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PROYECTO TEÓRICO: PRODUCCIÓN DE TOXINA BOTULÍNICA

INTEGRANTES GISSETH TATIANA ARAUJO BOLAÑOS LAURA CAMILA CAMARGO ANGELA VANESA DIAZ CANO KAROL ALEJANDRA ROA HIGUERA

UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA INGENIERÍA DE BIOPROCESOS BOGOTÁ D.C FEBRERO 2019 1. CONTEXTUALIZACIÓN

1.1 Metabolito La toxina botulínica es un metabolito microbiano cuya fórmula química es C6760H10447N1743O2010S32 que se sintetiza como una cadena de polipéptidos pesada (H) unida mediante puentes disulfuro con otra cadena liviana (L) asociada con un átomo de zinc, para un total de masa molecular de 150 kDa (Kilodalton)(Vicenti, 2008). Son partículas inactivas que se liberan del microorganismo mediante lisis bacteriana y obtienen su activación mediante la modificación en dos pasos de la estructura terciaria de la proteína (World Health Organization, n.d). Este metabolito es producido por diferentes tipos de Clostridium Botulinum dando origen a las siete clases de toxina que se indican en la tabla 1.

Tabla 1. Grupos de clostridium Botulinum y sus toxinas. Tomado de https://www.who.int/csr/delibepidemics/clostridiumbotulism.pdf Los diferentes tipos de toxinas son sensibles al calor, inactivándose en general a 80°C por un tiempo prolongado de 10 minutos (Elika, 2013). La toxina botulínica es un metabolito secundario que varía su toxicidad según sea el organismo afectado. Para un humano de 70 kg la dosis letal a causa de este metabolito es de 0.09 a 0.15 picogramos (vía intravenosa), 0.7 a 0.9 picogramos (inhalación) y 70 microgramos (vía oral); por lo cual se considera un complejo proteico altamente tóxico regulado por diferentes instituciones a nivel mundial, puesto que puede ser utilizado como arma biológica. El mecanismo de acción proviene de la cadena L, la cual es activa enzimáticamente y produce alteración del proceso de exocitosis de la acetilcolina, lo que lleva a la parálisis o flacidez de los tejidos(Vicenti, 2008). La toxina botulínica es soluble en agua, inodora, sin sabor e incolora. Además del calor, se puede inactivar con formaldehído o lejía, jabón, métodos de cloración, aireación, entre otros (Vicenti, 2008). 1.2 Modelo biológico Clostridium Botulinum es una bacteria gram positiva capaz de producir siete tipos de toxina botulínica: A, B,C, D, E, F y G (ver tabla 1). Es un organismo procariota que se distingue en su morfología por ser un bacilo flagelado en forma de varilla, anaerobio obligado y con formación de endosporas terminales (World Health Organization, n.d) como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Clostridium botulinum, Tomado de https://pictures.doccheck.com/com/photo/10798-clostridium-botulinum-bacteriaillustration Cada grupo de bacterias C. Botulinum posee diferente actividad óptima según su temperatura (ver tabla 2), no obstante en términos generales se pueden clasificar

como organismos mesófilos. Tabla 2. Crecimiento óptimo de clostridium Botulinum. Tomado de https://www.who.int/csr/delibepidemics/clostridiumbotulism.pdf Por otra parte su pH óptimo de crecimiento es de 7, por lo que se considera que es un organismo neutrófilo. Además se caracteriza por ser una bacteria autótrofa y quimioorganotrofa que se encuentra generalmente en suelos, heces de aves y materia en descomposición (Hidalgo & Montecino, 2015). Las colonias de este microorganismo formadas mediante fisión binaria toman un tiempo de división de ADN y celular de 35 minutos, observándose colonias translúcidas o blanquecinas con un leve levantamiento y olor muy desagradable (putrefacción) en condiciones óptimas 48 horas después (Merino, 2016). 1.3 Usos ➢ Terapéutico: generalmente del tipo A (TbA) y tipo B(TbB). ❖ Estrabismo: patología basada en la hiperactividad de los músculos encargados del movimiento del globo ocular.

❖ Distonías focales, cervicales y ocupacionales: musculares involuntarios. ❖ Síndrome de Tourette ❖ Incontinencia urinaria ❖ Hiperhidrosis: sudoración excesiva. ❖ Síndrome de Duane ❖ Esclerosis múltiple ❖ Espasticidad, calambres, espasmos. ❖ Lesión cerebral traumática. ❖ Migraña, dolor miofascial solo por nombrar algunos ejemplos (Vicenti, 2008). ➢ Estético: generalmente del tipo A (TbA) y tipo B(TbB) ❖ Eliminación de arrugas

movimientos

1.4 Impactos 1.41 Positivos ❖ La toxina botulínica se utiliza en distintas ramas de la medicina para dar respuesta a múltiples enfermedades. Ha sido estudiada para disminuir el porcentaje de problemas urologicos en niños (Revista Mexicana de Urología, 2013); además de dar tratamiento a mujeres con el síndrome de vejiga hiperactiva (VH) en donde se obtuvieron mejoras al aplicar la toxina a mujeres que presentaban el síndrome mejorando la calidad de vida de estas (Álvarez M, Rosa Lucía, González S, Rocío, & Elizalde V, Víctor Manuel, 2016). Tratamientos en patología otorrinolaringológicos (Caro L, Jorge, Fuentes L, Nicolás, & Iñiguez C, Rodrigo.,2015). ❖ Tratamientos estéticos faciales como el rejuvenecimiento facial; la aplicación de la toxina botulínica genera grandes satisfacciones cuando se realiza un tratamiento adecuado que está dado por la armonía facial, el equilibrio, el reposo y el movimiento (Alcolea López, J.M.,2011). 1.42 Negativos ❖ Puede causar un impacto negativo cuando se realizan las prácticas de forma inadecuada generando una parálisis facial o de los músculos que están asociados donde se aplica la toxina botulínica. (Alcolea López, J.M.,2011). ❖ Es producida por la Clostridium botulinum, que produce las toxinas más mortales conocidas por el hombre. ❖ Al ser organismo anaerobio crece bien en productos enlatados causando un riesgo en la salud humana al generar botulismo

Los campos en los que más se usa y se estudia la toxina botulínica es en los referentes a la salud y a la estética siendo explotados de mayor forma; esto debido a que ha sido un ente de estudio muy importante para diferentes patologías en las ramas médicas y estéticas a nivel mundial. 1.5 Tipos de proceso para su obtención “La toxina se obtiene por acidificación, centrifugación y purificación de cultivos bacterianos de Clostridium botulinum” ( De la Torre, 2009, p.327). Para la obtención de la toxina botulínica, se llevan a cabo varios procesos, primero se realiza la selección de la cepa a utilizar (Clostridium botulinum), la cual para preservar su actividad enzimática, biológica y química, se conserva a través de la liofilización, lo cual asegura su estabilidad genética. Después de esto, se realiza una acidificación, la cual consiste en una fermentación botulítica, bajo condiciones anaeróbicas y con un pH ácido, se realiza una fermentación de lactosa, dando como productos de esta fermentación, ácido butírico, gas y las neurotoxinas. Posteriormente, pasa por un proceso de centrifugación, a través del cual se acelera la sedimentación de estos componentes, para luego realizar la purificación de la muestra. Esta purificación se realiza a través de una membrana (diálisis), realizando un buffer de pH 8 (normalmente de fosfato de sodio), para que la neurotoxina pase a través de dicha membrana, obteniendo así la toxina botulínica. Finalmente en el proceso de empaque, se realiza nuevamente un proceso de liofilizado, lo cual convierte la sustancia en un polvo blanco, el cual se vende en viales, para la posterior dilución y uso en la industria, a criterio del manipulador y según especificaciones de la compañía productora. 1.6 Valor en el mercado En la industria se encuentran varias compañías comercializadoras de toxina botulínica, en su gran mayoría para la industria cosmética, pero también para su uso médico. En la industria cosmética se puede acceder a esta toxina, con diferentes rangos de precio, esto se debe principalmente a los estudios científicos que avalen la efectividad y la calidad del producto, y el tiempo en el que éste tenga efecto en el organismo, es decir, la durabilidad del producto.

Tabla 3. Precio de toxina botulínica para el año 2011. Tomado de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3508655/#b8-mder-5-097 1.7 Compañías productoras ➢ Allergan Pharmaceuticals, USA Empresa productora de BOTOX® (onabotulinumtoxinA) y cosmética BOTOX®(onabotulinumtoxinA), productos de tipo médico y cosmético para diferente público a base de toxina botulínica de tipo A (Allergan, 2019). Para 2018 tuvo ingresos netos GAAP de 15.79 mil millones de dólares, con una disminución del 1% con respecto al año anterior. Según Brent Saunders, presidente de la compañía, “...BOTOX ®Cosmetic, BOTOX ® terapéuticas, VRAYLAR ® , Juvederm ® , Lo LOESTRIN ® , CoolSculpting ® y LINZESS ® añaden casi$ 1 billón en nuevos ingresos para nuestro negocio principal en 2018”. De estos productos, el BOTOX ® terapéutico obtuvo un ingreso para diciembre de 2018 de 258,1 millones de

dólares, mientras el BOTOX ® Cosmetic, de estética facial representó un ingreso de 157,8 millones de dólares para la misma fecha (Allegar, 2019). ➢ Ipsen,UK Es un grupo biofarmacéutico que intenta mejorar la calidad de vida de las personas a través del desarrollo biotecnológico de medicamentos innovadores en áreas de oncología, neurociencia y enfermedades poco comunes. Tras 25 años de estudios para el diseño de nuevas aplicaciones de la toxina botulínica, la compañía logró dominar procesos y tecnologías para el tratamiento de espasticidad, afecciones músculo-nervios, oncología, endocrinología y medicina estética(IPSEN, 2019). Con su producto Dysport® en 2009 se introdujo en el mercado valiendo 50 dólares menos que Botox, lo que le permitió colocar mayor presupuesto en marketing. Ambos productos poseen diferente formulación, pero las dosis de toxina tipo A que se aplican para lograr iguales efectos son mayores en Dysport de lo que se necesita de Botox (Korman, 2009). para el primer semestre de 2018 la compañía logró un crecimiento en sus ventas del 21,5%; siendo dysport el tercero de sus productos más vendidos (IPSEN, 2018). ➢ Merz Pharma, Alemania Es una compañía global de estética y neurotoxinas de atención médica especializada con más de 110 años de fundada. la compañía fundamenta sus actividades en investigación, desarrollo y comercialización de nuevos productos especialmente en áreas de medicina y estética. Los ingresos obtenidos por esta empresa en el lapso 2017/2018 fueron de 1.024.4 Euros distribuidos entre Norteamérica, América Latina y otras compañías asociadas. Su principal producto relacionado a la toxina botulínica es el Xeomin, distribuido en viales de 50, 100 y 200 unidades en polvo de toxina de tipo A (Merz Pharma, 2019) principalmente usado en neurología. 2. PROCESO BIOTECNOLÓGICO 2.1 Definición del proceso El proceso en el que nos enfocaremos será en el área medicinal con elaboración de fármacos por medio del crecimiento, extraccion y purificacion de la toxina botulínica A (TB-A) de cultivos o esporas de la Clostridium botulinum; esto para tratar pacientes con trastornos neuromusculares como la parálisis cerebral. (Derise N., Harrison K., Juneau C., Rees D., 2013) En el proceso influyen “los métodos de crecimiento de la bacteria, la fermentación de las esporas para alcanzar una concentración adecuada, para la purificación se

pueden utilizar distintos tipos de cromatografías y para almacenar el producto final de forma sólida es necesario diluir con un medio de suero humano” (Derise N., Harrison K., Juneau C., Rees D., 2013) 2.2 Diseño del medio de cultivo Para la producción de C. Botulinum es necesario tener un medio de cultivo rico en proteínas, con bajas concentraciones de sal y azúcar, ph muy próximo a 7 conservando el cultivo a una temperatura entre 20-45 °C (Elika, 2013). La toxina en sí misma se elimina de la cerveza fermentada a través de la precipitación ácida y la centrifugación. Según SIGMA(2009), el medio de cultivo propicio para el crecimiento de este microorganismo debe contener sustratos como la caseína enzimática hidrolizada en una proporción de 40 g/l, así como extracto de levadura de 5g/l que proporcionan aminoácidos, proteína (y consigo fuentes de nitrógeno) y complejo de vitamina B requeridos para el crecimiento de la bacteria. Además de ello es necesario agregar dextrosa en proporción 2g/l como carbohidrato fermentable; una solución de fosfato de disodio (5 g/l) como solucion amortiguadora del medio; una solución de sulfato de magnesio en muy baja cantidad 0.01g/l, que ayudará en la fase de esporulación del organismo, permitiendo el desarrollo de más esporas y mayor tasa de crecimiento del organismo; cloruro de sodio 2g/l para ayudar a mantener el equilibrio osmótico del medio y por último 20g/l de agar. Para realizar la mezcla se puede usar agua destilada, teniendo en cuenta las proporciones antes nombradas; posteriormente se debe realizar una esterilización del medio de cultivo en el autoclave a una presión de 15 lbs a 121°C por 15 minutos y bajar la temperatura a 50-55 °C.

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2.3 Etapas del proceso Producción del cultivo de esporas de la C. Botulinum; como agentes biológicos y adición de agentes químicos. Fermentación Precipitación ácida de la toxina Sedimentación Centrifugación Lavado Extraccion solido-liquido Purificación (precipitaciones ácidas y centrifugaciones) Disolución Separación cromatográfica Cristalización Transferencia (adición de suero humano, albúmina sérica) Congelación en seco

2.4 Condiciones de operación del proceso

❖ Temperatura en un rango de 20 a 45 °C debido a que es una bacteria mesófila. ❖ Calidad, seguridad y eficacia. ❖ Condición de crecimiento anaerobia (menos del 2%) ❖ pH neutro ❖ Medios de crecimiento de origen animal, productos de soja y triplosa sulfito cicloserina. ❖ 24 horas mínimo para alcanzar la máxima concentración de toxina.

2.4 Diagrama del proceso

3. REFERENCIAS

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