Procesos Biologicos - 13 - Ciclo De Krebs.15.05.09

Ciclo de Krebs Dr. Giuliano Bernal Dossetto Departamento de Ciencias Biomédicas Universidad Católica del Norte

Ciclo de Krebs  Vía catabólica común en la oxidación de los

azúcares, ácidos grasos y aminoácidos. Todos convergen en la formación de acetil-CoA  La energía de oxidación del grupo acetil-CoA

produce CO2 y poder reductor (NADH, FADH2).  Estos últimos son conducidos por la cadena

respiratoria, hasta el oxígeno molecular, con la consecuente síntesis de ATP

Localización intracelular de las enzimas del ciclo de Krebs.  Las reacciones enzimáticas tienen lugar en la

matriz mitocondrial. La mayoría de las enzimas son solubles en la matriz y una se encuentra unida a la membrana interna.  Piruvato es transportado al interior de la

mitocondria a través de un transportador específico.

 Piruvato se oxida y forma acetil CoA con

perdida de CO2, posteriormente reacciona con oxalacetato para formar citrato.

Complejo Piruvato Deshidrogenasa La reacción general catalizada por esta enzima es una descarboxilación oxidativa. Esta reacción es irreversible en los tejidos animales. No forma parte directa del ciclo de Krebs. La descarboxilación oxidativa del piruvato a CO2 y acetil CoA requiere de 3 enzimas y de 5 coenzimas.

Overall reaction catalyzed by the piruvate dehydrogenase complex

Complejo Piruvato Deshidrogenasa 3 de las coenzimas están unidas al complejo, tiamina pirofosfato (TPP), lipoamida y flavin adenin dinucleotido (FAD). Las otras coenzimas son NAD+ y CoA-SH. El complejo posee tres actividades enzimáticas y en mamíferos forma un complejo de 8 x 106 kDa. Las enzimas se denominan piruvato deshidrogenasa (E1), dihidrolipoil transacetilasa (E2) y dihidrolipoil deshidrogenasa (E3).

Regulación del Complejo Piruvato Deshidrogenasa Este complejo es regulado en dos formas: Acetil-CoA y NADH inhiben la reacción en forma competitiva como inhibidores feed-back. Por otra parte el complejo es regulado por fosforilación y desfosforilación. El complejo es activo en su forma desfosforilada y viceversa. La inactivación es mediada por una proteina-kinasa dependiente de Mg2+-ATP. La activación es mediada por una fosfoproteína fosfatasa dependiente de Ca2+ y Mg2+.

Deficiencia de Piruvato Deshidrogenasa Niños que presentan alguna deficiencia de esta enzima generalmente exhiben elevados niveles séricos de lactato, piruvato y alanina. Frecuentemente presentan trastornos neurológicos que generalmente terminan con la muerte del individuo. El diagnóstico de deficiencia enzimática se realiza usando muestras de fibroblastos tomados de la piel del paciente. Algunos pacientes responden positivamente a una dieta pobre en carbohidratos. Otros son tratados con dicloroacetato, un inhibidor de la kinasa que fosforila e inactiva al complejo.

Reacciones del Ciclo de Krebs Cuatro reacciones del ciclo transfieren electrones al NAD+ o FAD, generando NADH y FADH2. Otra reacción da origen a un GTP. Se liberan 2 CO2 a través de descarboxilaciones. El ciclo comienza con una molécula de Acetil-CoA que se condensa con una molécula de oxalacetato, generando citrato. El producto final del ciclo será otra vez oxalacetato. Finalmente cada NADH y FADH2 generado entregará sus electrones generando 2,5 y 1,5 ATP respectivamente.

Formación de Citrato  El Citrato se forma por acción de la citrato

sintetasa.

 Esta enzima produce una condensación aldólica

entre el grupo metilo del acetil CoA y el grupo carbónilo del oxalacetato.  La enzima es alostérica y depende de las

concentraciones de los sustratos y del succinil CoA (compite con acetil CoA).  Además es inhibida por ATP, NADH y ácidos

grasos de cadena larga.

Formación de isocitrato vía cis-aconitato Citrato es convertido en forma reversible en Isocitrato a través de la enzima aconitasa, la cual forma un intermediario cis-aconitato. 

 Cis-aconitato permanece unido a la enzima.  La mezcla en equilibrio presenta un 90% de citrato y

10% de isocitrato, sin embargo este último se oxida rápidamente.

 La enzima contiene centros Hierro-Sulfuro los cuales

participan en la unión del sustrato y en la catálisis.

 Fluoroacetato es un potente inhibidor de la enzima.

Oxidación del isocitrato a αcetoglutarato y CO2  Reacción reversible catalizada por la isocitrato–

deshidrogenasa.

 Cataliza una descarboxilación oxidativa del isocitrato.  La enzima presenta dos formas, una NAD+ dependiente

presente sólo en las mitocondrias y la forma NADP+ dependiente, presente en las mitocondrias y citoplasma. Esta última participa en procesos anabólicos.

 La enzima mitocondrial necesita Mg2+ para su actividad.

Oxidación de α-cetoglutarato a succinil-CoA y CO2 Reacción irreversible catalizada por el complejo αcetoglutarato-deshidrogenasa. 

 NAD+ es el aceptor de electrones en la reacción.  La reacción es similar a la oxidación del piruvato a acetil

CoA y el complejo presenta las mismas características de la piruvato deshidrogenasa.  El complejo posee 3 actividades enzimáticas y 5

coenzimas.

 Las proteínas de estos complejos probablemente

presentan un origen evolutivo común.

Conversión de Succinil CoA a Succinato  El succinil CoA, posee un enlace de alta energía con el

grupo CoA.

 La hidrólisis de este grupo genera la energía necesaria

para la síntesis de GTP a partir de GDP y Pi.

 La reacción es catalizada por la succinil CoA-sintetasa.  El GTP posteriormente es utilizado para la síntesis de

proteínas mitocondriales, RNA o DNA.

 El GTP puede ser utilizado para fosforilar ADP y formar

ATP.

The succinyl-CoA synthetase reaction

Oxidación de Succinato a fumarato.  Reacción catalizada por la succinato-

deshidrogenasa, flavoproteína que contiene FAD unido covalentemente.  Esta enzima se encuentra ubicada en la cara

interna de la membrana interna mitocondrial.  Los e- fluyen desde el succinato al FAD,

entrando en la cadena de transporte electrónico.  La enzima es activada por succinato, ATP y

CoA. Es inhibida por oxalacetato y malonato.

Hidratación de Fumarato a Malato  La hidratación reversible del fumarato a

malato es catalizada por fumarasa.

 La enzima es un homotetrámero de 200

kDa y es estereoespecífica.

 La reacción es reversible en condiciones

fisiológicas y también presenta estereoespecificidad.

 El D-Malato no es un sustrato.

Deficiencia de Fumarasa Se han reportado muchos casos de deficiencia de las isoenzimas mitocondrial y citosólica de fumarasa. Los pacientes desarrollan un temprano daño neuronal, encefalomiopatía y distonia. En la orina se detectan cantidades anormales de fumarato y niveles elevados de succinato, αcetoglutarato, citrato y malato. Las isoenzimas citosólica y mitocondrial son codificadas por un mismo gen. La enfermedad es autosómica recesiva por lo que los padres presentan la mitad de la actividad enzimática.

Oxidación de malato a oxalacetato  Reacción catalizada por la L-malato-

deshidrogenasa dependiente de NAD+.  Es un proceso endergónico, pero transcurre

con facilidad en el sentido contrario, por la rápida oxidación de oxalacetato a citrato.  El NADP+ es débilmente reducido por la

enzima y es estereoespecífica para el L-malato.  Las células animales presentan dos formas, la

mitocondrial y citoplasmática.

Conservación de energía en el Ciclo de Krebs Ingresan a la vía 2 átomos de carbono en forma de acetilo, combinándose con oxalacetato. Dos átomos de carbono en forma de CO2 son liberados de la oxidación de isocitrato y αcetoglutarato. La energía liberada por estas oxidaciones se conserva en la reducción de 3 NAD+ y un FAD, y en la producción de 1 GTP o ATP. La oxidación de NADH genera 2,5 ATP y la oxidación de FADH2 genera 1,5 ATP.

Rol del Ciclo de Krebs  Su rol no se limita a la oxidación del acetato.  Juega un importante rol en el metabolismo

intermediario a través de la entrega de precursores para los procesos anabólicos.  La transaminación convierte α-cetoglutarato en

glutamato, el cual es capaz de salir de la mitocondria.  α-cetoglutarato es capaz de convertirse en

neurotransmisor en el tejido nervioso (glutamato y GABA).  Oxalacetato se convierte en fosfoenolpiruvato

durante la gluconeogénesis.

Reacciones Anapleróticas Son reacciones de “relleno” destinadas a suplir algún intermediario del ciclo cuando este ha sido utilizado en un proceso biosintético. En condiciones normales las reacciones que llevan a la salida de intermediarios del ciclo y aquellas que los reingresan se encuentran en un equilibrio dinámico. La reacción anaplerótica más importante es aquella catalizada por la enzima piruvato carboxilasa, la cual convierte piruvato y CO2 en oxalacetato. Los niveles de esta enzima son altos en el tejido hepático y nervioso.

Piruvato Carboxilasa La enzima consta de cuatro subunidades, cada una de las cuales posee una Biotina unida. Esta vitamina esta unida covalentemente a la enzima. Es un grupo prostético que transporta CO2 y depende de ATP. La reacción ocurre en dos pasos. Primero el bicarbonato se une a biotina y luego reacciona con piruvato. La biotina es una vitamina necesaria para el ser humano, se encuentra en muchos alimentos y es sintetizada por las bacterias del tracto digestivo. Avidina es una proteína de los huevos que une fuertemente a biotina, impidiendo su absorción.