Priyo_185_188

FaKtA Vol. 3 No. 5, Desember2007

FLOKULASI PADA MIKROORGANISME DAN PENERAPANNYA PADA BIOTEKNOLOGI Flocculation on Microbes and its Application in Biotechnology Priyo Wahyudi Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi

Naskah diterima bulan Januari 2007

ABSTRACT Flocculation, well known phenomena, is a clumping of number unicellular microbes (bacteria, yeast and micro-algae). This interesting phenomenon is one of biotechnology application. In one condition flocculation is needed, but in other it is avoid because will lead to the lost of product. Direct effect of flocculation is sedimentation, which makes easier for separation and recovery product. Flocculation depends on genetic, physiological and bio-chemo-physic environmental factors. Several application of flocculation applied by single cell protein and fermentation industries in around the world, as one of cheaper and easier technology in downstream process. Keywords: flocculation, sedimentation, separation, fermentation PENDAHULUAN Istilah flokulasi mikroorganisme didefinisikan sebagai suatu agregasi sejumlah sel-sel tunggal ke dalam flok ketika disuspensikan di dalam suatu medium cair yang diikuti dengan pengambangan atau sedimentasi. Fenomena flokulasi mikroorganisme ini pertama kali ditemukan pada yeast oleh Louis Pasteur pada tahun 1875 (Esser & Kues 1983). Sejak saat itu kajian mengenai flokulasi sel terus berkembang dan hanya 2 tahun kemudian ditemukan fenomena flokulasi tersebut pada bakteri. Perkembangan yang begitu pesat mengenai kajian flokulasi sel disebabkan faktor manfaatnya yang sangat besar pada pemisahan mikroba dari medium kultur pada industri fermentasi. Penguasaan teknologi flokulasi mikroorganisme sebetulnya telah dikenal lama terutama pada industri fermentasi bir. Sejauh ini fenomena flokulasi ini hanya ditemukan pada yeast, bakteri, mikroalgae, dan belum ada laporan terjadinya flokulasi pada fungi. Meskipun fenomena ini telah dikenal lama, namun mekanismenya sampai saat ini belum dikuasai sepenuhnya. Bahkan istilah flokulasi itu sendiri masih banyak kerancuan mengenai kesamaan dan perbedaannya dengan : agregasi, agglutinasi, clumping, koagulasi, adesi, aglomerasi, asosiasi dan pembentukan flok (Windisch 1968 ; Esser & Kues 1983). Dilihat dari hasil proses-proses tersebut di atas bisa jadi hampir serupa, namun sebetulnya mekanisme yang terjadi sangat berbeda. Hal inilah yang menarik untuk terus dilakukan pengkajian mekanismenya. Flokulasi dapat dikelompokkan berdasar fase selnya: (1) flokulasi vegetatif, didapatkan secara umum pada yeast, bakteri dan alga. (2) flokulasi seksual, ditemukan pada jenis yeast tertentu dimana terjadinya flokulasi merupakan prasarat terbentuknya sel-sel Alamat korespondensi: Gedung BPPT II Lt. 15 Jl. MH Thamrin No. 8 Jakarta 10340 email: [email protected]

seksual. Proses flokulasi juga dapat dikelompokkan berdasarkan jenis selnya: (1) autoflokulasi, yaitu flokulasi yang terjadi pada satu jenis sel yang sama. (2) koflokulasi, yaitu flokulasi yang terjadi pada dua atau lebih jenis (strain) sel yang berbeda. Hal-hal yang perlu mendapat perhatian dalam pembahasan flokulasi sel (baik itu bakteri, yeast maupun algae) adalah sebagai berikut : Flokulasi sel mikroorganisme merupakan kemampuan yang dikendalikan pada tingkat genetika, sehingga kita dapat menjumpai jenis yang flokulen (mampu berflokulasi) dan jenis nonflokulen. Gen yang mengatur flokulasi sampai saat ini diketahui ada 3 macam, meskipun untuk tiap-tiap jenis mikroorganisme saling berbeda cara pengaturannya. Faktor lingkungan ternyata memegang peranan yang sangat penting terhadap terjadinya flokulasi sel mikroorganisme (akan dibahas kemudian) Mekanisme flokulasi untuk tiap-tiap jenis mikroorganisme saling berbeda (spesifik jenis). Berbagai teori dan studi yang dilakukan untuk menjelaskan mekanisme flokulasi terus mengalami perkembangan, namun belum mencapai suatu titik temu yang sifatnya meng-generalisasi-kan terjadinya proses tersebut. Tujuan dari penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui fenomena flokulasi yang terjadi pada sel yeast, bakteri dan alga, dan faktor-faktor yang mempengaruhinya, serta aplikasinya di bidang bioteknologi. MEKANISME FLOKULASI Berbeda halnya dengan proses flokulasi bahan kimia biasa, maka sampai saat ini fenomena flokulasi yang terjadi pada bakteri dan algae masih jauh dari cukup dimengerti. Sementara flokulasi pada yeast meski belum sempurna, namun telah jauh lebih banyak informasi yang dimengerti dibandingkan pada bakteri dan algae, khususnya jenis yeast yang

185

Flokulasi pada Mikroorganisme... (Priyo Wahyudi)

berperan dalam fermentasi anggur dan alkohol (brewing yeast). Flokulasi pada Bakteri Terjadinya flokulasi pada sel bakteri melalui dengan suatu pemahaman bahwa permukaan luar sel bakteri bermuatan negatif. Adanya suatu usaha untuk menolak atau menetralkan muatan yang mengganggu dirinya, maka sel bakteri tersebut akan berflokulasi. Terbentuknya polimer-polimer seperti protein, selulosa, mukopolisakarida dan asam-asam amino kemungkinan besar juga berperan dalam terjadinya flokulasi pada bakteri (Esser & Kues 1983). Melalui percobaannya dengan menggunakan bakteri Methylomonas sp., Eggset et al. (1983) melaporkan bahwa protein pada permukaan sel ikut berperan dalam terjadinya flokulasi pada bakteri tersebut. Burdman et al. (1999) juga melaporkan mengenai keterlibatan protein pada membran luar bakteri Azospirillium brasiliense dalam proses agregasi. Olofsson et al. (1998) memberikan sebuah teori baru mengenai terjadinya flokulasi bakteri khususnya pada instalasi pengolahan air limbah sistem lumpur aktif (activated sludge). Dalam penelitiannya dia menemukan bahwa penyebab flokulasi sel bakteri adalah terjadinya proses adhesi antara sel bakteri dengan flok lumpur aktif. Hidrofobisitas permukaan sel bakteri (cell surface hidrophobicity) dalam hal ini memegang peranan yang sangat menentukan terhadap kemampuan adhesi bakteri. Flokulasi pada Algae Sangat sedikit informasi mengenai flokulasi yang terjadi pada algae bersel tunggal. Namun sedikit informasi yang diperoleh adalah bahwa sebagian besar jenis alga tersebut mengekskresikan sejumlah besar polisakarida dan polimer lainnya sehingga bisa terjadi flokulasi (Esser & Kues 1983). Walau bisa jadi teknologi flokulasi algae telah banyak dikuasai oleh produsen protein sel tunggal yang berasal dari algae seperti Spirullina dan Chlorella, namun mekanismenya secara penuh sampai saat ini masih belum lengkap. Flokulasi pada Yeast Usaha penguasaan teknologi flokulasi pada yeast sepanjang sejarah perkembangan mikrobiologi dan bioteknologi moderen telah mengalami perkembangan yang paling maju. Hal ini terkait dengan digunakannya yeast sebagai agen biologis pada pembuatan bir dan alkohol. Industri-industri bir di eropa berlomba untuk menguasai teknologi flokulasi yeast untuk menghemat biaya yang diperlukan pada saat pemanenan hasil fermentasi. Tetapi kembali lagi seperti yang telah disampaikan di depan bahwa mekasnisme flokulasi yeast sangat spesifik strain. Artinya mekanisme flokulasi pada Saccharomyces cerevisiae mungkin berbeda dengan Kluyveromyces sp. ataupun Candida albicans. Begitupun dengan karakter genetis dari jenis yeast itu sendiri yang bersifat flokulen atau nonflokulen, karakter prosesnya dalam fermentasi sebagai topfermenting strain atau bottom-fermenting strain (Esser & Kues 1983; Stewart & Russel 1981; Dengis et al.

186

1995; Al-Mahmood 1988; Smit et al. 1992; Calera & Calderone 1999) . Meski banyak sekali kontroversi tentang tepatnya mekanisme flokulasi pada yeast namun disepakati terdapat beberapa hal yang umum terlibat/ menentukan flokulasi, diantaranya : Dinding sel yeast memegang peran kunci dalam flokulasi. Kita ketahui bahwa dinding sel yeast terdiri atas 2 lapisan (lapisan dalam: glucan , lapisan luar: fosfomannan), dimana dinding bagian luar yang tersusun atas fosfomannan mempunyai afinitas yang tinggi terhadap protein. Terbentuknya kompleks antara protein dengan fosfamannan inilah yang merupakan bahan esensial terjadinya flokulasi sel (Esser & Kues 1983; Stewart & Russel 1981; Shankar & UmeshKumar 1994). Faktor kedua yang disepakati secara umum pada flokulasi yeast adalah peranan kation bivalen, terutama Ca2+. Kaitan yang erat peranan Ca2+ adalah dengan senyawa glikoprotein spesifik yang lebih dikenal dengan sebutan lectin. Hipotesis yang dikembangkan dari perlunya Ca2+ adalah bahwa ion kalsium tersebut menjadi ko-faktor dalam mengaktifasi kemampuan pengikatan dari lectin terhadap karbohidrat (Esser & Kues 1983; Stewart & Russel 1981; Shankar & Umesh-Kumar 1994). FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI FLOKULASI Terdapat banyak sekali faktor yang mempengaruhi flokulasi dan oleh Esser & Kues (1983) (gambar 1). Pada gambar 1 kita dapat melihat bahwa yang mempengaruhi flokulasi sel dari tingkat genetik dan fisiologis, sampai pada nutrisi, metabolisme, dinding sel serta faktor lingkungan eksternal sel. Terlihat bahwa untuk faktor fisiologis dan genetik, pengaruh terhadap flokulasi bersifat tidak langsung, karena dia akan mempengaruhi metabolisme atau dinding sel, baru terjadi flokulasi. Sementara faktor lingkungan dia dapat mempengaruhi secara tidak langsung melalui metabolisme dan dinding sel, tetapi beberapa faktor lingkungan juga dapat secara langsung mempengaruhi flokulasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi flokulasi adalah. Faktor genetik Studi tentang faktor genetika flokulasi yeast telah lama dilakukan kurang lebih sejak tahun 1950an. Studi yang dilakukan antara tahun 1975—1976 oleh Lewis et al. (lihat dalam Stewart & Russel 1981) menyimpulkan bahwa flokulasi pada yeast dikendalikan oleh gen FLO. Gen FLO yang mengendalikan flokulasi pada yeast itu berjumlah 3 buah yaitu dua gen dominan FLO1 dan FLO2 dan satu gen resesif flo3. Fenomena yang unik adalah bahwa untuk memungkinkan terjadinya flokulasi suatu sel hanya perlu kehadiran salah satu dari ketiga gen tersebut. Artinya bila suatu yeast mempunyai satu dari ketiga gen FLO tersebut (baik yang dominan atau resesif) sudah cukup untuk mengekspresikan terjadinya flokulasi sel.

FaKtA Vol. 3 No. 5, Desember2007

Genetika / Faktor fisiologis

Nutrisi

Metabolisme

Dinding sel

Flokulasi

Faktor Lingkungan Gambar 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi flokulasi sel mikroorganisme secara langsung maupun tidak langsung

Selain gen-gen yang telah dikenal (gen FLO) maka banyak peneliti yang melaporkan gen-gen lain yang berperan dalam flokulasi yeast. Satu diantaranya adalah Shankar et al. (1996) yang melaporkan bahwa flokulasi pada Saccharomyces cerevisiae ternyata dipengaruhi oleh over-ekspresi dari gen MIG1 yang mengkodekan suatu protein represor dari C2H2 zincfinger, yang terlibat dalam represi katabolisme karbon. Terjadinya gangguan pada gen MIG1 ini dapat mengakibatkan strain yeast yang flokulen menjadi tidak bisa berflokulasi lagi (berubah menjadi strain nonflokulen). Pada perkembangannya Bony et al. (1997) melaporkan bahwa flokulasi pada yeast dikendalikan oleh gen FLO1, FLO5 dan FLO8. Dari analisa sekuens genom yeast ditemukan beberapa open reading frame (orf) baru yang nampaknya homolog terhadap gen FLO1. Dua diantara orf baru tersebut ada hubungannya dengan gen FLO5 dan FLO8 yang telah dikenal, sementara yang lainnya merupakan gen flokulasi yang mungkin baru sama sekali. Hasil penelitian Calera & Calderone (1999) terhadap Candida albicans melaporkan bahwa mekanisme flokulasi pada C. albicans ternyata disebabkan oleh delesi gen CaHK1 yang diduga mengkodekan ensim histidin kinase yang berperan dalam osmoregulasi dan morfogenesis. Zhang et al.

(1999: 309-316) melaporkan bahwa dua buah gen yang berperan dalam integritas dinding sel S. cerevisiae yaitu PK1 dan SRB1/PSA1/VIG9 juga berperan dalam flokulasi sel. Faktor fisiologis Secara umum disepakati bahwa flokulasi sel mikroorganisme ditentukan oleh umur sel. Mikroorganisme baru akan mengalami flokulasi saat telah melewati fase logaritmik dan mencapai fase stasioner. Pada bakteri, terjadinya flokulasi erat kaitannya dengan terbentuknya polimer-polimer ekstraselular, yang terbentuk pada saat fase log. Oleh karenanya dapat disimpulkan bahwa terjadinya awal flokulasi pada bakteri adalah sesaat setelah terbentuknya polimer-polimer ekstraselular tersebut pada fase log. Pada yeast kemampuan flokulasi meningkat pada fase log dan mencapai tingkat maksimal saat mencapai fase akhir fermentasi (Esser & Kues 1983). Faktor lingkungan, dapat kita pilah menjadi: Faktor fisika Prinsip yang umum tentang pengaruh temperatur terhadap flokulasi adalah bahwa terjadinya penurunan suhu optimal pada kisaran tertentu akan menyebabkan flokulasi. Usaha manusia dalam merangsang terjadinya flokulasi pada mikroorganisme diantaranya dengan melakukan pendinginan (cooling).

Tabel I. Senyawa-senyawa penginduksi flokulasi mikroorganisme Senyawa Polimer : Poliakrilamid, polietilenimin, dekstran, protein, polisakarida, asam nukleat

Organisme Bakteri

Polistiren sulfonat, selulosa Senyawa organik lain : Etanol, metanol, propanol, aceton, humic acid, melanoidin, phlobafen Senyawa anorganik : Ca2+, Mg2+, Na+

Yeast

Bentonit, Al3+

Algae

Bentonit, Fe, Ni, Al3+, Ca2+

Yeast

Yeast

Bakteri

187

Flokulasi pada Mikroorganisme... (Priyo Wahyudi)

Pada kebanyakan yeast flokulasi terjadi pada suhu di bawah 20°C, dan di atas suhu 25°C flokulasi tidak akan terjadi. Sementara pada bakteri contohnya Corynebacterium sp. yang dikultur pada suhu 40°C, akan segera berflokulasi apabila suhunya diturunkan sampai 15°C (Esser & Kues 1983). Adanya agitasi yang ringan juga merupakan faktor fisik yang dapat mempercepat terjadinya flokulasi sel. Faktor kimia Faktor kimia yang sangat menentukan proses flokulasi adalah pH dan senyawa-senyawa kimia penginduksi flokulasi. Faktor pH memegang peranan yang esensial karena sifatnya yang spesifik strain. Tiap-tiap strain mempunyai kisaran pH optimal untuk terjadinya proses flokulasi. Sementara untuk senyawa-senyawa kimia yang merangsang (induce) terjadinya flokulasi dapat disarikan pada tabel 1 di bawah ini. Faktor biologi Dalam hal ini faktor biologi yang menentukan flokulasi adalah konsentrasi sel di dalam suspensi. Menurut (Esser & Kues 1983) flokulasi pada S. cerevisiae baru terjadi bila konsentrasi selnya telah mencapai 3—5 x 108 sel/ml. Selain konsentrasi sel, faktor biologi lainnya yang cukup berpengaruh terhadap flokulasi adalah terdapatnya strain lain di dalam fermentor. Kehadiran strain lain dapat bersifat meningkatkan atau menghambat proses flokulasi. APLIKASI FLOKULASI MIKROORGANISME DI BIDANG BIOTEKNOLOGI Beberapa industri bioteknologi yang sangat berkepentingan dengan penguasaan teknologi flokulasi sel baik bakteri, algae maupun yeast adalah: 1. Instalasi pengolahan air limbah (IPAL); IPAL pabrik maupun rumah tangga mekanisme flokulasi memudahkan sistem untuk memisahkan mikroba sehingga didapatkan effluen dengan kandungan mikroba yang rendah. 2. Industri produksi etanol; Pada fermentor skala besar, mekanisme flokulasi yeast akan memudahkan tahapan pemisahan fase cair dengan padatan, sehingga proses destilasi untuk memisahkan etanol dari air akan lebih efektif dan efisien. 3. Industri minuman beralkohol (bir); Mekanisme flokulasi sel Saccharomyces cerevisiae menjadikan produk yang jernih. 4. Industri baking yeast; Pemanenan biomassa S. cerevisiae hasil fermentasi cair menjadi lebih mudah. 5. Industri protein sel tunggal, dan 6. Industri-industri fermentasi lainnya. Penerapan teknologi flokulasi sel mikroorganisme ini umumnya digunakan untuk proses pemanenan atau akhir proses pengolahan. Prinsip dasar yang harus kita ingat adalah bahwa flokulasi sel mikroorganisme membantu kita dalam memisahkan mikroorganisme dari mediumnya. Flokulasi sel ini pada era bioindustri sekarang dan masa yang akan datang akan sangat bermanfaat

188

terutama dalam menekan biaya produksi produkproduk fermentasi. DAFTAR PUSTAKA Al-Mahmood, S., P. Glummelly, R. Bonaly, F. Delmotte & M. Monsigny. 1988. Kluyveromyces bulgaricus yeast lectins, isolation of Nacetylglucosamine and galactose-specific lectins: Their relation with flocculation. J. Biol. Chem. 263(8): 3930—3934. Bony, M., D. Thines-Sempoux, P. Barre & B. Blondin. 1997. Localization and cell surface anchoring of Saccharomyces cerevisiae flocculation protein Flo1p. J. Bacteriol. 179(15): 4929— 4936. Burdman, S., E. Jurkevitch, B. Schwartsburd & Y. Okon. 1999. Involvement of outer-membrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense. Microbiology 145(5): 1145—1152. Calera, J.A. & R. Calderone. 1999. Flocculation of hyphae is associated with a deletion in the putative CaHK1 two-component histidine kinase gene from Candida albicans. Microbiology 145 (6): 1431—1442. Dengis, P.B., L.R. Nelissen & P.G. Rouxhet. 1995. Mechanism of yeast flocculation: Comparison of top- and bottom-fermenting strains. Appl. Environ. Microbiol. 61(2): 718—728. Eggset, G., E.Stenberg & J. Kjosbakken. 1983. Flocculation of Methylomonas sp.: Possible involment of a surface protein. Journal of General Microbiology 129: 3611—3617. Esser, K. & U. Kues. 1983. Flocculation and its implication for Biotechnology. Process Biochemistry-December 1983: 21—23. Olofsson, A.C., A. Zita & M. Hermansson. 1998. Floc stability and adhesion of green-fluorescentprotein-marked bacteria to flocs in activated sludge. Microbiology 144(2): 519—528. Shankar, C.S. & S. Umesh-Kumar. 1994. A surface lectin associated with flocculation in brewing strains of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology 140(5): 1097—1101. Shankar, C.S. , M.S. Ramakrishnan & S. UmeshKumar. 1996. MIG1 overexpression causes flocculation in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology 142(9): 2663—2667. Smit, G., M.H. Straver, B.J. Lugtenberg & J.W. Kijne. 1992. Flocculence of Saccharomyces cerevisiae cells is induced by nutrient limitation with cell surface hydrophobicity as a major dominant. Appl. Environ. Microbiol. 58(11): 3709—3714. Stewart, G.G. & I. Russel. 1981. Yeast flocculation. Brew. Science: 61-92. Windisch, S. 1968. Flocculation of brewing yeast. The Brewers Digest-November 1968: 62-66. Zhang, N., D.C. Gardner, S.G. Oliver & L.I. Stateva. 1999. Down-regulation of the expression of PCK1 and SRB1/PSA1/VIG9, two genes involved in cell wall integrity in Saccharomyces cerevisiae, causes flocculation. Microbiology 145(2): 309—316.