1 C-mol de etanol UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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(C2H60) estará representado por CH 300.5 y pesará 23 g. En general para un compuesto de la forma CnH 1OqNm , ,1 C-mol estará representado por C H1/n Oq/n Nm/n. En base a lo anterior, el crecimiento puede representarse mediante la siguiente "reacción química", en la que supondremos que el NH3 (o alguna sal de amonio) es la fuente de nitrógeno:

Debe notarse que en esta ecuación todos los coeficientes estequiométricos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía (fuente C y E). El valor de Yx/s representa los C-moles de biomasa formada por cada C-mol de fuente de C y E consumida., el de b los moles de 02 consumido por cada C-mol de fuente de C y E consumida, etc. Ya se ha visto que Yx/s e Yp/s son los rendimientos en biomasa y en producto respectivamente. Son parámetros de importancia fundamental dentro de la microbiología industrial, pues dan una medida de la eficiencia del proceso de producción. De este modo en un proceso destinado a la producción de biomasa, el objetivo será maximizar Yx/s y minimizar Yp/s. Si lo que interesa es el producto, se tendrá el caso inverso. Los valores de Yx/s e Yp/s se calculan a partir de Yx/s e Yp/s mediante las expresiones:

Antes de efectuar los balances de materia y energía, introduciremos un nuevo concepto que nos permitirá simplificar los cálculos: el “grado de reducción” al que denotaremos con la letra y. Un par de ejemplos servirán para aclarar el significado de y. En la tabla 5 pueden observarse los valores de y para la oxidación de 1 C-mol de distintos compuestos orgánicos a C02 y H2O, como así también el calor de reacción. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Tabla 6. Entalpía de combustión referida a 1 C-mol en condiciones estándar y a pH=7

Fuente. Adaptado de J.A. Roels De la tabla 6 surge que: 1) El valor de y corresponde al número de electrones que fueron transferidos desde el compuesto a oxidar, al 02, tomando como base 1 Cmol. Por tanto, expresa el número de "electrones disponibles" por cada C-mol. 2) La cantidad de calor liberado por cada mol de electrones transferidos al oxígeno (q/y), se mantiene prácticamente constante. Del análisis de un gran número de compuestos resulta un valor promedio de q o = 27.5 k cal (mol electrones transferidos al O2) -1.

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De la conjunción de ambos puntos resulta que el valor de y es una medida de la energía contenida en un compuesto. Así, por ejemplo, 1 C-mol de etanol brinda más energía que 1 C-mol de glucosa. En general para calcular el grado de reducción de un compuesto se plantea la ecuación de oxidación del mismo a C02 y H2O, y el valor de y se obtiene multipli45 cando por 4 el coeficiente estequiométrico del 02 (ver tabla 5). Si el compuesto contiene nitrógeno, deberá especificarse cuál será el estado de oxidación final de éste. Por ejemplo, supongamos un compuesto dado por C H a Ob Nc, y deseamos calcular el valor de y con respecto al nivel de referencia dado por C02 , H2O y NH3 . La ecuación de oxidación será:

El valor de y será igual a 4 n. Mediante balances elementales de C, H, O y N se llega a que:

Por tanto y vendrá dado por: (7) Con todos estos elementos estamos en condiciones de aplicar balances de materia y energía a la "reacción química" que representa al cultivo. Para simplificar el tratamiento supondremos que la fuente de C y E no contiene nitrógeno (es lo usual) y que la fuente de nitrógeno es una sal de amonio, por lo que y estará dado por la ecuación (7). L Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta: (8) UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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II. Balance de grado de reducción: Los electrones disponibles a la izquierda y a la derecha de la reacción deberán ser iguales, luego: (9) Debe recordarse que, para el NH3, H2O y C02 es y = 0. Además, el grado de reducción del 02 es -4. Reordenando la ecuación (9) queda: (10) o bien: (

11)

Donde (12)

(13)

(14)

Η, ξ y ε representan la fracción de energía (de la fuente de carbono y energía) transferida a la biomasa, al producto y al oxígeno respectivamente. Puesto que por cada mol de electrones transferidos al 02 se liberan qo = 27.5 k cal, el calor producido estará dado por: UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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(15) De acuerdo con esto, e representa la fracción de energía disipada como calor. Mediante las ecuaciones (8) y (10) es posible analizar los resultados experimentales y verificar si las determinaciones han sido correctas. Medidas realizadas en el laboratorio deberán encontrarse dentro de los siguientes intervalos: (16) (17) Cuando se tiene certeza en las determinaciones, es posible aplicar las ecuaciones para calcular algún rendimiento que no ha sido medido, por ejemplo y p/s en base a los demás.

7.2.2 Cinética de crecimiento La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos, y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos. Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que la concentración de microorganismos, X, influye en la velocidad con que aumenta la población, rx; Así: (18)

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En esta ecuación, p es la velocidad específica de crecimiento, la cual para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la composición y concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores, temperatura y pH. Existen diversas expresiones para p: la más difundida es la ecuación de Monod, que relaciona el valor de u con la concentración de un componente del medio de cultivo que está en defecto respecto de los requerimientos del microorganismo: el sustrato limitante. (19) donde S es la concentración de sustrato limitante, u m es la velocidad de crecimiento específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de K s está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando S» Ks, u toma el valor de um y rx sólo depende de X. La presencia de inhibidores del crecimiento en el medio de cultivo causa disminución en el valor de p. La substancia inhibidora puede ser algún componente del medio de cultivo o algún producto formado por los microorganismos. El tipo de inhibición, al igual que en cinética enzimática, puede ser competitiva o no competitiva. Para el primer caso:

(20) mientras que para el segundo (21) Donde (22)

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siendo I la concentración de inhibidor. El valor de K I está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el inhibidor. En la inhibición competitiva, se modifica en valor de Ks. Puesto que a > 1 si existe inhibidor (ecuación (22)), resulta que la afinidad del microorganismo por el sustrato se ve disminuida. En la inhibición no competitiva, es el valor de

μm el que resulta afectado.

En ocasiones algún componente del medio de cultivo puede ser inhibidor del crecimiento, sobre todo cuando se encuentra en concentraciones relativamente elevadas. Esto es factible que ocurra con la fuente de carbono y energía por ser el componente que se encuentra en mayor proporción en los medios. Suele emplearse la siguiente expresión para considerar éste efecto: (23) El hecho de que una concentración de sustrato elevada pueda inhibir el crecimiento, impone una restricción a la concentración de los medios de cultivo que se pueden emplear en la práctica, y con esto a la concentración final de biomasa que se puede obtener. 7.2.3

Consumo de sustrato

Si reordenamos la ecuación (1) y derivamos respecto del tiempo se obtiene: (24)

o bien: (25) Introduciendo la ecuación (18) en la (25): (26)

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También

puede

expresarse

la

velocidad

de

consumo

de

sustrato como: (27) donde qs es la velocidad específica de consumo de sustrato. Comparando las ecuaciones (26) y (27) surge que: (28)

Si u=um se tendrá qs=qsm es decir que ambos parámetros están directamente relacionados. Por lo expuesto hasta aquí es evidente que el crecimiento puede ser caracterizado mediante tres parámetros: KS, um e Yx/s. Estos dependen tanto del microorganismo como del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluación debe realizarse para cada caso en particular.

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CAPÍTULO VIII TRASNFERENCIA DE OXIGENO EN FERMENTACIONES. MÉTODOS EXPERIMENTALES PARA EVALUAR “KLa”

8.1 Biorreactores El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo: a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación. b) Mantener constante y homogénea la temperatura. c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes. d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado. Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté provisto de un sistema de agitación, además para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo. Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y al "air lift". En el primero de ellos (Figura 12) la agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor.

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Figura 12. Tanque agitado. El mezclado se realiza mecánicamente

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el 02 hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor generado (capítulo 5), por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilización. El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de mircroorganismos y esporos. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 13) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación. Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo, el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado.

Figura 13. Esquema de un bioreactor del tipo “air lift”. El mezclado se realiza mediante inyección de aire.

8.2

Actvidad enzimática

Cuando el producto de fermentación es una enzima, es evidente que la producción no se cuantifica en términos de la cantidad de la proteína producidas, sino de la actividad catalítica disponible. Dicha capacidad catalítica debe ser cuantificada de tal forma que sea producible y fácilmente comparable con otros sistemas de producción y está obviamente ligada con las características cinéticas de las enzimas. La actividad

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enzimática permitirá más tarde establecer costos, dosis de aplicación y grados de pureza (actividad específica). Con el fin de establecer criterios universales a este respecto, la Comisión Internacional de Enzimas sugirió una definición estándar de “unidad de actividad” por minuto bajo condiciones definidad. La cinética de un gran número de enzimas puede ser descrita por el modelo de Michaelis Menten: vi=Vmáx

S Km+ S

(1)

Derivado del mecanismo siguiente:

E+ S<

k1 k3 > ES > E+ P ❑ k2

El modelo de Michaelis Menten sólo describe lo que sucede durante los primeros minutos de la reacción, es decir cuando el sistema enzimático se encuentra en “velocidad inicial”. Durante este período se puede asumir que la concentración de sustrato es constante; es decir, que su variación no afecta la velocidad inicial de reacción. También se asume que, si existe algún tipo de inhibición por el o los productos de reacción, su concentración aún es demasiado pequeña como para ser toma en cuenta. Finalmente se supone que el sistema se encuentra muy alejado del equilibrio, aun en el caso en el que éste no estuviese desplazado hacia los productos. Las “condiciones definidas” en la definición de la “unidad de actividad”, se refieren a la temperatura y al Ph a los cuales se tiene la máxima actividad. De igual o mayor importancia resulta también la definición de la concentración de sustrato a la cual se UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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efectúa la medición. El modelo de Michaelis-Menten describe una cinética de primer orden a bajas concentraciones de sustrato: Si

S ≪ Km , S + Km ≃ Km , vi=

Vmáx S , vi=k ' S Km

(2)

Con frecuencia se hace referencia a K’ como la constante de primer orden de las enzimas. Pero igualmente la reacción se vuelve de orden cero a altas concentraciones de sustrato, por lo que la velocidad inicial no depende más de la concentración de sustrato: Si

S ≫ Km , S + Km ≃S , vi=Vmáx

S , vi=Vmáx S

(3)

Es justamente a estas concentraciones de sustrato que, de efectuarse la medición de actividad, de tal forma que la velocidad inicial que se mida sea la velocidad máxima. Cierto conocimiento sobre la cinética de la enzima es entonces necesario antes de definir las condiciones de medición de las unidades de actividad, pues por otro lado, concentraciones elevadas pueden resultar en velocidades iniciales menores que la máxima en el caso de que exista inhibición por exceso de sustrato. El efecto de la concentración de enzima puede visualizarse claramente al considerar que: Vmáx=k 3 Et Donde Et es la concentración total de enzima, por ejemplo, en gramos por litro de medio de reacción y k3 la actividad específica de la enzima (en unidades de actividad por gramo de enzima, por ejemplo).

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Tabla 6. Algunos ejemplos de definición de actividad enzimática basada en una consecuencia de la acción de la enzima.

Enzima Proteasas

-

α-amilasas

Pectinasas

Celulasas

-

Metodología Capacidad para coagular la leche. Liberación de algún aminoácido específico soluble en ácido tricloroácetico (tirosina) Acción sobre películas fotográficas (cualitativa). Pérdida de la capacidad de formación de complejos coloridos entre iodo y amilosa. Diminución de la viscosidad inicial. Incremento del poder reductor.

-

Capacidad de clarificar jugo de manzana. Disminución de la viscosidad inicial. Incremento del poder reductor. Disminución del precipitado alcohólico del medio de reacción

-

Disminución de la viscosidad inicial. Incremento en el poder reductor. Solubilización de papel

Fuente. Karigar, 2011

8.3 Transferencia de Oxígeno (O2) La velocidad de transferencia de 02, R02, desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación: (1) Donde:  KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno,  C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y  C* la concentración de 02 disuelto que. estaría en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa.

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El KLa depende del diseño del biorreactor, de las condiciones de operación (caudal de aire, agitación) y de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor KLa. El KLa es una medida de la capacidad que posee un biorreactor para suministrar O 2 y el rango de valores usuales está comprendido entre 50 h-1 y 1000 h. Por tanto, valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurarán, para el ejemplo visto, que el cultivo no está limitado por 02. Cuando la velocidad de consumo del oxígeno varía con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo "batch", el cálculo de KLa necesario se realiza empleando el máximo valor de rO 2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de 0 2 durante todo el cultivo. Con este capítulo finaliza el tratamiento de los aspectos fundamentales de los procesos de fermentación. Resta tratar las aplicaciones de la Microbiología Industrial y las posibilidades que pueden presentarse en el futuro. Como ejemplo de esas aplicaciones se incluyen en esta monografía los procesos correspondientes a la producción de levadura de panificación, penicilina y otro correspondiente al tratamiento de efluentes. La producción de levadura es un proceso clásico de las primeras etapas del desarrollo de la Microbiología Industrial, mientras que el de penicilina representa un cambio fundamental en la evolución de nuestra disciplina, a partir de 1945. En ambos procesos se demuestra la integración de varios de los aspectos básicos tratados con anterioridad. Finalmente, la elección del tema de tratamiento de efluentes industriales responde a la trascendencia cada vez más importante que tiene el problema de la contaminación ambiental y a las soluciones que ofrece la Microbiología Industrial para encararlo. 8.4 MÉTODOS EXPERIMENTALES PARA EVALUAR “KLa” Un biorreactor es un reactor que sostiene y soporta la vida de células y cultivos de tejidos. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaerobio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Leyes de velocidad UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Hay muchas leyes para la velocidad de crecimiento celular de nuevas células; por ejemplo: Células + sustrato ---------------------> más células + producto Sin embargo, la expresión más empleada es la ecuación de Monod para crecimiento exponencial:

(1)

� � = � 𝑪�

Dónde:  𝑟�: es la velocidad de crecimiento celular en g/dm3s  �: es la velocidad de crecimiento específico en s-1  ��: es la concentración celular en g/dm3

La velocidad de crecimiento específico de la célula se puede expresar como: μ=μ max

Cs K s+C s

(2)

Que es la ecuación de Monod para el crecimiento celular y que por rige un crecimiento del mismo en un reactor biológico y que a su vez dicha ecuación se compone de los siguientes elementos: μmax que es la velocidad de crecimiento máxima específica en s-1 a) b) K s es la constante de Monod en g/dm3 c) �� concentración del sustrato en g/dm3 Dicha ecuación es usada como parámetro de diseño en los biorreactores ya que es la ecuación que más

tiene

similitud con

el comportamiento

poblacional de

microorganismos y que depende también de la cantidad de sustrato contenido en el biorreactor. Por ende, en el diseño de un biorreactor es necesario saber la cinética de crecimiento microbiano para mantener en buen estado la operación del ya antes

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mencionado y tener la conversión de productos manteniendo la biomasa en excelentes condiciones y esto repercute en la eficiencia del biorreactor.

8.4.1

Transferencia de oxígeno en un biorreactor

En un reactor biológico las células toman al oxigeno que se encuentra disuelto en el medio acuoso, por lo tanto, la transferencia de masa (oxígeno) de la fase gaseosa al líquido es de vital importancia. El modelo que representa la transferencia de masa del gas al líquido es:

(3)

� � = � 𝐿� (�� 𝐿 ∗ − � �𝐿)

Los factores que afectan a la demanda de oxígeno en un fermentador son los siguientes: a) La especie celular b) Las propiedades del medio de cultivo c) La naturaleza de la fuente de carbono en el medio d) La fase de crecimiento celular La demanda de oxigeno es función del tiempo o por lote debido a que considera la fase logarítmica de crecimiento celular.

8.4.2

Velocidad especifica de consumo de oxígeno

Es la velocidad con la que una célula consume oxigeno(�0). Esta variable depende principalmente de la naturaleza bioquímica de la célula y del medio de cultivo. Si �0 es la velocidad de consumo de oxígeno por volumen de caldo, se tiene una ecuación matemática que es: � � = �� 𝒙

Donde �: es la concentración celular

(4)

Cuando la concentración de oxígeno en el medio caé por debajo de cierto valor, la velocidad de consumo empieza a depender de la concentración de oxígeno.

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Figura 14. concentración de oxígeno 8.4.3

Mecanismo de transferencia de oxígeno al medio

Se enlistan 8 pasos que obedecen a la transferencia de masa por difusión y por convección (1° y 2° ley de Fick), se enlistan a continuación: 1. 2. 3. 4. 5.

Transferencia del interior de la burbuja(gas) a la interfase gas-liquido Transporte a través de la interfase gas-liquido Difusión a través de la película estancada que rodea a la superficie del liquido Difusión a través del seno del líquido Difusión a través de la película de líquido estancado que rodea a la superficie

celular. 6. Transporte a través de la interfase liquido-célula 7. Si las células están soportadas ocurre el transporte a través del solido hasta la célula. 8. Transporte a través del citoplasma al sitio de reacción Las mayores resistencias a la transferencia de masa se encuentran en:  La resistencia a la transferencia de masa en una burbuja es despreciable al igual que en la interfase gas-liquido.  La transferencia en la capa del líquido que rodea a la burbuja es un paso limitante debido al espesor de dicha capa.  En fermentadores bien mezclados el transporte de oxígeno a través del líquido es relativamente rápida.  Debido al tamaño de la célula, la capa del líquido que la rodea tiene un espesor muy pequeño por lo que la resistencia a la transferencia de masa a través de este es relativamente baja.  Si la célula esta soportada, entonces la capa que rodea al soporte ofrece una

resistencia.  La transferencia de O2 hacia la membrana es en cuanto a su resistencia despreciable UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Para el caso de fermentadores sumergidos en estado estacionario no hay acumulación de oxígeno en ninguna parte de fermentador, por lo tanto, la transferencia de oxígeno de las burbujas debe ser igual a la cantidad de oxígeno consumido por las células. De forma matemática el enunciado se ve de la siguiente manera: �

𝑳�

(𝑪 �𝑳 ∗ − 𝑪 �𝑳) = � � 𝒙

(5)

Donde:  � 𝐿�: es el coeficiente global de transferencia de masa en cuanto al oxígeno  ��𝐿 ∗: es la concentración de oxígeno en la interfase

La concentración celular que se puede soportar con ciertas condiciones de transferencia dadas es: 𝒙 𝒎𝒂𝒙 = �𝑳� 𝑪 �𝑳 ∗ ��

C∗¿ AL❑ K LA q0 ¿

(6)

Para el cálculo del coeficiente de transferencia de masa crítica está dada por: (C∗¿ AL −C AL ) (� 𝑳�) ��𝒊� = q0 x ¿

(7)

8.4.5 Medición experimental de � 𝑳� A. Método del balance de oxígeno: se mide el contenido de oxígeno a la entrada y salida del fermentador, con lo que se puede obtener la cantidad de oxígeno transferido por balance de materia de oxígeno. Se modela de la siguiente manera: (8)

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Dónde:  � 𝐿: Volumen del líquido  � �: Flujo del gas ���: Concentración del gas B. Método dinámico: En este método solo es necesario medir la concentración de oxígeno en el fermentador a lo largo de un tiempo determinado. De la ecuación diferencial:

(9)

Para el estado estacionario:

(10)

Sustituyendo �0 � en la ecuación diferencial queda como:

(11)

Integrando para un tiempo determinado queda la fórmula para calcular el coeficiente global de transferencia de oxígeno (masa) en un fermentador: (12) UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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CAPÍTULO IX TRANSFERENCIA DE CALOR Y EQUIPOS INTERCAMBIADORES DE CALOR EN FERMENTACIONES

9.1.

GENERALIDADES

La Transferencia de calor es la energía en tránsito debido a una diferencia de temperaturas en un cuerpo o entre cuerpos diferentes. Siempre que exista una diferencia de temperatura, la energía se transfiere de la región de mayor temperatura a la de menor temperatura. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Muchas operaciones unitarias utilizadas en la elaboración de alimentos requieren de transferencia de calor, desde o hacia estos. La transferencia de calor puede efectuarse por 3 mecanismos: la conducción, la convección y la radiación (Fellows, 1994). Según Çengel (2007), la conducción es la transferencia de energía de las partículas más energéticas de una sustancia hacia las adyacentes, menos energéticas, como resultado de la interacción entre ellas; la convección es el modo de transferencia de calor entre una superficie sólida y un líquido o gas adyacentes que están en movimiento, y comprende los efectos combinados de la conducción y del movimiento del fluido; por su parte, la radiación es la energía emitida por la materia en forma de ondas electromagnéticas (o fotones), como resultado de los cambios en las configuraciones electrónicas de los átomos o moléculas. Según Rodríguez (1999), en determinados procesos de la industria alimentaria, la transmisión de calor adquiere una importancia relevante en procesos tales como los diferentes tratamientos para la destrucción de microorganismos (esterilización, pasteurización, escaldado, entre otros) y conservación de alimentos mediante el frío (refrigeración y congelación), a la vez que resulta especialmente importante sobre las propiedades de los alimentos (color, olor, sabor, textura y valor nutritivo). En una planta de procesado, el calentamiento y enfriamiento de los alimentos se lleva a cabo en equipos denominados intercambiadores de calor (Singh y Heldman, 1998); los cuales también pueden ser llamados cambiadores de calor, termocambiadores o termopermutadores (Amigo, 2000). Los intercambiadores de calor pueden clasificarse de manera genérica en intercambiadores directos e indirectos. Como sugiere esta denominación, en los intercambiadores indirectos el producto y el agente calefactor o refrigerante se mantienen separados físicamente mediante una pared, generalmente metálica. En los intercambiadores de calor directos hay contacto físico entre el producto y el agente calefactor o refrigerante. Por ejemplo, en un intercambiador de calor por inyección de vapor (directo), este último es inyectado directamente en el producto a calentar, mientras que en un intercambiador de calor de placas (indirecto), una lámina metálica

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separa la corriente de producto y la del agente calefactor o refrigerante permitiendo la transmisión de calor e impidiendo la mezcla de las corrientes (Singh y Heldman, 1998). Las direcciones del flujo de los fluidos en los intercambiadores de calor indirectos pueden ser de flujo paralelo o en serie, bien sea en el mismo sentido (equicorriente) o en sentido opuesto (contracorriente), y de flujo cruzado, cuando las corrientes mantienen direcciones que se cruzan, generalmente en forma perpendicular (Hermida, 2000). Por su parte, en los intercambiadores de calor directos solo se considera la mezcla de los fluidos ya sea por infusión o por inyección del vapor en los alimentos (Lewis y Heppell, 2000). Cuando se diseñan los intercambiadores de calor, se toma en consideración que el coeficiente global de transmisión de calor del mismo sea lo suficientemente elevado para obtener un buen rendimiento del equipo. Sin embargo, para obtener los más altos valores para este coeficiente es necesario ajustar las variables de las que depende, las cuales son: la turbulencia del flujo, la forma, el espesor, el tipo de material de fabricación, y la presencia de depósitos en la superficie de intercambio de calor, también conocida como ensuciamiento (Casp y Abril, 1999). Existe una amplia gama de alimentos que pueden ser sometidos a procesamiento mediante intercambiadores de calor, pero el tipo de intercambiador de calor a escoger dependerá principalmente de ciertos factores como la viscosidad del alimento, el tipo de tratamiento que se quiera suministrar al alimento y los niveles de producción que se requieran alcanzar (Richardson, 2000). 9.2.

MECANISMOS DE TRANSFERENCIA DE CALOR



Calor.

El calor se define como la energía cinética total de todos los átomos o moléculas de una sustancia. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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

Temperatura.

La temperatura es una medida de la energía cinética promedio de los átomos y moléculas individuales de una sustancia. Cuando se agrega calor a una sustancia, sus átomos o moléculas se mueven más rápido y su temperatura se eleva, o viceversa. Cuando dos cuerpos que tienen distintas temperaturas se ponen en contacto entre sí, se produce una transferencia de calor desde el cuerpo de mayor temperatura al de menor temperatura. La transferencia de calor se puede realizar por tres mecanismos físicos: conducción, convección y radiación, que se ilustran en la Figura 15.

9.2.1.

TRANSMISIÓN DE CALOR POR CONDUCCIÓN

La conducción, es el único mecanismo de transmisión de calor posible en los medios sólidos opacos, cuando en estos cuerpos existe un gradiente de temperatura. El calor se trasmite de la región de mayor temperatura a la de menor temperatura, debido al movimiento cinético o el impacto directo de las moléculas como en el caso de los fluidos en reposo o por el arrastre de los electrones como sucede en los metales. La ley básica de la conducción del calor (Joseph Fourier), establece: “La tasa de transferencia de calor por conducción en una dirección dada es proporcional al

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área normal a la dirección del flujo de calor y al gradiente de temperatura en esa dirección”. La conducción es el mecanismo de transferencia de calor en escala atómica a través de la materia por actividad molecular, por el choque de unas moléculas con otras, donde las partículas más energéticas le entregan energía a las menos energéticas, produciéndose un flujo de calor desde las temperaturas más altas a las más bajas. Los mejores conductores de calor son los metales. El aire es un mal conductor del calor. Los objetos malos conductores como el aire o plásticos se llaman aislantes. La conducción de calor sólo ocurre si hay diferencias de temperatura entre dos partes del medio conductor. Para un volumen de espesor ∆x, con área de sección transversal A y cuyas caras opuestas se encuentran a diferentes T1 y T2, con T2 > T1, como se muestra en la Figura 2, se encuentra que el calor ∆Q transferido en un tiempo ∆t fluye del extremo caliente al frío. Si se llama H (en Watts) al calor transferido por unidad de tiempo, la rapidez de transferencia de calor H = ∆Q/∆t, está dada por la ley de la conducción de calor de Fourier.

(1)

donde k (en W/mK) se llama conductividad térmica del material, magnitud que representa la capacidad con la cual la sustancia conduce calor y produce la consiguiente variación de temperatura; y dT/dx es el gradiente de temperatura. El signo menos indica que la conducción de calor es en la dirección decreciente de la temperatura. En la Tabla 1 se listan valores de conductividades térmicas para algunos materiales, los altos valores de conductividad de los metales indican que son los mejores conductores del calor.

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Figura 15. Transmisión de calor por conducción. Tabla 7. Algunos valores de conductividades térmicas. Metales, a 25ºC Sustancia k (W/mK) Alumini 238 oCobre 397 Or 314 o Hierro 79. 5 Plomo 34. 7 Plata 427 Latón 110

Gases, a 20ºC Sustancia k (W/mK) Air 0.0234 e Helio 0.138 Hidrógen 0.172 oNitrógeno 0.0234 Oxígeno 0.0238

Otros materiales Sustancia k (W/mK) Asbesto 0.08 Concreto 0.8 Diamante 2300 Vidri 0.84 o Hule 0.2 Madera 0.08 a 0.16 Corcho, 0.42 Tejido humano 0.2 Agua 0.56 Hielo 2

Si un material en forma de barra uniforme de largo L, protegida en todo su largo por un material aislante, como se muestra en la Figura 3, cuyos extremos de área A están en contacto térmico con fuentes de calor a temperaturas T1 y T2 > T1, cuando se alcanza el estado de equilibrio térmico, la temperatura a lo largo de la barra es constante. En ese caso el gradiente de temperatura es el mismo en cualquier lugar a lo largo de la barra, y la ley de conducción de calor de Fourier se puede escribir en la forma:

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Figura 16. Conducción de calor de Fourier

T ¿ 2−T (¿ 1) L H=kA ¿

9.2.2.

(2)

TRANSMISIÓN DE CALOR POR CONVECCIÓN

La convección es el mecanismo de transferencia de calor por movimiento de masa o circulación dentro de la sustancia. Puede ser natural producida solo por las diferencias de densidades de la materia; o forzada, cuando la materia es obligada a moverse de un lugar a otro, por ejemplo el aire con un ventilador o el agua con una bomba. Sólo se produce en líquidos y gases donde los átomos y moléculas son libres de moverse en el medio. En la naturaleza, la mayor parte del calor ganado por la atmósfera por conducción y radiación cerca de la superficie, es transportado a otras capas o niveles de la atmósfera por convección. Un modelo de transferencia de calor H por convección, llamado ley de enfriamiento de Newton, es el siguiente: H = h A (TA – T)

(3)

donde h se llama coeficiente de convección, en W/(m2 K), A es la superficie que entrega calor con una temperatura TA al fluido adyacente, que se encuentra a una temperatura T, como se muestra en el esquema de la Figura 4. La tabla 2 lista algunos valores aproximados de coeficiente de convección h. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Figura 17. Proceso de convección.

El flujo de calor por convección es positivo (H > 0) si el calor se transfiere desde la superficie de área A al fluido (TA > T) y negativo si el calor se transfiere desde el fluido hacia la superficie (TA < T).

Tabla 8. Valores típicos de coeficiente de convección. PROCESO H (W/m2K) Convección libre Gases 2-25 Líquidos 50-1000 Convección forzada Gases 25-250 Líquidos 50-20000 a) Convección libre o natural. Ocurre cuando la fuerza motriz procede de la variación de densidad en el fluido como consecuencia del contacto con una superficie a diferente temperatura, lo que da lugar a fuerzas ascensionales, el fluido próximo a la superficie adquiere una velocidad debida únicamente a esta diferencia de densidades, sin ninguna fuerza motriz exterior. Ejemplo: La convección en un tanque que contiene un líquido en reposo en el que se encuentra sumergida una bobina de calefacción.

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b) Convección forzada. Tiene lugar cuando una fuerza motriz exterior mueve un fluido con una velocidad (v), sobre una superficie que se encuentra a una temperatura Ts mayor o menor que la del fluido Tf, como la velocidad del fluido en la convección forzada es mayor que en la convección natural, se transfiere, por lo tanto, una mayor cantidad de calor para una determinada temperatura. Independiente de que la convección sea natural o forzada, la cantidad de calor transmitido Qc, se puede escribir (Ley de enfriamiento de Newton).

Qc=hA(T s −T f )

(4)

Donde: h = Coeficiente de transmisión del calor por convección en la interface líquido – sólido (w/m2 k) A = Área superficial en contacto con el fluido (m2) La ecuación anterior sirve como definición de (h), su valor numérico se tiene que determinar analítica o experimentalmente. En la figura adjunta se puede visualizar el perfil de un fluido adyacente a una superficie sólida

Figura 18. Distribución de la temperatura y velocidad de un fluido sobre una placa plana en convección forzada. Fuente: Alberto Emilio Panana Girio , 2008. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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 El coeficiente de transmisión de calor por convección forzada depende en general, de la densidad, viscosidad, de la velocidad del fluido, de las propiedades térmicas del fluido (K, Cp), es decir. ρ , n , v ,k , C p h=f ¿

(5)

 En la convección forzada la velocidad viene impuesta al sistema con una bomba, ventilador y se puede medir directamente. (6)

Vf =Qv / A

 En la convección natural, la velocidad es de la forma v  f (T,, g) , es decir depende de: ∆T = diferencia de temperatura entre la superficie y el fluido β = Coeficiente de dilatación térmica del fluido, que determina el cambio de densidad por unidad de diferencia de temperatura. g = Campo de fuerzas exteriores, en general es la gravedad  El número adimensional característico para la convección natural es el número de Grashoff (Gr) (7)

El número adimensional para la convección forzada es el número de Reynolds (#Re) (8) Donde: ρ = densidad del fluido, (kg/m3 ) µ = viscosidad dinámica del fluido, (kg/m.s) ν = viscosidad cinemática del fluido (m2 /s) V = velocidad media del fluido, (m/s) D = diámetro del tubo, (m)

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9.2.3.

TRANSMISIÓN DE CALOR POR RADIACIÓN

La radiación térmica es energía emitida por la materia que se encuentra a una temperatura dada, se produce directamente desde la fuente hacia afuera en todas las direcciones. Esta energía es producida por los cambios en las configuraciones electrónicas de los átomos o moléculas constitutivos y transportada por ondas electromagnéticas o fotones, por lo recibe el nombre de radiación electromagnética. La masa en reposo de un fotón (que significa luz) es idénticamente nula. Por lo tanto, atendiendo a relatividad especial, un fotón viaja a la velocidad de la luz y no se puede mantener en reposo. (La trayectoria descrita por un fotón se llama rayo). La radiación electromagnética es una combinación de campos eléctricos y magnéticos oscilantes y perpendiculares entre sí, que se propagan a través del espacio transportando energía de un lugar a otro. A diferencia de la conducción y la convección, o de otros tipos de onda, como el sonido, que necesitan un medio material para propagarse, la radiación electromagnética es independiente de la materia para su propagación, de hecho, la transferencia de energía por radiación es más efectiva en el vacío. Sin embargo, la velocidad, intensidad y dirección de su flujo de energía se ven influidos por la presencia de materia. Así, estas ondas pueden atravesar el espacio interplanetario e interestelar y llegar a la Tierra desde el Sol y las estrellas. La longitud de onda (λ) y la frecuencia (ν) de las ondas electromagnéticas, relacionadas mediante la expresión λν = c, son importantes para determinar su energía, su visibilidad, su poder de penetración y otras características. Independientemente de su frecuencia y longitud de onda, todas las ondas electromagnéticas se desplazan en el vacío con una rapidez constante c = 299792 km/s, llamada velocidad de la luz. Los fotones son emitidos o absorbidos por la materia. La longitud de onda de la radiación está relacionada con la energía de los fotones, por una ecuación desarrollada por Planck: (9)

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donde h se llama constante de Planck, su valor es h = 6,63 x 10-34 Js.

9.3.

EQUIPOS

INTERCAMBIADORES

DE

CALOR

EN

FERMENTACIONES Muchas operaciones unitarias utilizadas en la elaboración de alimentos requieren de transferencia de calor, desde o hacia estos. La transferencia de calor puede efectuarse por 3 mecanismos: la conducción, la convección y la radiación (Fellows, 1994). Según Çengel (2007), la conducción es la transferencia de energía de las partículas más energéticas de una sustancia hacia las adyacentes, menos energéticas, como resultado de la interacción entre ellas; la convección es el modo de transferencia de calor entre una superficie sólida y un líquido o gas adyacentes que están en movimiento, y comprende los efectos combinados de la conducción y del movimiento del fluido; por su parte, la radiación es la energía emitida por la materia en forma de ondas electromagnéticas (o fotones), como resultado de los cambios en las configuraciones electrónicas de los átomos o moléculas. Según Rodríguez (1999), en determinados procesos de la industria alimentaria, la transmisión de calor adquiere una importancia relevante en procesos tales como los diferentes tratamientos para la destrucción de microorganismos (esterilización, pasteurización, escaldado, entre otros) y conservación de alimentos mediante el frío (refrigeración y congelación), a la vez que resulta especialmente importante sobre las propiedades de los alimentos (color, olor, sabor, textura y valor nutritivo). En una planta de procesado, el calentamiento y enfriamiento de los alimentos se lleva a cabo en equipos denominados intercambiadores de calor (Singh y Heldman, 1998); los cuales también pueden ser llamados cambiadores de calor, termocambiadores o termopermutadores (Amigo, 2000). Los intercambiadores de calor pueden clasificarse de manera genérica en intercambiadores directos e indirectos. Como sugiere esta denominación, en los intercambiadores indirectos el producto y el agente calefactor o refrigerante se mantienen separados físicamente mediante una pared, generalmente metálica. En los intercambiadores de calor directos hay contacto físico entre el producto y el agente UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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calefactor o refrigerante. Por ejemplo, en un intercambiador de calor por inyección de vapor (directo), este último es inyectado directamente en el producto a calentar, mientras que en un intercambiador de calor de placas (indirecto), una lámina metálica separa la corriente de producto y la del agente calefactor o refrigerante permitiendo la transmisión de calor e impidiendo la mezcla de las corrientes (Singh y Heldman, 1998). Las direcciones del flujo de los fluidos en los intercambiadores de calor indirectos pueden ser de flujo paralelo o en serie, bien sea en el mismo sentido (equicorriente) o en sentido opuesto (contracorriente), y de flujo cruzado, cuando las corrientes mantienen direcciones que se cruzan, generalmente en forma perpendicular (Hermida, 2000). Por su parte, en los intercambiadores de calor directos solo se considera la mezcla de los fluidos ya sea por infusión o por inyección del vapor en los alimentos (Lewis y Heppell, 2000). Cuando se diseñan los intercambiadores de calor, se toma en consideración que el coeficiente global de transmisión de calor del mismo sea lo suficientemente elevado para obtener un buen rendimiento del equipo.

9.3.1. 9.3.1.1.

Generalidades de los intercambiadores de calor Definición de Intercambiador de Calor

Según Shah y Sekulic (1998), un intercambiador de calor es un equipo empleado para transferir energía térmica entre 2 o más fluidos, entre una superficie sólida y un fluido, o entre partículas sólidas y un fluido, a temperaturas diferentes y en contacto térmico, usualmente sin calentamiento externo ni interacciones de trabajo. Otros autores, como Amigo (2000) y Çengel (2007), definen los intercambiadores de calor como aparatos que facilitan el intercambio de calor entre 2 fluidos que se encuentran a temperaturas diferentes y evitan al mismo tiempo que se mezclen entre sí. 9.3.1.2.

Clasificación de los Intercambiadores de Calor.

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Singh y Heldman (1998), clasifican a los intercambiadores de calor según el tipo de contacto que poseen con el alimento que calientan o enfrían, en intercambiadores de contacto directo y de contacto indirecto, tal y como se puede observar en la Figura 6. A su vez, en la Figura 7, se esquematiza una clasificación de los intercambiadores de calor indirectos, según Amigo (2000).

Figura 19. Clasificación de los intercambiadores de calor. Fuente: Singh y Heldman, 1998.

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Figura 20. Clasificación de los intercambiadores de calor indirectos. Fuente: Amigo, 2000. Por su parte, Rodríguez (1999), ha establecido la siguiente clasificación para los intercambiadores de calor:  Regeneradores: en estos, un fluido caliente y un fluido frío circulan alternativamente. Cuando circula el fluido caliente, este se enfría en su paso a través del regenerador, acumulándose la energía en el último; a continuación, circula el fluido frío, que aumenta su temperatura al recuperar la energía que previamente se había almacenado en el regenerador.  Intercambiadores cerrados: en estos equipos,

los

fluidos

circulan

simultáneamente intercambiando calor, manteniéndose separados por una pared metálica.  Intercambiadores abiertos: donde los fluidos intercambian calor al entrar en contacto directo entre ellos. 9.3.1.3.

Descripción de los Intercambiadores de Calor.

De acuerdo con la clasificación establecida por Singh y Heldman (1998), a continuación, se hace una breve descripción de diferentes intercambiadores de calor UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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tomando en consideración el material de fabricación, su funcionamiento, su mínima o máxima capacidad de operación en función de la presión, el volumen o la temperatura, entre otras características. De igual forma, se mencionan las propiedades de determinados intercambiadores de calor diseñados y comercializados por algunos fabricantes a nivel mundial. A.

INTERCAMBIADORES DE CALOR INDIRECTOS.

Los intercambiadores de calor de contacto indirecto, son aquellos que facilitan el intercambio de calor entre 2 fluidos que se encuentran a temperaturas diferentes, evitando al mismo tiempo que se mezclen entre sí (Çengel, 2007). Entre los fluidos que intervienen se encuentran el producto alimenticio y el agente calefactor o el agente refrigerante, estando estos separados mediante una pared metálica (Singh y Heldman, 1998). Atendiendo a las direcciones del flujo de ambos fluidos en el interior del equipo, los intercambiadores de calor pueden ser: de flujo paralelo o en serie y de flujo cruzado. El flujo paralelo es aquel que se da cuando los fluidos mantienen direcciones paralelas, bien sea en el mismo sentido (equicorriente) o en sentido opuesto (contracorriente); mientras que el flujo cruzado es el que ocurre cuando las corrientes mantienen direcciones que se cruzan, formando un ángulo, generalmente perpendicular (Amigo, 2000; Hermida, 2000). Los intercambiadores de calor de contacto indirecto incluyen a los intercambiadores tubulares, intercambiadores de superficies rascadas o raspadas, intercambiadores de carcasa y tubos y a los intercambiadores de placas (Singh y Heldman, 1998; Sharma y otros, 2003).  Intercambiadores de calor tubulares. Bajo este nombre se agrupan todos los intercambiadores de calor en los que la superficie de intercambio está formada por tubos, cualquiera que sea su disposición (Casp y Abril, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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1999). Estos equipos, después de los intercambiadores de calor de placas, son los más comunes en la industria de los alimentos (Sannervik y otros, 1996).  Intercambiadores de calor de tubo liso. Según Amigo (2000), los intercambiadores de calor tubulares más sencillos que se pueden encontrar en la industria del procesado de alimentos son los de tubo liso o tubo único. Dentro de ellos circula el agente calefactor o el refrigerante y su parte externa entra en contacto con el alimento. Las 2 variantes más comunes de estos intercambiadores se describen a continuación:

-

El intercambiador de calor de haces tubulares, que consta de varios tubos paralelos que van soldados por sus extremos, a otros, un poco más gruesos, denominados colectores, tal y como se muestra en la Figura 8.

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Figura 21. Intercambiador de calor de haces tubulares. Fuente: Amigo, 2000. Estos trabajan generalmente en inmersión y operan, bien como evaporadores de una máquina frigorífica, o como integrantes de un circuito secundario, ya sea para calentamiento o refrigeración del fluido en el cual se hallan sumergidos. Se pueden fabricar con materiales metálicos, como

los

tradicionales, así como

con materiales sintéticos, inertes y flexibles, como el polietileno reticulado, que permiten su introducción en depósitos con puntos de acceso estrechos. -

El intercambiador de calor de serpentín, que consiste en un tubo liso enrollado en espiral, para evitar el empleo de codos y colectores. Este se encuentra diseñado en forma de carrito sobre el cual se soporta una máquina frigorífica, como se muestra en la Figura 9. El diseño que posee este equipo, permite fácilmente su traslado.

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Figura 22. Intercambiador de calor de serpentín: (a) serpentín y (b) cámara frigorífica sobre carrito, mientras se inserta el serpentín en un tanque de fermentación. Fuente: Amigo, 2000.

Los citados equipos son frecuentemente empleados en enología para el control de la temperatura de fermentación de los mostos, en instalaciones técnicamente poco actualizadas. En los últimos años, los intercambiadores de calor de

serpentín han evolucionado para dar lugar a los depósitos con camisas, en los cuales el serpentín se ha sustituido por una doble pared, que envuelve la parte superior externa del depósito, como puede apreciarse en la Figura 10. (Amigo, 2000).

Figura 22. Depósito con camisa. Fuente: Amigo, 2000. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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 Intercambiadores de calor de tubos coaxiales. Los intercambiadores de calor de tubos coaxiales son también llamados de tubos concéntricos o de tubo doble. Estos constan de 2 tubos de diámetro diferente, encontrándose el de menor diámetro en el interior del otro tubo. Por el interior de los mismos circulan paralelamente los fluidos, ya sea en el mismo sentido o en sentido contrario, como se indicó anteriormente, siendo el producto alimenticio el que generalmente fluye por el espacio central, mientras que el fluido térmico fluye por el espacio anular que queda libre entre los 2 tubos (Singh y Heldman, 1998; Casp y Abril, 1999). Los tubos que se emplean en la fabricación de estos intercambiadores pueden ser lisos o corrugados (Casp y Abril, 1999). La corrugación ondula la superficie del tubo de forma regular y la superficie ondulante de ambos tubos crea entrantes y salientes, que obligan a los fluidos a circular en régimen turbulento, lo que mejora la transferencia de calor. Por otra parte, estos intercambiadores ofrecen un gran número de posibilidades en cuanto al diseño del tubo, tamaño, forma y profundidad del corrugado, cuya adaptación a los diferentes alimentos a tratar varía en función de las características físicas de los mismos (viscosidad, densidad, presencia de partículas sólidas, tamaño de las partículas). Estos tubos se fabrican en acero inoxidable, acero al carbono y materiales que se adapten bien a las características de los productos a tratar (Amigo, 2000).

Figura 23. Intercambiador de calor de tubos coaxiales corrugados. Fuente: Amigo, 2000. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Entre los alimentos que pueden ser procesados en intercambiadores de calor de tubos coaxiales se encuentran: cremas y pulpas de frutas u hortalizas, yogurt con trozos de frutas, mostos, jugos, mermeladas, sopas, aceite vegetal, salsa de tomate (kétchup) y mostaza, entre otros productos (HRS Heat Exchangers Limited, 2002). Intercambiadores de calor de triple tubo concéntrico. Según Zuritz (1990), los intercambiadores de calor de triple tubo concéntrico son una versión mejorada de los intercambiadores de calor coaxiales. Las mejoras principales incluyen un área más grande por unidad de longitud de tubo, disponible para la transferencia de calor, así como mejores coeficientes globales de transferencia de calor. Estos equipos están integrados

por 3

tubos posicionados en un mismo eje, en donde los agentes

refrigerantes y calefactores circulan alternativamente por el tubo interior (de menor diámetro) y por el espacio anular exterior (tubo de mayor diámetro), mientras que el producto circula por el espacio anular intermedio. Según Singh y Heldman (1998), algunas aplicaciones industriales de los intercambiadores de calor de triple tubo concéntrico son:  El calentamiento intenso de zumo de naranja a 93 °C y posterior enfriamiento a 4 °C.  El enfriamiento del agua de lavado del requesón desde 46 hasta 18 °C, con agua fría.  El enfriamiento con amoníaco de la mezcla del helado desde 12 hasta 0,5 °C. Intercambiadores de calor de tubos con aletas. Los intercambiadores de calor de tubos con aletas, también llamados aletados, son equipos que están especialmente diseñados para mejorar el intercambio de calor entre 2 fluidos, 1 de los cuales, al menos, es un gas. Estos están elaborados a partir de tubos de cobre o acero, acodados, dispuestos en un serpentín plano, de una o varias capas, sobre las que se montan perpendicularmente al eje, láminas muy finas de aluminio que se fijan a la superficie de los tubos, como se muestra en la Figura 24. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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La separación entre las láminas depende de las aplicaciones y de los fabricantes, y puede oscilar desde 3 hasta 18 mm. La unión entre las láminas o aletas y los tubos puede llevarse a cabo por soldadura o cualquier otro procedimiento, siempre que el contacto entre las superficies sea bueno y facilite la transmisión del calor (Amigo, 2000).

Figura 24. Intercambiador de calor de tubos con aletas. Fuente: Shah y Sekulic, 1998.

Figura 25. Disposición de los tubos al tresbolillo. Fuente: Amigo, 2000. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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El fluido que circula por el exterior (entre las aletas), generalmente “aire”, es impulsado a través de los tubos mediante ventiladores (Amigo, 2000). Por otro lado, el fluido que circula por el interior de los tubos puede ser:

amoníaco, dióxido de carbono,

compuestos clorofluorocarbonados (CFC) o hidrofluorocarbonados (HFC), entre otros, siendo estos últimos los más utilizados en la actualidad, debido a que no presentan riesgos para la integridad de la capa de ozono (Shah y Sekulic, 1998). En estos equipos el intercambio se produce mediante el flujo cruzado de los fluidos. Cuando los tubos van dispuestos en varios planos, se procura que la colocación sea al “tresbolillo”, como se observa en la Figura 25, para que el aire que circula entre 2 tubos de la primera fila se encuentre con un tubo de la segunda. Para facilitar el movimiento de aire y proteger el

equipo,

muchos

de

estos intercambiadores se presentan dentro de una

envolvente o armazón de plástico, aluminio o acero, que a modo de caja facilita la instalación y permite crear embocaduras en las que se colocan los ventiladores, como se muestra en la Figura 26. (Amigo, 2000).

Figura 26. Intercambiador de calor de tubos con aleta, con envolvente y ventiladores. Fuente: Refrisa, 2008.  INTERCAMBIADORES DE CALOR DE SUPERFICIE RASCADA. Son intercambiadores constituidos por 2 tubos concéntricos, dispuestos casi siempre en posición vertical (Casp y Abril, 1999). Dentro del tubo central, estos equipos disponen UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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de un rotor o cilindro rotatorio, al que se encuentran unidas una serie de paletas o láminas sólidas, que mantienen en continua agitación al producto, raspando la superficie de intercambio, evitando así que se produzcan depósitos (ensuciamiento) en dicha superficie, para mantener un proceso de transferencia de calor uniforme (Harrod, 1986; Mabit y otros, 2008). Por el espacio anular entre ambos tubos, circula el agente calefactor o refrigerante, que puede ser vapor, agua caliente o fría, salmuera u otro refrigerante como Freón (Singh y Heldman, 1998). Las paletas del intercambiador se fabrican cubiertas por un material plástico y la velocidad de rotación de las mismas varía desde 150 hasta 500 rpm. Las superficies en contacto con los alimentos de estos equipos se fabrican en acero inoxidable, níquel, aleación de cromo u otros materiales resistentes a la corrosión (Singh y Heldman, 1998). En la Figura 27, se muestra un intercambiador de calor de superficie rascada.

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Figura 27.

Intercambiador

de calor de

superficie

rascada. Fuente: Richardson, 2000. 

INTERCAMBIADORES DE CALOR DE CARCASA Y TUBOS.

Estos intercambiadores de calor también son denominados intercambiadores de calor multitubulares (Ashurst, 1999; Amigo, 2000). Estos equipos se emplean cuando se requiere un área de calefacción elevada, tomando en cuenta que poseen un volumen más reducido para una superficie igual a la requerida por los intercambiadores de calor tubulares. Básicamente, consisten en una carcasa fija, en el interior de la cual se encuentran un conjunto de tubos cilíndricos paralelos, situados horizontalmente o verticalmente (Rodríguez, 1999). Según Shah y Sekulic (1998), los intercambiadores de calor de carcasa y tubos, son ampliamente utilizados en la industria debido a la gran capacidad y condiciones de operación que poseen, que incluyen desde el trabajo a presiones ultra elevadas (1.000 bar ó 100.000 kPa) hasta el empleo de elevadas temperaturas (cerca de 1100 °C). En estos intercambiadores UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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cualquier diferencia de presiones y temperaturas entre fluidos se encuentra limitada por los materiales que se empleen en la construcción de estos equipos. También pueden ser diseñados de diversos tamaños según las necesidades, desde los más pequeños, con superficies de 1m2, hasta los más grandes que pueden alcanzar los 100.000 m2. Los tubos en el interior de la carcasa pueden ser corrugados para aumentar el coeficiente de transferencia de calor en un 30 % aproximadamente, y a su vez son elaborados a base de acero inoxidable para el procesamiento de productos alimenticios (Lewis y Heppell, 2000).

Figura 28. Intercambiador de calor de carcasa y tubos. Fuente: Çengel, 2007. 

INTERCAMBIADORES DE CALOR DE PLACAS.

Los intercambiadores de calor de placas son ampliamente empleados para el calentamiento, el enfriamiento y la regeneración de calor en la industria de los alimentos (Galeazzo y otros, 2006). Existen diversos tipos de intercambiadores de calor de placas, tales como: de placas simples, de placas con juntas o selladores y de placas soldadas. Sin embargo, en la actualidad, en la industria de los alimentos han encontrado mayor empleo los intercambiadores de calor de placas con juntas o selladores (Richardson, 2000). -

Intercambiadores de calor de placas simples. Estos consisten en 2 planchas o láminas, generalmente de acero inoxidable o aluminio, sobre las que se ha formado un circuito. Estas 2 láminas, después de disponerlas convenientemente,

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se sueldan, y quedan como una placa única. Los diseños de los circuitos pueden tomar formas muy diversas, como: zigzag, asurcadas y punteadas, entre otras; mientras que la placa puede ser geométricamente plana, plegada en forma de prisma o cilíndrica (Amigo, 2000). Los intercambiadores de calor de placas simples operan por inmersión, colocándose dentro del fluido a tratar térmicamente, que puede ser un líquido o gas. Fundamentalmente, se destinan al enfriamiento de líquidos contenidos en un depósito o tanque, pero también pueden emplearse para calentamiento. Estos equipos generalmente se emplean en la industria enológica, así como en las balsas de agua para acumulación de hielo, de uso frecuente en la industria láctea (Amigo, 2000). -

Intercambiadores de calor de placas con juntas o selladores. Los intercambiadores de calor de placas con juntas o selladores, consisten en un conjunto de placas de metal, unidas una contra la otra a presión, encontrándose sostenidas por un bastidor o armazón. Las entradas y salidas de las placas se sellan mediante juntas de materiales como caucho, siliconanitrilo y butilo, entre otros, para evitar la mezcla de los fluidos que circulan poellas. Estas juntas, al mismo tiempo, sirven para conducir las corrientes defluido calefactor o refrigerante y del producto, haciendo que ambos circulen por placas alternas (Singh y Heldman, 1998).

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Figura 28

.

Intercambiador de calor de placas con juntas: 1) bastidor, 2) placa, 3) conexiones, 4) juntas y 5) guías para las placas. Fuente: COMEVAL S.L., 2006. -

Intercambiadores de calor de placas soldadas. Según Amigo (2000), los intercambiadores de calor de placas soldadas son aquellos en los que las placas se mantienen selladas entre sí mediante soldadura con cobre. Estos equipos constituyen un bloque de placas mucho más sencillo en su estructura que los de placas con juntas descritos en el punto anterior, ya que no necesitan bastidor, ni tornillos de apriete, ni por supuesto juntas de estanqueidad. En estos intercambiadores, el paquete de placas comienza y termina en 2 placas más gruesas que las restantes, en las que se ubican las tomas para dar entrada y salida a los fluidos. A su vez, permiten operar a temperaturas y presiones mayores que los intercambiadores de placas con juntas, con presiones de hasta 40 bar y temperaturas que alcanzan los 350 °C, siendo estos además, muy compactos, potentes y de tamaño muy reducido para las prestaciones que son capaces de ofrecer.

B.

INTERCAMBIADORES DE CALOR DIRECTOS.

Según Lewis y Heppell (2000), en los intercambiadores de calor directos o sistemas de intercambio directo de calor, el producto es calentado a temperatura de esterilización, mezclándolo con vapor de agua. Uno de los principios básicos del procesamiento UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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mediante estos equipos es que parte del vapor de agua empleado se condensa, cediendo su calor latente de vaporización al producto, generando así, una tasa de calentamiento mucho más rápida que la que podría permitir cualquier intercambiador de calor indirecto. El vapor puede ser inyectado en el producto mediante un “intercambiador de calor por inyección de vapor”, o se puede bombear el producto a una cámara con vapor en forma de cortina (“spray”), a través de un “intercambiador de calor por infusión de vapor”. Así mismo, los intercambiadores de calor tanto de infusión como de inyección de vapor operan integrados a sistemas que comprenden por lo general una serie de etapas o procesos básicos que se efectúan según los requerimientos del producto, entre los cuales se encuentran: 1. Proceso de precalentamiento. 2. Proceso de calentamiento. 3. Proceso de retención (en inglés, Holding). 4. Proceso de evaporación del agua excedente al vacío. 5. Proceso de regeneración o enfriamiento. Considerando los procesos señalados anteriormente, otro principio básico de los sistemas de calentamiento directo de productos alimenticios, consiste en hacer pasar el producto alimenticio líquido de un tanque o depósito de balance hacia una fase de precalentamiento, usualmente en un intercambiador de calor de placas a temperaturas entre 70 y 80 °C (para un procesamiento posterior a UHT). Seguidamente, el producto se hace pasar a través de la bomba principal hacia el intercambiador de calor por inyección o infusión de vapor. Luego de retener el producto en calentamiento durante el tiempo requerido, se hace pasar a través de una válvula reductora hacia una fase de evaporación del agua excedente en la fase anterior. La evaporación del agua se lleva a cabo en una cámara donde se mantiene el producto a una presión específica, correspondiente a la temperatura del mismo en la fase de precalentamiento. De esta forma, el producto hierve instantáneamente liberando el exceso de fluido y regresa a la temperatura que poseía inicialmente en la fase de precalentamiento antes de la infusión o inyección del vapor (Richardson, 2000).

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-

Intercambiadores de calor por inyección de vapor. En los intercambiadores de calor por inyección de vapor el producto a calentar, generalmente, se alimenta por un tubo por la parte superior del intercambiador y el vapor se alimenta por un tubo adyacente haciendo contacto con las gotas de producto, como se muestra en la Figura 29, que van cayendo en forma de película. Como marco de referencia de las presiones y temperaturas del proceso, el vapor se inyecta a una presión de 965 kPa en un producto líquido que ha sido precalentado a 76 °C, para elevar su temperatura hasta 150 °C. Después de permanecer el alimento a esta temperatura durante el tiempo necesario (2,5 s), se enfría por evaporación hasta 76 °C, en una cámara a vacío relativo (Fellows, 1994).

Figura 29.

Calentamiento de

un producto

en un intercambiador de

calor por Fuente: Singh y Heldman, 1998.

inyección de vapor.

Según Lewis y Heppell (2000), existen diversos diseños de intercambiadores de calor por inyección de vapor o inyectores de vapor, desarrollados y usados por distintos

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manufactureros, pero todos ellos tienden a poseer los requerimientos de bajo costo y mínimas complicaciones de uso.

Figura 30. Diseños típicos de intercambiadores de calor por inyección de vapor:a) primer diseño, b) segundo diseño y c) tercer diseño. Fuente: Lewis y Heppell, 2000.

-

Intercambiadores de calor por infusión de vapor. Según Fellows (2000), en los intercambiadores de calor por infusión de vapor el alimento precalentado es

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rociado a través de orificios y cae en forma de fina película a un recipiente que contiene vapor a elevada presión (450 kPa). En este recipiente el producto se calienta en 0,3 s a temperaturas entre 142 y 146 °C y se mantiene a la temperatura deseada durante 3 s en un tubo o sección de mantenimiento, evaporándose el vapor condensado seguidamente en una cámara a vacío relativo hasta alcanzar una temperatura entre 65 y 70 °C.

Según Richardson (2000), los intercambiadores de calor por infusión de vapor fueron diseñados para procesar los mismos alimentos que pueden ser tratados con los intercambiadores de calor por inyección de vapor, con la diferencia de que en los primeros el tratamiento térmico es más delicado con el producto. A su vez, en estos intercambiadores la cámara de vapor del intercambiador es usualmente un recipiente con una base de forma cónica a través de la cual el producto calentado pasa hacia el tubo de mantenimiento, tal y como se muestra en la Figura 20.

Figura 31. Intercambiador de calor por infusión de vapor. Fuente: Sharma y otros, 2003. Es preciso tener en cuenta la calidad del vapor de agua en el procesamiento por intercambio directo de calor. Esta agua debe ser potable, libre de sustancias volátiles, UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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aceites, suciedad o cualquier otro elemento que pueda afectar una característica sensorial en particular, las características sensoriales del producto o su inocuidad (Lewis y Heppell, 2000).

CAPÍTULO X UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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RESOLUCIÓN DE UN PROBLEMA DE DISEÑO DE UN INTERCAMBIADOR DE CALOR PARA EL FERMENTADOR

 PROBLEMA 1: DISEÑO DE UN QUIMOSTATO Si se tiene un microorganismo que sigue una cinética del tipo Monod, donde la velocidad de crecimiento se describe como:

μ= Con los siguientes parámetros max = 0,7 hr-1 Ks

μ max S Ks +S

= 5 g/l

Y x/s = 0,65

El flujo de alimentación es de 500 l/hr con 85 g/l de sustrato. a) Si se utilizan un fermentador que opera en forma continua y perfectamente agitada, ¿Qué tamaño debe se este reactor si opera en forma óptima? b) ¿Cuál es la conversión de sustrato? c) ¿ Cual es la concentración de biomasa a la salida? d) Indique los supuestos aplicados.

SOLUCIÓN

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a) Se pide determinar el tamaño del fermentador si éste opera en condiciones óptimas. Doptimo = max * {1 – (ks/(ks + s0))0.5} = 0.7 * {1 – (5/(5+85))0.5} Doptimo = 0,535 h-1 = F/V Despejando V se tiene que V = 500/0,535 = 934,5 L b) Determinar el grado de conversión del substrato. s = D * ks / (max – D) = 0,53 * 5 / (0.7 – 0.53) = 2,56 / 0,17 s = 15,58 g/L El grado de conversión del substrato es:  = (85 – 15,58) / 85 *100 = 81,6 % c) Determinar la concentración de biomasa a la salida. x = Yx/s (s0 – s) = 0,65 * (85 – 15,58) x = 45,123 g/L d) Los supuestos aplicados son los siguientes: 

La alimentación es estéril (x0 = 0)



La densidad permanece constante ( = cte)



El volumen permanece constante (V = cte)



El sistema se encuentra en estado estacionario (dx/dt = ds/dt = 0)



La velocidad de muerte es mucho menor que la de crecimiento (kd << )



Los requerimientos para mantención son mucho menores que los necesarios para el crecimiento (ms << )



La síntesis de producto es despreciable (qp << )



El rendimiento del substrato en biomasa es independiente de las condiciones de operación y de la velocidad de crecimiento



El sistema se encuentra perfectamente agitado, luego las concentraciones en el fermentador son iguales a las concentraciones en la corriente de salida del fermentador (s = ss ; x = xs).

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

Existe un solo substrato limitante del crecimiento (s), los demás se encuentran en exceso y no afectan dicho parámetro.

-

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PROBLEMA 2: DISEÑO DE UN QUIMIOSTATO Se tiene un fermentador para producir biomasa. El volumen del reactor es de 0.5m 3. El sistema está siendo operado de tal modo que el fermentador sólo se produce el crecimiento de biomasa. La concentración de sustrato en la alimentación es de 10 kg/m 3. Los parámetros cinéticos y de recuperación son: Yx/s = 0.5 kg/kg Ks = 1.0 kg/m3 max = 0.12 hr-1 ms = 0.025 kg/kg hr Asumiendo que la síntesis de producto es despreciable. Determine: a). Concentración de biomasa a la salida del primer fermentador, si se sabe que la conversión de sustrato en este fermentador es del 40%. b). ¿Es significativo el término de mantención y por qué?

SOLUCIÓN a) Determinar el volumen del fermentador. Balance de Biomasa: F x0 – F x +  x V – kd x V = d xV/dt Asumiendo estado estacionario y volumen constante, d xV/dt = 0 x1= 0 y kd= 0, luego se tiene D = F/V =  Aplicando D = m s/(ks + s) Según los niveles de conversión de sustrato igual a un 40% S = (1-0.4)* So = 0.6* 10 = 6 kg/m3.

(1)

Aplicando dicho valor en (1) se puede calcular D D = 0.12 * 6/(1+6) = 0.102 hr-1 Determinar la concentración de biomasa a la salida del fermentador. Balance de biomasa: F So - F S -  x V/Yx/s – qp x V/Yp/s – ms x V = d sV/dt No hay producción de producto qp = 0 Estado estacionario d sV/dt =0 D(So – S) – x(/Yx/s + ms) = 0 x = D(S0 – S) / (/Yx/s + ms) x = 0.102*(10 –6) / (0,102/0,5 +0,05) = 0.408/0.229 = 1.78g/L b) Indicar si términos mantención y conversión de producto son significativos. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Si no se consideran esos términos, se tiene X = Yx/s (S – S0) = 0,5 *(10 - 6) = 2.0g/L Comparando con el valor real; la diferencia es Dif = (2.00- 1.78) / 2.0 = 11% La diferencia es inferior a un 15%, NO resulta significativos.

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PROBLEMA 3: Modificaciones del Quimostato Problema Sistema con Reciclo Para un fermentador con reciclo , ver figura. a) b)

Demuestre que  = D ( xs/x ). Indique todos los supuestos aplicados. Una cepa de levadura es cultivada en un fermentador de 30 lt El sistema de separación ha sido diseñado de tal manera que la concentración de biomasa a la salida del separador (xs) sea el 30% de la biomasa que entra en éste, la concentración de sustrato se mantiene igual en todas las corrientes. La velocidad de crecimiento de esta levadura se puede representar por una expresión tipo Monod, cuyos parámetros son: Ks = 0.05 g/l max = 0.3 hr-1 yx/s = 0.25 Utilizado la relación de a), calcule la concentración de biomasa y sustrato a la salida del fermentador. Considere que la alimentación fresca al fermentador tiene una concentración de sustrato, so , de 10 g/l y un flujo de 20 l/hr.

c) Compare los valores obtenidos en b) con un sistema sin reciclo.

Salida del Fermentador, x

Alimentación Fresca, F, so

Separador de Células

Salida F, xs

Fermentador

Reciclo SOLUCIÓN a) Asumiendo que el sistema se encuentra en estado estacionario, se plante al balance de biomasa: d(Vx)/dt = F x0 +  F c x +  V x – (-1) x F = 0 Asumiendo que el volumen se mantiene constante en el tiempo, es posible dividir por V: UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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dx/dt = D x0 +  c D x +  x – D (+1) x = 0 Si la corriente de entrada al fermentador está libre de células, D x 0 = 0. Reordenando la expresión anterior se tiene: D (+1 - c) =  Se plantea el balance de biomasa en el filtro: F (+1) x =  F c x – F xs

(1)

Reordenando se tiene: xs / x =  c -  - 1

(2)

Despejando c de la ecuación (2) y reemplazando en (1) se tiene: D ( xs / x) =  b)

Se pide calcular xs y s. A partir de los datos entregados, se tiene que  = 0,3 s /(0,05 + s) (3)

como xs/x = 0,3 y considerando la relación de la parte (a):  = 0,3 D = 0,3 * 20 [L/h] / 30 [L] = 0,2 [1/h] A partir de la ecuación (3) se calcula el valor de s: S = 0,05 * 0,2 / (0,3 – 0,2) = 0,1 [g/L] A partir del balance de substrato se tiene la expresión:  x = D Yx/s (s0 – s)

(4)

Reemplazando los valores conocidos en la ecuación (2) se tiene: x = 2/3 * 0,25/0,2 * (10 – 0,1) = 8,25 g/L luego xs = 0,3 x = 2,475 g/L c) Resulta imposible operar a estas tasa de dilución en un sistema sin reciclo ya que se estaría trabajando por sobre el DCritico.

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PROBLEMA 4: Reactores en Serie Un sistema de 2 fermentadores FPA es utilizado para la producción de un metabolito secundario. El volumen del primer reactor es de 0.5m 3. El sistema está siendo operado de tal modo que en el primer fermentador sólo se produce el crecimiento de biomasa y el segundo es utilizado para la síntesis del producto. La concentración de sustrato en la alimentación es de 10 kg/m 3. Los parámetros cinéticos y de recuperación son: Yx/s max qp

= 0.5 kg/kg = 0.12 hr-1 = 0.16 kg/kg hr

Ks = 1.0 kg/m3 ms = 0.025 kg/kg hr = 0.85 kg/kg

Yp/s

Asumiendo que la síntesis de producto es despreciable en el primer fermentador y que el crecimiento bacteriano es despreciable en el segundo reactor. Determine: a) El volumen del segundo fermentador si se desea una conversión global de sustrato superior al 95% b) Concentración de producto a la salida del segundo fermentador Alimentación Fresca, F, so F, x2, s2

Sólo crecimiento de Biomasa

Sólo Formación de producto

Salida F, x3, s3 SOLUCIÓN a) Se espera un grado de conversión del substrato mayor que 95%, es decir, s 3 es menor que 0,5 [kg/m3]. Se pide determinar el volumen mínimo necesario para alcanzar dicha conversión. Como no se produce crecimiento de la biomasa en el segundo reactor, es posible despreciar el término crecimiento en el balance de masa al substrato (ecuación 2), y se asume que la concentración de biomasa en el segundo reactor permanece invariablemente igual a la de salida del primer reactor (x2 = x3). Es debido considerar el término síntesis de producto. La ecuación de balance de substrato queda: F/V s2 – F/V s3 – ms x2 – qp x2 / Yp/s = 0

(3)

Se necesita determinar el valor de x2. En el primer reactor se tiene

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Si el nivel de conversión del substrato es 40% significa que en solución quedan 6 kg/m 3, luego s2 = 6 kg/m3. Del balance de masa a la biomasa se tiene que  = D1 = F/V1

(4)

Asumiendo que el m.o. sigue una cinética tipo Monod:  = m s /(ks+ s) donde s corresponde a s2. Reemplazando los valores conocidos se despeja  = 0,103 [1/h] Reemplazando en la ecuación (4) se obtiene el valor de F: 0,103 [1/h] * 0,5 [m3] = 0,0515 [m3/h] El balance de masa para el substrato en estado estacionario es: F s0 – F s2 -  V1 x2 / Yx/s – ms x2 V1 - qp x2 V / Yp/s = 0

(5)

Como en el primer reactor no hay síntesis de producto, el último término se desprecia. Dividiendo por V (asumiendo volumen constante) se tiene: D1 s0 – D1 s2 -  x2 / Yx/s – ms x2 = 0 Reemplazando los valores conocidos y despejando x2 se tiene: x2 = 1,78 [kg/m3] Reemplazando los valores conocidos en la ecuación (3) y despejando V se tiene: V2 = 0,745 [m3] Por lo tanto, el volumen del segundo fermentador debe ser mayor que 0,745 m 3 para alcanzar un grado de conversión del substrato mayor que 95%. b) Masa de Producto a la Salida Balance de Masa de producto F*p2 – F* p3 +qp * x3*V2 = dpV/dt Suponiendo que no ingresa producto y que no hay acumulación p3 = qp * x3*V2/F Como x2 = x3 = 0.178 [kg/m3] p3 = qp * x3*V/F = 0.16 * 0.178 *0,745/0.0515 = 4.12 [kg/m3]

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

PROBLEMA 5.

Lactobacillus casei son cultivadas en un fermentador que opera forma fed-batch, en estado cuasi-estacionario, con un flujo de alimentación de 4 m 3/hr y una concentración de sustrato en la alimentación de 80 kg/ m3. Las características de esta cepa son: max = 0.35 1/hr Ks = 0.15 kg/ m3

Y x/s = 0.23 kg biomasa/kg sustrato ms = 0.135 kg/kg hr (coeficiente de mantención)

Al cabo de 6 horas de operación el volumen de líquido en el bio-reactor es de 40 m 3. Determine la cantidad de biomasa y sustrato en el biorreactor al cabo de 6 horas de operación. Nota: Considere que la concentración inicial de biomasa es despreciable. Indique todos los supuestos aplicados SOLUCIÓN Biomasa a las 6 horas X = x* V = x*40 [kg] Balance de Biomasa para Fed batch F*xo + x*V – kd*x*V = dx*V/dt = x*dV/dt +V*dx/dt Supuestos:

-No hay biomasa en la entrada - dV/dt = F - Estado cuasi-estacionario, dx/dt  0 - Muerte despreciable  kd x*V x*F  D = F/V

Evaluando a t = 6 horas  D = F/V = 4/40 = 0.1 hr –1 Balance de sustrato para Fed batch F*si –( Y x/s + qp/ Y p/s +ms)x*V = ds*V/dt = s*dV/dt +V*ds/dt Supuestos:

-

dV/dt = F Estado cuasi-estacionario, ds/dt  0 Formación de producto despreciable qp = 0 F*si - (Y x/s +ms)x*V = s*F D*( si- s) - (Y x/s +ms)x= 0

Suponiendo que s << si D* si = (Y x/s +ms)x D* si / (Y x/s +ms) = x = 0.1 *80 / (0.1/0.23 +0.135) = 14.04 [kg/m3] X = x* V = 14.04 * 40 = 561 [Kg] Determinación de Concentración de sustrato UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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D  = max * s/ (ks+s) s  ks * D / (max – D) s  0.15*0.1/(0.35-0.1) = 0.06 [Kg/m3]

Se cumple que s<<si

S = s*V = 0.06* 40 = 2.4 [Kg]

CAPÍTULO XI ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO POR LOTES Y CONTINUO

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La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Para ello es fundamental esterilizar los medios a trabajar. En las fermentaciones industriales se requiere de un alto grado de limpieza y asepsia. No existe un método cuantitativo seguro y confiable para medir el número o la concentración de contaminantes en el sistema. Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la destrucción completa de todas las unidades del lote de producto terminado, se define la esterilidad en términos probabilísticos, en donde la probabilidad de que una unidad de producto esté contaminada es aceptablemente remota. Se considera que un producto crítico es estéril cuando la probabilidad de que un microorganismo esté presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de esterilidad 10^6). Cabiendo resaltar que Esterilidad significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía. La razón fundamental para efectuar la esterilización es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos específicos.  Posibles elementos de contaminación en un proceso fermentativo: 1. El medio. 2. El inoculo y el proceso de inoculación. 3. El suministro de aire. 4. La adición de nutrientes, antiespumantes, etc. Durante el proceso. 5. El fermentador en sí.

Métodos de esterilización Se pueden clasificar en tres tipos según el efecto producido sobre los microorganismos: UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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1. Destrucción 2. Muerte o inactivación 3. Remoción física Los del segundo grupo son los más utilizados para medios de fermentación y se pueden dividir a su vez en a.- Calor húmedo b.- Fuentes de alta energía, (radiaciones ionizantes, UV, etc.): c.- Métodos químicas. De los nombrados, el calor húmedo es el más ampliamente usado y es además el más sencillo de controlar. El mayor problema que presenta su utilización es el cálculo del tiempo mínimo de calentamiento que asegure asepsia y que no produzca una desnaturalización de las sustancias que componen el medio de cultivo. Este tiempo depende del volumen de caldo y del tipo de equipo empleado, sobre todo de la relación volumen/área de intercambio de calor. Para independizarse de estas variables se utiliza un método que se basa en la evolución de las condiciones térmicas necesarias para destruir una determinada cantidad de microorganismos.

11.1. Esterilización de medios de cultivos por lote Este es el método más común para esterilización de medios de cultivo. El proceso más comúnmente utilizado a nivel planta piloto o nivel industrial es el proceso de esterilización por lote. Ya que el proceso de esterilización consiste en un ciclo compuesto por tres etapas como lo son; etapa de calentamiento, etapa de retención y la etapa de enfriamiento. El proceso por lote o batch consiste en pasar por estas tres etapas cierta cantidad de masa dentro de un recipiente el cual no tiene ni entrada ni salida de corriente, este proceso se lleva a cabo por un determinado tiempo a una temperatura que en este caso es 121°C.

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Los tiempos de esterilización aproximados pueden ser calculados a partir de la naturaleza del medio y del tamaño del fermentador. No solamente debe ser esterilizado el medio de cultivo, sino también las uniones, válvulas y electrodos del propio fermentador. Se necesitan de 2-3 horas para alcanzar la temperatura de esterilización de 121 ºC, lo que depende de la conducción del vapor y el tamaño del fermentador. Una vez alcanzado la temperatura se emplean otros 20-60min. Para el proceso real de muerte, seguidos del enfriamiento durante 1hora.Las fases de enfriamientos calor y enfriamiento no solo matan a los microorganismos, sino que también alteran severamente la solución de nutrientes. Las vitaminas se destruyen y la calidad del medio de cultivo se deteriora. El proceso de esterilización puede llevarse a cabo de diferentes formas como pueden ser:

 Indirecta: alrededor del fermentador, con lo que se calienta este. Inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines interiores.  Directa: inyectar el vapor de agua en el interior del fermentador, es la peor porque se altera la composición del medio, hay que usar vapor de agua puro sin aditivos que son tóxicos y se quedan en el medio de cultivo y al inocular el microorganismo no va a crecer.

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Figura 31. Fermentador de medio de cultivo por lote

VENTAJAS -

Un reactor podrá ser utilizado para varios fermentadores así el medio esterilizado y el fermentador limpiado y preparado para la siguiente

-

fermentación, ahorrando tiempo entre fermentaciones. El medio puede de cultivo puede ser esterilizado en mayor concentración del que podría ser usado en la fermentación y después diluirlo en el fermentador con

-

agua previamente esterilizada. Durante la esterilización al medio de cultivo se encuentra muy viscoso, en este caso los fermentadores solo contarían con la aereación sin necesidad de

-

agitadores ahorrándose así energía y dinero. Se evita la corrosión de los fermentadores, las cuales ocurren con medios a altas temperaturas.

DESVENTAJAS -

El costo de construcción de un esterilizador batch es alto casi el mismo que para

-

el fermentador. Cualquier falla podría parar el proceso temporalmente.

Independientemente del método elegido existen ciertos criterios de esterilización para llevar a cabo este proceso como son:

1. Adición constante de flujo de calor a) Adición constante de masa al medio de cultivo.

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b) Sin adición de masa al medio de cultivo.

2. Variación de la de calor

cantidad adicionada

a) Fuente y penetración de calor isotérmicamente

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b) Fuente y penetración del calor no isotérmico

En la composición por lote usando agua caliente en la solución de ingredientes puede ahorrarse un tiempo considerable de calentamiento. 11.2. Esterilización de medios de cultivo continuo Las dos desventajas principales de la esterilización discontinua, daño al medio de cultivo y alto consumo de energía, pueden ser evitadas en gran parte mediante el uso de un procedimiento de esterilización continua. El método de esterilización continua ofrece una opción para llevar a cabo la esterilización del medio de cultivo con una menor destrucción de la calidad de los nutrientes y una menor formación de sustancias tóxicas en el medio de fermentación, dos inconvenientes que a menudo son asociados al proceso de esterilización batch. Además, la operación de fermentación del proceso continuo se basa en una alimentación de cultivo puro, suministrado continuamente del medio previamente esterilizado. Aunque la esterilización continua es la etapa preliminar lógica en una fermentación continua a escala industrial, también se puede utilizar en la fermentación discontinua obteniendo posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio asignados. La razón para esto se debe a la relación exponencial entre velocidad de muerte y temperatura, que hace más corto el tiempo necesario para la eliminación completa de los

organismos

vivos cuando se utiliza una temperatura más alta.

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Mientras la 2018

esterilización discontinua se lleva a cabo en 30-60minutos a 121° C, la esterilización continua se lleva a cabo normalmente en 30-120 segundos a 140° C. El calentamiento del medio de cultivo para la esterilización continua puede ser llevado a cabo mediante inyección de vapor o mediante intercambiadores de calor. La esterilización con inyección de vapor se hace inyectando vapor en la solución de nutrientes. La temperatura se eleva rápidamente a 140° C y se mantiene durante 30120segundos. Debido a la formación de condensados la solución nutritiva se diluye; para corregir esto la solución caliente

se

bombea

a

través

de

una válvula de expansión a un

vaporizador y el condensado se retira mediante bombas de vacío de forma que la solución esterilizada de nutrientes tiene la misma concentración después del proceso de enfriamiento que antes. La desventaja de este proceso es la sensibilidad que presenta a cambios en la viscosidad del medio y a variaciones en la presión. En el proceso continuo que utiliza intercambiadores de calor, la solución de nutrientes, en el primer intercambiador de calor, se pre calienta a 90-120° C durante 20-30 segundos por la solución nutritiva previamente esterilizada que sale. Luego, en el segundo intercambiador de calor, se calienta indirectamente con vapor a 140° C. Esta temperatura se mantiene durante 30-120 segundos en una tubería de mantenimiento antes de que sea colocada en el primer intercambiador mediante enfriamiento preliminar y posteriormente en un tercer cambiador para refrigeración a la temperatura del fermentador. La fase de enfriamiento es sólo de 20-30segundos.

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Figura 32. Diagrama esquemático de esterilización por flujo continuo En el proceso que utiliza intercambiadores de calor el 90% del aporte de energía se recupera. La desventaja de este método es que con algunas soluciones de nutrientes se forman sales insolubles (p. ej. Fosfato cálcico u oxalato cálcico) y aparecen incrustaciones en el primer intercambiador de calor debido a las diferencias de temperatura entre la solución de nutrientes esterilizada y la solución fría que entra. Si se produce una precipitación, el coeficiente de transferencia de calor disminuye por lo que el sistema se debe detener y tratar con agentes que limpian (ácido o base)y re-esterilizarlo. Esterilizando separadamente los componentes críticos de la solución de nutrientes se mantiene constante el coeficiente de transferencia de calor por lo que el período útil puede extenderse durante semanas. Las soluciones que contienen almidón, que se hacen viscosas cuando se calientan, son difíciles de utilizar en procesos de esterilización continua. Antes de la esterilización real debe llevarse a cabo una licuefación e hidrólisis parcial mediante ácidos o amilasas. Además, si hay partículas en suspensión en la solución de nutrientes, los cortos tiempos de esterilización en el proceso continuo pueden ser insuficientes para que el calor permanezca completamente a través de ellas. El tiempo de calentamiento para partículas de 1 mm es de 1 segundo; para partículas de 1cm es de 100 segundos. Por consiguiente el tamaño de las partículas debería estar restringido a 1-2 mm en procesos continuos de esterilización.

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Existen dos sistemas de esterilización continua las cuales pueden ser usados para el tratamiento de esterilización en el proceso de fermentación.

 INTERCAMBIADOR DE CALOR CONTINUO DE PLATO El intercambiador de calor continuo de plato ilustrado en la Figura 33, consiste en una serie de platos calentados con vapor a contracorriente con el medio, aumentando la temperatura al nivel deseado. El medio se mantiene a esta temperatura por un periodo de tiempo al pasar por el tubo de retención y después es enfriado a la temperatura de fermentación al pasar de nuevo por los platos, cediendo calor el precalentador al medio inesteril y al agua de enfriamiento.

Figura 33. Diagrama de flujo de un proceso de esterilización continua, usando intercambiador de tipo plato.



INYECTOR DE VAPOR Y ENFRIAMIENTO RAPIDO

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Como se muestra en la figura 34, el sistema de esterilización continua basado en el inyector de vapor el cual inyecta el vapor al medio inesteril, de una sección de retención que mantiene al medio a una temperatura por un cierto tiempo, y de un periodo de

enfriamiento rápido donde el medio caliente es pasado a través de una válvula de expansión a una cámara de vacío. Figura 34. . Diagrama de flujo de un proceso de esterilización continua, el cual consta de un inyector de vapor y cámara de expansión.

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CAPITULO XII CINÉTICA ENZIMÁTICA 12.1.

ENZIMAS 12.1.1. Estructuras y mecanismos

Las enzimas son generalmente proteínas globulares que pueden presentar tamaños muy variables, desde 62 aminoácidos como en el caso del monómero de la 4-oxalocrotonato tautomerasa, hasta los 2.500 presentes en la sintasa de ácidos grasos. Las actividades de las enzimas vienen determinadas por su estructura tridimensional, la cual viene a su vez determinada por la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, aunque la estructura determina la función, predecir una nueva actividad enzimática basándose únicamente en la estructura de una proteína es muy difícil, y un problema aún no resuelto. Casi todas las enzimas son mucho más grandes que los sustratos sobre los que actúan, y solo una pequeña parte de la enzima (alrededor de 3 a 4 aminoácidos) está directamente involucrada en la catálisis. La región que contiene estos residuos encargados de catalizar la reacción es denominada centro activo. Las enzimas también pueden contener sitios con la capacidad de unir cofactores, necesarios a veces en el proceso de catálisis, o de unir pequeñas moléculas, como los sustratos o productos (directos o indirectos) de la reacción catalizada. Estas uniones de la enzima con sus propios sustratos o productos pueden incrementar o disminuir la actividad enzimática, dando lugar así a una regulación por retroalimentación positiva o negativa, según el caso. Al igual que las demás proteínas, las enzimas se componen de una cadena lineal de aminoácidos que se pliegan durante el proceso de traducción para dar lugar a una estructura terciaria tridimensional de la enzima, susceptible de presentar actividad. Cada secuencia de aminoácidos es única y por tanto da lugar a una estructura única, con propiedades únicas. En ocasiones, proteínas individuales pueden unirse a otras proteínas para formar complejos, en lo que se denomina estructura cuaternaria de las proteínas. La mayoría de las enzimas, al igual que el resto de las proteínas, pueden ser desnaturalizadas si se ven sometidas a agentes desnaturalizantes como el calor, los pHs extremos o ciertos compuestos como el SDS. Estos agentes destruyen la estructura UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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terciaria de las proteínas de forma reversible o irreversible, dependiendo de la enzima y de la condición.

Figura 35. Diagrama de cintas que representa la estructura de una anhidrasa carbónica de tipo II.

12.1.2.

Especificidad

Las enzimas suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan como del sustrato involucrado en la reacción. La forma, la carga y las características hidrofílicas/hidrofóbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas también pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectivida, (Eggert T, 2004). Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisión en su actividad son aquellas involucrados en la replicación y expresión del genoma. Estas enzimas tienen eficientes sistemas de comprobación y corrección de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que cataliza una reacción de replicación en un primer paso, para comprobar posteriormente si el producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado una media de tasa de error increíblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de reacciones en determinadas polimerasas de mamíferos. Este tipo de mecanismos de comprobación también han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa y en la actividad de selección de los aminoacil-tRNAs. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia especificidad de sustrato podría ser clave en la evolución y diseño de nuevas rutas biosintéticas.

 Modelo de la "llave-cerradura" Las enzimas son muy específicas, como sugirió Emil Fisher en 1894. En base a sus resultados dedujo que ambas moléculas, enzima y sustrato, poseen complementariedad geométrica, es decir, sus estructuras encajan exactamente una en la otra, por lo que ha sido denominado como modelo de la "llave-cerradura", refiriéndose a la enzima como a una especie de cerradura y al sustrato como a una llave que encaja de forma perfecta en dicha cerradura. Sin embargo, si bien este modelo explica la especificidad de las enzimas, falla al intentar explicar la estabilización del estado de transición que logran adquirir las enzimas.  Modelo del encaje inducido Diagrama que esquematiza el modo de acción del modelo del encaje inducido. En 1958 Daniel Koshland sugiere una modificación al modelo de la llave-cerradura: las enzimas son estructuras bastante flexibles y así el sitio activo podría cambiar su conformación estructural por la interacción con el sustrato. Como resultado de ello, la cadena aminoacídica que compone el sitio activo es moldeada en posiciones precisas, lo que permite a la enzima llevar a cabo su función catalítica. En algunos casos, como en las glicosidasas, el sustrato cambia ligeramente de forma para entrar en el sitio activo. El sitio activo continua dicho cambio hasta que el sustrato está completamente unido, momento en el cual queda determinada la forma y la carga final (Boyer, 2002).

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Figura 36. Diagrama que esquematiza el modo de acción del modelo del encaje inducido

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12.2.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

La cinética enzimática es el estudio de cómo las enzimas se unen a sus sustratos y los transforman en productos. Los datos de equilibrios utilizados en los estudios cinéticos son obtenidos mediante ensayos enzimáticos. En 1902, Victor Henri propuso una teoría cuantitativa sobre la cinética enzimática, pero sus datos experimentales no fueron muy útiles debido a que la importancia de la concentración del ion de hidrógeno aún no era considerada. Después de que Peter Lauritz Sørensen definiera la escala logarítmica del pH e introdujera el concepto de "tampón" (buffer) en 1909, el químico alemán Leonor Michaelis y su postdoctoral canadiense Maud Leonora Menten repitieron los experimentos de Henri confirmando su ecuación, que actualmente es conocida como cinética de Henri-Michaelis-Menten (o simplemente cinética de Michaelis-Menten). Su trabajo fue desarrollado más en profundidad por George Edward Briggs y J. B. S. Haldane, quienes obtuvieron las ecuaciones cinéticas que se encuentran tan ampliamente extendidas en la actualidad.

Figura 3: Mecanismo para una reacción catalizada por una enzima con un único sustrato. La enzima (E) une un sustrato (S) y genera un producto (P) La mayor contribución de Henri fue la idea de dividir las reacciones enzimáticas en dos etapas. En la primera, el sustrato se une reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato (también denominado complejo Michaelis). En la segunda, la enzima cataliza la reacción y libera el producto. Las enzimas pueden catalizar hasta varios millones de reacciones por segundo. Por ejemplo, la descarboxilación no enzimática de la orotidina 5'-monofosfato tiene una vida media de 78 millones de años. Sin embargo, cuando la enzima orotidina 5'-fosfato descarboxilasa está presente en el medio, ese mismo proceso tarda apenas 25 milisegundos. Las velocidades de las enzimas dependen de las condiciones de la UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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solución y de la concentración de sustrato. Aquellas condiciones que desnaturalizan una proteína, como temperaturas elevadas, pHs extremos o altas concentraciones de sal, dificultan o impiden la actividad enzimática, mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la actividad. Para encontrar la máxima velocidad de una reacción enzimática, la concentración de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formación de producto (véase la curva de saturación representada en la figura de la derecha). La saturación ocurre porque, cuando la concentración de sustrato aumenta, disminuye la concentración de enzima libre, que se convierte en la forma con sustrato unido (ES). A la máxima velocidad (V max ) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima. Sin embargo, V max es sólo una de las constantes cinéticas de la enzima. La cantidad de sustrato necesario para obtener una determinada velocidad de reacción también es importante. Este parámetro viene dado por la constante de Michaelis-Menten (K m ), que viene a ser la concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima. Cada enzima tiene un valor de K m característico para un determinado sustrato, el cual puede decirnos cómo de afín es la unión entre el sustrato y la enzima. Otra constante útil es k cat , que es el número de moléculas de sustrato procesadas por cada sitio activo por segundo. La eficiencia de una enzima puede ser expresada en términos de k cat /K m , en lo que se denomina constante de especificidad, que incorpora la constante de velocidad de todas las fases de la reacción. Debido a que la constante de especificidad contempla tanto la afinidad como la capacidad catalítica, es un parámetro muy útil para comparar diferentes enzimas o la misma enzima con diferentes sustratos. El valor máximo teórico de la constante de especificidad es denominado límite de difusión tiene un valor de 108 -109 (M-1 s -1). Llegados a este punto, cada colisión de la enzima con su sustrato da lugar a la catálisis, con lo que la velocidad de formación de producto no se ve limitada por la velocidad de reacción, sino por la velocidad de difusión. Las enzimas que poseen esta propiedad son llamadas enzimas catalíticamente perfectas o cinéticamente perfectas. Ejemplos de este tipo de enzimas son la triosa fosfato isomerasa, la anhidrasa

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carbónica, la acetilcolinesterasa, la catalasa, la fumarasa, la beta-lactamasa y la superóxido dismutasa. La cinética de Michaelis-Menten depende de la ley de acción de masas, que se deriva partiendo de los supuestos de difusión libre y colisión al azar. Sin embargo, muchos procesos bioquímicos o celulares se desvían significativamente de estas condiciones, a causa de fenómenos como el crowding macromolecular, la separación de etapas entre enzima-sustrato-producto, o los movimientos moleculares uni- o bidimensionales. No obstante, en estas situaciones se puede aplicar una cinética de Michaelis-Menten fractal. Algunas enzimas presentan una cinética más rápida que la velocidad de difusión, lo que en principio parecería ser imposible. Se han propuesto diversos mecanismos para tratar de explicar este fenómeno. Uno de los modelos propone que algunas proteínas podrían tener la capacidad de acelerar la catálisis secuestrando el sustrato y orientándolo mediante campos eléctricos dipolares. Otro modelo propone un mecanismo de efecto túnel cuántico, donde un protón o un electrón pueden formar un túnel a través de barreras de activación, aunque existe cierta controversia en cuanto al efecto túnel que pueda generar un protón. El efecto túnel mediado por protones ha sido observado en triptamina. Esto sugiere que la catálisis enzimática podría ser definida más exactamente como una "barrera", en lugar de como hace el modelo tradicional, donde el sustrato requiere a la enzima para alcanzar una barrera energética más baja.

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Figura 37. Curva de saturación de una reacción enzimática donde se muestra la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

12.3. a.

FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Concentración de Enzima:

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El primer objetivo que debe cumplirse en la caracterización de una enzima es asegurarnos que existe una relación lineal entre la concentración de enzima presente en una muestra y la velocidad de la reacción catalizada por la misma, a una concentración de sustrato dada. Esta relación lineal entre concentración de enzima y velocidad inicial

se observa en el gráfico hasta llegar a una concentración de enzima tal que el sustrato comienza a transformarse en reactivo limitante y se pierde la proporcionalidad. Figura 38. Comportamiento de la cantidad de enzima en función del tiempo de incubación.

La siguiente figura muestra el comportamiento de la cantidad de producto formado en función del tiempo de incubación. Además, se muestran varias curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzimas en órdenes crecientes desde E1 a E4. Todas estas curvas muestran que a tiempos cortos la velocidad de la reacción es igual a la velocidad inicial. A tiempos largos, la cantidad de producto formada se mantiene constante, es decir, se llegó al equilibrio. b.

Tiempo de incubación:

Inicialmente existe un estado pre-estacionario, período muy corto en donde se observa un aumento de la concentración de ES. Un estado estacionario donde ES se mantiene constante con el tiempo. Finalmente, un estado de equilibrio donde la velocidad de interconversión entre S y P se hace constante. Por lo tanto, la siguiente consigna es determinar el tiempo de incubación de la reacción durante el cual nos encontramos en UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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condiciones de velocidad inicial. Si bien este tiempo debería coincidir con el tiempo correspondiente al del estado estacionario, en la práctica es más corto debido a otras variables, como por ejemplo la inestabilidad térmica de la enzima o el incumplimiento de la ley de Lambert – Beer cuando se usa un método espectrofotométrico.

Figura 39. Variaciones de las concentraciones de S, P, E y ES con el tiempo.

c. Efecto del pH. La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos (Figura 40). De ahí la conocida importancia biológica de los sistemas tampón. En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH del medio en el que habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por último existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto.

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Figura 40. Representación de las curvas según el efecto del pH.

d.

Efecto de la temperatura.

Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variación de la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en función de la barrera de energía de activación de la reacción catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones químicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. Si representamos gráficamente la variación de la actividad de los enzimas en función de la temperatura (ver Figura) da la impresión de que existe una temperatura "óptima" análoga al pH óptimo; hay que resaltar que esa aparente temperatura óptima no es más UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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que el resultado de dos procesos contrapuestos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura y 2) la desnaturalización térmica del enzima.

Figura 41. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

12.4.

INHIBIDORES

Los inhibidores son moléculas que regulan la actividad enzimática, inhibiendo su actividad. A grandes rasgos, pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad de revertir la modificación, siendo útiles en farmacología. Algunos de los fármacos que actúan de este UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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modo son la eflornitina, utilizada para tratar la tripanosomiasis africana, la penicilina y la aspirina. Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima, pudiendo clasificarse a su vez, según la forma en que intervienen en la reacción, en competitivas, acompetitivas y mixtas. Habitualmente, por su amplia presencia en multitud de procesos, se habla también de inhibición no competitiva, que en realidad no es más que una variante de la ya mencionada inhibición mixta. Sin embargo, por sus características se suele presentar como opuesta a la competitiva, con la que es comparada frecuentemente.  En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el cual también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Por ejemplo, el metotrexato es un inhibidor competitivo de la enzima dihidrofolato reductasa, que cataliza la reducción de dihidrofolato a tetrahidrofolato. La similitud entre las estructuras del ácido fólico y el metotrexato permite que se establezca una inhibición de tipo competitivo. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. En la inhibición competitiva la velocidad máxima de la reacción no varía, pero se necesitan concentraciones más elevadas de sustrato para alcanzar una determinada velocidad, incrementándose así la Km aparente.  En la inhibición acompetitiva, el inhibidor no puede unirse a la enzima libre, sino únicamente al complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo con el inhibidor (EIS) la enzima queda inactiva. Este tipo de inhibición es poco común, pero puede darse en enzimas multiméticas.  La inhibición no competitiva, es una forma de inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la concentración de inhibidor, independientemente de la concentración de sustrato, con lo que varía el valor de la Vmax aparente. Sin embargo, como el sustrato aún puede unirse a la enzima, el valor de Km no varía. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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 En la inhibición mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibición resulta generalmente de un efecto alostérico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unión del inhibidor con el sitio alostérico cambia la conformación (es decir, la estructura terciaria) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. En muchos organismos, los inhibidores pueden actuar como parte de un mecanismo de realimentación. Si una enzima produce una sustancia en demasiada cantidad en el organismo, esta misma sustancia podría actuar como un inhibidor de la enzima al inicio de la ruta que lo produce, deteniendo así dicha producción cuando haya una cantidad suficiente de la sustancia en cuestión. Este sería una forma de realimentación negativa. Las enzimas que se encuentran sujetas a este tipo de regulación suelen ser multiméricas y poseer sitios alostéricos donde se unen sustancias reguladoras.

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Figura 42. Tipos de inhibición según la clasificación introducida por W. W. Cleland.

12.5.

COFACTORES ENZIMÁTICOS.

Algunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad catalítica de la concurrencia de una o más sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimática sino que, en determinados enzimas, son absolutamente imprescindibles para que ésta se realice. En ausencia de cofactor el enzima resulta catalíticamente inactivo y recibe el nombre de apoenzima; la combinación de apoenzima y cofactor da el holoenzima catalíticamente activo. Existen dos tipos de cofactores enzimáticos: los iones metálicos y las coenzimas. Los iones metálicos que actúan como cofactores enzimáticos son generalmente cationes mono o divalentes. Pueden actuar de varias maneras: 1) En algunos enzimas el ion metálico constituye el verdadero centro catalítico; en estos casos el ion suele presentar por sí solo una cierta actividad catalítica, que se ve incrementada cuando forma parte UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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del enzima. 2) En otros enzimas el ion metálico constituye un grupo puente para unir el sustrato al centro activo. 3) A veces el ion metálico no forma parte del centro activo sino que se encuentra en un lugar del enzima muy alejado del mismo, actuando como agente estabilizador de la conformación nativa del enzima. Cuando el cofactor es una sustancia orgánica de naturaleza no proteica recibe el nombre

de coenzima.

Las

coenzimas

actúan

generalmente

como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de determinados átomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reacción enzimática global. A veces las coenzimas se hallan íntimamente unidos a la molécula proteica constituyendo un verdadero grupo prostético. En otros casos la unión es débil y la coenzima actúa en realidad como si de un sustrato más del enzima se tratase. Cuando se analiza la estructura química de muchas coenzimas se comprueba que tienen formando parte de ella a alguna de las sustancias conocidas como vitaminas. Existe pues una clara relación entre vitaminas y coenzimas.

CAPÍTULO XIII DISEÑO DEL REACTOR. CÁLCULOS DEL DISEÑO UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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13.1

Diseño del reactor

Una de las tareas del ingeniero cuando está frente a una serie de operaciones que transforman ciertos insumos o materias primas mediante procesos físicos y químicos consiste en el dimensionamiento de los equipos correspondientes. En los casos en que se dan transformaciones químicas (o bioquímicas) de la materia, el corazón del proceso se da en el reactor químico. Para diseñar un reactor debe contestarse una serie de preguntas tales como: ¿qué tipo de equipo se necesita para lograr la extensión de la reacción requerida? ¿qué condiciones de operación (temperaturas, presión, velocidades de flujo) se necesitan? La respuesta a estas cuestiones constituye el diseño del proceso del reactor. El análisis de costos para determinar el diseño más rentable introduce nuevos factores tales como los materiales de construcción, la prevención de la corrosión, los requerimientos de operación y mantenimiento, etc. Para optimizar los costos deberá tenerse en cuenta además la instrumentación y mecanismos de control. Más factores pueden seguir introduciéndose antes de llegar a la decisión final. No obstante en este curso nos restringiremos exclusivamente al diseño del proceso. La combinación de los procesos físicos y químicos a los efectos del diseño del reactor se hace recurriendo a las ecuaciones de las leyes de conservación de la materia y la energía para cada tipo de reactor. Para el diseño del proceso debe disponerse de información proveniente de diferentes campos: termodinámica, cinética química, mecánica de fluidos, transmisión de calor y transporte de materia. Cuando una sustancia se transforma en otra por reordenación o redistribución de los átomos para formar nuevas moléculas decimos que se ha efectuado una reacción química. La termodinámica química suministra dos fuentes importantes de información necesarias para el diseño: el calor desprendido o absorbido durante una reacción y la extensión máxima posible de la misma. Las reacciones químicas van siempre acompañadas de liberación o absorción de calor, que se mide por el cambio de entalpía (H). Por ejemplo, para la reacción aA  rR + sS el calor de reacción (H) a la temperatura T es el calor transferido desde los alrededores al sistema reaccionante cuando a moles de A desaparecen para formar r moles de R y s UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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moles de S, suponiendo el sistema a la misma temperatura y presión antes y después de la reacción. Si H > 0 , la reacción es endotérmica, absorbe calor; si H < 0 , la reacción es exotérmica, desprende calor. En general los efectos de la generación o absorción de calor no serán tenidos en cuenta en este curso, trabajándose en condiciones isotérmicas. La cinética química trata principalmente del estudio de la velocidad con que ocurre una reacción química, considerando los factores que influyen sobre ella y explicando la causa de la magnitud de esa velocidad de reacción. Este estudio es de primordial importancia pues una reacción puede ser termodinámicamente favorable pero su velocidad tan baja que a los efectos prácticos no ocurre. En el otro extremo, una reacción puede tener una velocidad tan elevada que entre en la categoría de las reacciones explosivas. Hay muchas maneras de clasificar las reacciones químicas. A nuestros efectos puede resultar adecuado dividirlas según el número de fases implicadas: sistemas homogéneos (una sola fase) y heterogéneos (se requiere más de una fase para que la reacción tenga lugar). Muchas veces esta distinción no es tajante. Otra clasificación posible es dividirlas entre catalizadas o no catalizadas. Un catalizador es una sustancia que, sin ser ni reactante ni producto, interviene en la transformación química y resulta incambiada con la reacción, pero modifica la velocidad de reacción. Los catalizadores pueden ser inorgánicos como por ejemplo los utilizados en la refinación del petróleo, pero también pueden ser biológicos, por ejemplo, las enzimas de las reacciones bioquímicas. La velocidad de una reacción química puede estar afectada por diversas variables. En los sistemas homogéneos las variables son la temperatura, la presión y la composición. En los sistemas heterogéneos hay que tener en cuenta además el pasaje de materia de una fase a otra y eventualmente la transferencia del calor generado por la reacción. En todos los casos si la reacción global consta de varias etapas en serie, la etapa más lenta de la serie es la que ejerce más influencia y se denomina etapa controlante.

13.1 Reactores ideales

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Cuando se va a llevar a cabo un determinado proceso que implica una reacción química (o bioquímica) además de conocerse la cinética debe determinarse el tipo y tamaño del reactor y las condiciones de operación más adecuadas para el fin propuesto. Los equipos en los que se efectúan reacciones homogéneas pueden ser de tres tipos generales: discontinuos (bacth), continuos de flujo estacionario, y semicontinuos de flujo no estacionario Los reactores discontinuos son sencillos de operar e industrialmente se utilizan cuando se han de tratar pequeñas cantidades de sustancias. Los reactores continuos son ideales para fines industriales cuando han de tratarse grandes cantidades de sustancia y permiten obtener un buen control de la calidad del producto. Los reactores semicontinuos son sistemas más flexibles, pero de más difícil análisis y operación que los anteriores; en ellos la velocidad de la reacción puede controlarse con una buena estrategia de agregado de los reactantes. El punto de partida para el diseño de un reactor es un balance de materia referido a determinado reactante (o producto), que se realiza sobre determinado volumen de control.

En las operaciones no isotérmicas debe agregarse también el balance de energía, que está relacionado con el anterior por el término de reacción química, ya que el calor generado o absorbido es proporcional a la extensión de la reacción. No obstante, para el presente curso estos aspectos no serán tomados en consideración, asumiéndose que se trabaja en condiciones isotérmicas.

13.2 REACTOR CONTINÚO AGITADO IDEAL UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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El reactor continúo agitado ideal (RCAI) o reactor de mezcla completa supone un flujo de alimentación y salida uniformes y una agitación perfecta, esto es, en todos los puntos del reactor la composición y propiedades físicas del fluido son iguales. Por esta misma razón la corriente de salida tiene la misma composición y propiedades que el fluido que se encuentra en el interior del reactor. La operación del RCAI se realiza en condiciones de estado estacionario, esto es, no hay acumulación dentro del reactor. En esas condiciones desaparece el término de dependencia con la variable tiempo. Lógicamente, en el arranque del reactor o cuando suceden perturbaciones que modifican las condiciones de trabajo, es necesario tener en cuenta ese término y entonces se habla de estado transitorio. Como todos los puntos del reactor tienen igual composición y propiedades el volumen de control para realizar el balance de masa es todo el reactor; en estado estacionario queda entonces

Entrada = Salida + Desaparición por reacción

Si se trata de un fluido que no sufre expansión ni compresión FA = v . CA y puede sustituirse en la expresión anterior. Suele definirse además el parámetro  = V/vo , a veces denominado tiempo espacial (y también tiempo de residencia hidráulico), donde V es el volumen de reacción y vo el flujo volumétrico a la entrada, y que en los sistemas que estamos considerando coincide con el tiempo de residencia hidráulico. Por lo tanto, la ecuación de diseño del RCAI puede escribirse como (1)

13.3 REACTOR TUBULAR FLUJO PISTÓN

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El reactor tubular de flujo en pistón (RTFP) se caracteriza porque el flujo de fluido a su través es ordenado, sin que ningún elemento del mismo sobrepase o se mezcle con cualquier otro elemento situado antes o después de aquel, esto es, no hay mezcla en la dirección de flujo (dirección axial). Como consecuencia, todos los elementos de fluido tienen el mismo tiempo de residencia dentro del reactor. Como en el caso anterior estudiaremos este reactor en estado estacionario, o sea que el término de acumulación desaparece en el balance. Como la composición del fluido varía a lo largo del reactor el balance de materia debe realizarse en un elemento diferencial de volumen transversal a la dirección de flujo.

Entrada = Salida + Desaparición por reacción (1)

Teniendo en cuenta que: (2)

Que integrada queda (3)

o bien UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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(4)

13.4

REACTOR TUBULAR CON RECICLO

En algunos casos es conveniente dividir la corriente de salida de un reactor en flujo pistón haciendo retornar parte de ella a la entrada del reactor.

Definimos la relación de recirculación:

(1)

Planteando la ecuación de diseño para el reactor (dentro del lazo de reciclo) (2)

Si se considera que no hay expansión ni contracción en el reactor, planteando un balance en el punto de unión de la entrada y el reciclo, v1 = (R + 1) vo y además CA1 = (CAo + CAf) / (R + 1) , por lo que la ecuación de diseño del reactor queda:

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(3)

Obsérvese que si R = 0 queda la ecuación del RTFP y si R tiende a infinito la expresión tiende a la del RCAI. Por lo tanto, con un reactor tubular con reciclo se puede obtener un comportamiento intermedio entre ambos tipos de reactores ideales.

CAPÍTULO XIV

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APLICACIONES ACTUALES DE LAS ENZIMAS MICROBIANAS

14.1

Enzimas catalíticas

14.1.1 Amilolíticas; degradación de almidón Son enzimas microbianas responsables de la degradación de almidón, han sido ampliamente utilizadas en los diferentes procesos industriales; es así como, dichas enzimas se emplean en la producción de jarabes, dextrinas, edulcorantes y en la panadería (Fennema et al. 2010). 14.1.1.1

α- Amilasas

Es una endoenzima responsable de reducir rápidamente el peso molecular de los polímeros de almidón, es utilizado para el procesado de almidón y se caracteriza por tener tres dominios en el interior de la proteína; el primero le sirve para la catálisis, el segundo como sitio de unión del almidón y el tercero une el calcio y une los anteriores dominios. Su tamaño oscila entre 50 a 70 kDa; el producto final son dextrinas ramificadas (Fennema et al. 2010).

14.1.1.2

β- Amilasas

Es una glicosidasa de tipo exo e inversor responsable de liberar unidades de maltosa de las cadenas de amilasa y mezclarlas con dextrinas β límite, su tamaño es de 30 y 160 kDa. Son enzimas únicas ya que poseen un solo dominio a diferencia de las demás enzimas (Fennema et al. 2010).

14.1.1.3

Ciclomaltodextrina glucanotransferasa

Estas son endoenzimas que se encargan de catalizar reacciones de hidrólisis o de transglicosilación inter e intra moleculares, de tipo conservador con cinco dominios UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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proteicos y tamaño alrededor de los 75 kDa. Como producto final de su reacción se producen ciclodextrinas hexa, hepta u octoligómeros (Fennema et al. 2010). 14.1.1.4 Glucoamilasa La glucoamilasa o amiloglucosidad es una enzima de tipo exo, de inversión encargada en la hidrólisis de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor del almidón, este, a diferencia de la pululanasa actúa solo sobre el enlace α-1,4 glucosídico, produciendo tan solo glucosa. Su tamaño oscila entre los 37 y 112 kDa y se las puede encontrar principalmente en Aspergillus y Rhizopus (Fennema et al. 2010).

14.1.1.5 Pululanasa Son enzimas desramificadoras o dextrinasas límite ya que hidrolizan dextrinas en los enlaces α-1,4 y α-1,6 que forman parte de la ramificación de la amilopectina; se caracterizan por actuar sobre el pululano y como producto final se obtiene glucooligosacáridos pequeños. Dichas enzimas se obtienen particularmente de Kleibsiella y Bacillus (Fennema et al. 2010).

14.1.2 Proteasas; degradación de proteínas Son usadas para quitar restos biológicos de la ropa, varios detergentes añaden en su fórmula enzimas como proteasas. Estas enzimas poseen estabilidad en condiciones de lavado que incluyen la presencia de varios agentes oxidantes, surfactantes y en algunos casos altas temperaturas. Las Proteasas pueden clasificarse convenientemente según sus actividades y grupos funcionales.

14.1.2.1 Serina-proteasas Son endopeptidasas que poseen serina reactivo y pH optimo a 7.

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14.1.2.2 Subtilisina La subtilisina es una enzima que posee actividad proteasas, es decir, elimina proteínas. Al ser obtenida de Bacillus subtilis, esta enzima posee un aminoácido metionina que es apto para ser oxidada, pero también disminuye la actividad catalítica. (Martínez y García, 2014).

14.1.2.3 Carboxipeptidasa A Carboxipeptidasa A del páncreas de bovino, ayuda en la eliminación de aminoácidos C que proceden de sustratos polipéptidos tales como la fenilamina (Antigua, 2014).

14.1.3 Lipasas; degradación de grasas Las enzimas procedentes de las lipasas catalizan el hidrolisis para digregar lípidos en productos de origen vegetal y animal (Thieman y Palladino, 2010).

14.1.3.1

Fenoloxidasas

Estas enzimas son dependientes de actividad oxidativa de microorganismos. En la formación de humus se polimerizan fácilmente, además, son excelentes biocatalizadores en la fase de oxidación de quinonas. Sin embargo, existen casos como Phanerochaete chrysosporium que proporcionan parte de la degradación de compuestos clorados (Sanchez et al., 2011).

14.1.4 Lactasas; degradación de la leche Algunos tipos de quesos requieren de cepas de origen bacteriano tales como Lactococcus lactis, L. acidophilus para realizar procesos de coagulación. Estas bacterias degradan una proteína conocida como caseína y usan la enzima lactasa para eliminar los UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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azucares de que se encuentran en la leche, que a menudo son empleadas para realizar la fermentación (Thieman y Palladino, 2010). En la producción de quesos encontramos una enzima proteolítica conocida como quimosina, se obtiene a partir del abomaso de las vacas jóvenes (Moral, Ramírez & García, 2015). Además, en la fabricación de quesos industriales una de las enzimas más utilizadas es la proteinasa, obtenida a partir de Rhizomucor sp que es parecida a la quimosina. Esta enzimas es termoresistente y termolábil por lo que se rompe en su etapa de calentamiento (Morillo et al., 2015). Se usan porque estas enzimas poseen altos grados de especificidad, además sus periodos de crecimiento microbiano son cortos (Khademi, Abachi y Malekzadeh, 2013). Gran parte de las enzimas coagulantes son de origen fúngica tales como Thermomucor indicae-seudaticae, Mucor circinelloides y Rhizomucor nainitalensis (Morillo et al., 2015).

14.1.5 Celulasas y hemicelulasas; degradación de celulosa A la celulosa, en la naturaleza, la encontramos en forma de un polisacárido de fácil degradación para hongos y bacterias. Muchos hongos aeróbicos son los principales degradadores de celulosa tales como: Trichoderma reesei y Aspergillus niger. Además de Neurospora sp y algunos hongos para la alimentación (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). A partir de estos hongos se han obtenidos productos que poseen un sistema enzimático de células, las cuales degradan la celulosa a glucosa y celobiasa. Trichoderma reesei se caracteriza por degradar la celulosa, además, es resistente a reactores químicos e inhibidores de pH bajo. Además, los mecanismos de acción enzimática que muestra Trichoderma reesei determina modelos parecidos de regulación de genes (Gutiérrez, Moreno y Montoya, 2015). El potencial de las enzimas celulíticas, además, se centra en la producción de zumos de fruta, así como en la producción de cuero las cuales se derivan de Trichoderma reesei y Aspergillus niger que eliminan el pelo y la piel de tejidos y ablandar la indumentaria de vestir para un fácil manejo (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012).

14.2

Enzimas sintetizadoras

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14.2.1 Celulasas y hemicelulasas; en procesos de fermentación Dentro de la fermentación denotamos el uso de enzimas y procesos microbianos que tienen como objetivo el producir bebidas y productos como yogur, queso, pan y vino (Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015). Para la creación de vino y cerveza varias técnicas necesitan cepas de levaduras como es el caso de Saccharomyces cerevisae. En el caso de la fabricación de vino se utiliza enzimas celulasa derivadas de Oenococcus oeni una bacteria que es responsables de transformar el sabor agrio del ácido málico a un sabor dulce de ácido láctico. Para el yogur, se utilizan cepas de microrganismos anaerobios que proceden del ácido láctico, tal es el caso de Streptococcus thermopilus, Lactococcus lactis y una última cepa de Lactobacillus bulgaricus (Thieman y Palladino, 2010).

14.2.2 Penicilina acilasas; producción de penicilina. La penicilina fue el primer antibiótico utilizado a gran escala en humanos y fue descubierto de Penicillum notatum un hongo que impide el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus. La gran mayoría de los antibióticos se aíslan de bacterias, y la mayor parte de esta materia inhibe el crecimiento de otras bacterias. Además, en la actualidad tenemos antibióticos que derivan de bacterias o arqueas tales como Bacillus subtilus que se encuentra en el antibiótico Bacitracina o Streptomyces erythraeus que está en Eritromicina (Thieman y Palladino, 2010).

14.3

Enzimas termoestables

Son enzimas capaces de soportar incrementos de temperatura sin que lleguen a desnaturalizarse, existen algunos casos del uso de enzimas termoestables, pero hay demasiado uso por el momento, a pesar de las continuas investigaciones de las que objeto. La posibilidad de resistir incrementos de temperatura es ideal para reacciones que requieran de energía en forma de calor (Zapata, Castellanos, 2014). UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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14.3.1 Tac polimerasa Una de las primeras y más famosas enzimas para la PCR es conocida como Taq ADN polimerasa. Taq se obtiene de Thermus aquaticus, una especie que se desarrolla en fuentes de agua caliente, además su ADN polimerasa se transforma a tal punto que aguanta muy altas temperaturas. Como Taq es estable a altas temperaturas, puede tolerar los cambios de temperatura necesarios sin desnaturalizarse. Una de las ventajas del PCR es su capacidad para aumentar millones de copias de ADN partiendo de un pedazo muy pequeño de material vivo (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).

CAPITULO XIV

PERSPECTIVA FUTURAS DE LAS ENZIMAS MICROBIANAS 14.1 Búsqueda de enzimas lipolíticas termófilas

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Las investigaciones microbiológicas se ven cada vez más impulsadas por la diversidad de soluciones que los microorganismos proveen a numerosos escenarios, es por ello que en el futuro se vislumbra un sinfín de usos de microorganismos para resolver de manera satisfactoria y controlable los problemas que se presenten. Pero para lograr resolver los problemas primero es necesario contar con los medios necesarios. Las enzimas microbianas tienen una variedad enorme de usos, pero condiciones que limitan su uso y eficacia son factores físicos y químicos, tales como la elevada temperatura de reacción (Zapata, Castellanos, 2014). Es en base a esto que se busca usar microorganismos termófilos, por tener una alta estabilidad a altas temperaturas, pH extremos y agentes desnaturalizantes (López, 2015). En un estudio en la zona geotermal de Calientes, en el Perú, se llevó a cabo un muestreo en fuentes termales con temperaturas entre 60-88 ºC, un pH entre 7,1-7,5 (Zapata, Castellanos, 2014). Se usaron muestras de tapetes microbianos y biopelículas Se determinó la actividad cualitativa y cuantitativa de la celulasa, la biomasa celular, cuantificación de proteínas solubles y se extrajo el ADN. Se encontró un alto grado de heterogeneidad entre las poblaciones de las bacterias celulolíticas termófilos, se notó la actividad de la celulasa, con cepas que mostraron gran actividad de endoglucanasas, enzima que actúan en la degradación de la celulosa. Obtuvieron el valor óptimo de pH 5,9 y temperatura 67,5 °C, dando un valor maximizado de actividad enzimática de endoglucanasas de 0,56 UI ml (Zapata, Castellanos, 2014). Esta investigación arroja un resultado interesante para la biotecnología y la industria, tal como en las cepas obtenidas las “características fisicoquímicas son favorables para el desarrollo de microorganismos productores de celulasas (Zapata, Castellanos, 2014). Pudiendo ser usadas a la temperatura de 70 °C y pH neutro, que facilitan que bacterias esporógenas y actinomicetos incrementen su actividad (Granados, Valderrama, 2003). La diversidad de microorganismos que pueden ser usados por sus enzimas termófilas es bastante variado, en este caso podemos analizar la construcción de dos cepas productoras de enzimas lipoliticas de Thermus thermophilus, todo esto se hizo usando un sistema de expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae (López, 2015). Las enzimas usadas fueron la esterasa y la lipasa, la esterasa fue clonada y exhibió una actividad óptima a los 40ºC y un pH superior a 7, la producción de la cepa de levadura recombinante, Saccharomyces cerevisiae, fue 10 veces mayor en la actividad UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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extracelular a lo usual para Thermus thermophilus en el caso de la lipasa no se mostró actividad lipolítica en el medio extracelular, a pesar de que si mostro actividad fosfatasa superior al grupo de control (López, 2015). Si usamos el enfoque de enzimas microbianas que sean funcionales, podemos ligarnos al hecho de que estas pueden ser optimizadas. Es por ello que debemos conocer la posibilidad de optimizar enzimas, para ello analizaremos un experimento donde se buscó el mejoramiento de la termoestabilidad (Jofré, 2012). Tal como nos dice Jofré (2012) “Se diseñó una estrategia basada en la dinámica de la estructura enzimática que permite la proposición de mutaciones rigidizantes de regiones flexibles en la estructura de una enzima.”. En este experimento se simulo el comportamiento de la enzima a temperaturas de 27ºC, 77ºC y 127ºC (Jofré, 2012). A partir de esto se determinó la funcionalidad en diferentes enzimas, se encontraron 5 enzimas para una mutación que mejoraba la termoestabilidad (Jofré, 2012).

14.2

Microrganismos y la degradación de plaguicidas

Los impactos de los plaguicidas son bien conocidos, pero un tratamiento eficaz para su degradación o eliminación son bastante cuestionables, es por ello que los microrganismos son una respuesta eficaz para este problema. Gran cantidad de plaguicidas son usados actualmente, en este caso hablaremos de los plaguicidas Nmetilcarbamatos, usados para eliminar insectos, ácaros, nematodos, hongos y malezas en diferentes cultivos (Castellanos, Rache, 2013). Las enzimas carbamato hidrolasas pueden actuar sobre una gran cantidad de sustratos y en diferentes condiciones (Castellanos, Rache, 2013). En la investigación analizaron las enzimas carbamato hidrolasa, estas enzimas actúan el hidrolisis primario de carbofuran, aunque existen otras enzimas que actúan para que se complete la degradación, pero no se conocer aún, es por ello que el autor habla sobre el análisis de diferentes microrganismos para identificar las diferencias entre enzimas carbamato hidrolasas y su funcionamiento (Castellanos, Rache, 2013). Se reconocen 2 rutas para la degradación de los N-metilcarbamatos, una es la vía oxidante y la otra es la vía hidrolítica (Castellanos, Rache, 2013). Pero existe un gran UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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problema con la vía catabólica oxidante, ya que al darse el proceso se producen metabolitos que son aún más tóxicos que los N-metilcarbamatos; afortunadamente la hidrolisis es el mecanismo primario para la degradación de N-metilcarbamatos, cuando ocurre el hidrolisis del enlace carbamato se pueden dar dos resultados, el rompimiento del enlace éster o un rompimiento del enlace amida (Castellanos, Rache, 2013). Sea cual sea el resultado después del hidrolisis será carbofuran 7-fenol, el cual es menos toxico que el carbofuran, también metilamina la cual fuente de carbono o nitrógeno para cartas bacterias que hidrolizan suelos (Castellanos, Rache, 2013). Por ello no se puede estancar el uso de estas enzimas, puesto que generar degradadores de compuestos xenobióticos, solubilizadores de fosfato, fijadores de nitrógeno y controladores biológicos, entre otros toman un papel preponderante para ser usadas con interés agrícola, ambiental y para la salud humana (Castellanos, Rache, 2013)

14.3 Usos de enzimas celulolítica en la industria. La alimentación es extremadamente importante y su mejoramiento es transcendental para el ser humano, por ello analizaremos un uso de enzimas celulolítica en la industria pecuaria, ya que la alimentación en esta industria ocupa un enorme porcentaje de gastos, alrededor del 80 % (López, 2013). El uso de microrganismos que tengan enzimas celulolíticas es un apartado en esta industria que se encuentra fuera del foco por el momento, para este caso se los uso un microrganismo el cual produjo la enzima en un medio especifico con temperatura constante de 39ºC (López, 2013). Se puso a prueba la enzima colocándola 60 minutos antes en los alimentaos que iban a ser ingeridos por los individuos (López, 2013). Se usaron diferentes grupos, en los cuales había un grupo de control, alientos con enzimas, y alimentos sin enzimas. (López, 2013). Al analizar los metabolitos en la sangre se constató que la glucosa tenía mejores resultados, pero para los otros metabolitos (proteínas, queratina, colesterol, calcio y fósforo) no se obtuvieron estos resultados favorables. (López, 2013).

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XV.

CONCLUSIONES

En la descomposición de diversos sustratos que realizan los microorganismos mediante moléculas con actividad catalítica para obtener moléculas más simples; es importante comprender que ellas están teniendo un gran auge en el desarrollo de nuevos compuestos que pueden mejorar la calidad de vida de las personas desde el contexto cotidiano hasta procesos de seguimiento, mantenimiento y control de diversos estados clínicos.

Es

muy

importante

realizar

estudios

descriptivos

de

poblaciones

microorganismos unicelulares con eventual actividad de degradación de sustratos para UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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la eventual obtención de compuestos con potencial terapéutico como el xilitol. El desarrollo de estrategias para la producción o recuperación de compuestos derivados del metabolismo microbiano, cualquiera que sea su uso, es muy importante en el marco del paradigma del desarrollo sostenible, ya que se fortalece de tecnologías amigables con el medio ambiente y promueve el avance de nuevas tendencias desde el punto de vista farmacológico para la realización de eventuales ensayos clínicos.

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