Preinforme Enzimas.docx

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: CATECOLASA PREINFORME Nombre: Viviana Jimenez Grupo: 3.1

I. CUESTIONARIO CONSULTA 1. Explique brevemente ¿qué es el pardeamiento enzimático? El pardeamiento enzimático (PE) esta relacionado con la actividad de la enzima polifenol oxidasa (PPO) que cataliza la oxidación a diferentes compuestos fenólicos, con la consecuente transformación a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial. 2. Sobre la catecolasa (catecholase) en el enlace del aula virtual (DBGET Search – ENZYME) consulte: nombres comunes y sistemático, clasificación completa, incluyendo jerarquía (brite hierarchy), reacción o reacciones que cataliza, sustrato, producto, cofactor y comentario sobre la enzima. -Nombre:

catecol oxidasa; difenol oxidasa; o-difenolasa; polifenol oxidasa;pirocatecol oxidasa; dopa oxidasa; catecolasa; o-difenol: oxidorreductasa de oxígeno; o-diphenol oxidoreductase. -Clasificacion:

Oxidoreductasas; Actuar sobre difenoles y sustancias relacionadas como donantes; Con oxígeno como aceptor. -Nombre sistematico: 1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno

-REACCIÓN: R00058 Entrada

R00058

Reaction

Nombre

catecol: oxidorreductasa de oxígeno; 1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno

Definición

Oxígeno + 2 Catecol <=> 2 o-Benzoquinona + 2 H2O

REACCIÓN: R00031 Entrada Nombre

R00031

Reaction

1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno

Definición Oxígeno + 2 L-Tirosina <=> 2 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina

-Sustrato: Nombre Catecol; 1,2-bencenodiol; o-Benzenediol; 1,2dihidroxibenceno; Brenzcatechin;Pyrocatecho Fórmula C6H6O2

-Producto: Nombre: o-benzoquinona; Benzoquinona

1,2-

Fórmula C6H4O2

-Comentario Una proteína de cobre tipo 3 que cataliza exclusivamente la oxidación de catecol (es decir, o-difenol) a la o-quinona correspondiente. La enzima también actúa sobre una variedad de catecoles sustituidos. Es diferente de la tirosinasa, que puede catalizar tanto la monooxigenación de los monofenoles como la oxidación de los catecoles. 3. Describa brevemente la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, si la tiene, el sitio activo y los cofactores de la catecolasa usando figuras impresas y recortadas del enlace del aula virtual - Enzyme structures database-. Para este propósito la búsqueda debe realizarla con el número de clasificación obtenido del primer enlace, en el espacio correspondiente a enzyme class: EC.

-El diagrama de colores ilustra la disposición de los residuos en cada hélice. Los residuos están codificados por colores para los tipos de aminoácidos hidrofóbico (verde), polar (azul) y cargado (rojo). Las ruedas asumen el valor helicoidal ideal de 3.6 residuos por vuelta. -La estructura secundaria esta compuesta principalmente de α helices y giros beta y se obsevan pequeñas configuraciones de hoja plegada

(N.Hakulinen, 2013) (Krebs, Merkel, & Rompel, 2004)

(N.Hakulinen, 2013) | EBI is an outstation of the European Molecular Biology Laboratory

Macmillan Publishers Ltd: Nat Struct Biol (1998, 5 , 1084-1090) copyright 1998. -Región de sitio activo de catecol oxidasa. a, Vista estéreo de la región del sitio activo con feniltiourea unida al centro dicopper. El azufre del inhibidor se une a ambos iones de cobre. Además, la cavidad hidrofóbica formada por los residuos Ile 241, His 244, Phe 261 proporciona contactos de van der Waals con el anillo aromático de la droga. Una presentación en barra de los residuos del sitio activo del estado Cu (II) -Cu (II) en reposo de la enzima se superpone en verde claro para revelar el cambio conformacional inducido por la unión de PTU.

Macmillan Publishers Ltd: Nat Struct Biol (1998, 5 , 1084-1090) copyright 1998. b, Presentación de la superficie molecular de la cavidad de unión hidrofóbica de catecol oxidasa que muestra los dos iones metálicos, el inhibidor y Phe 261 en una presentación en barra. La superficie electrostática se ha generado omitiendo estos residuos. Las áreas de color rosa tienen un potencial negativo y las áreas de color púrpura tienen un potencial positivo.

4. Haga una descripción sobre el efecto que tiene la temperatura y el pH en la actividad catalítica de las enzimas.

-La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína. En cuanto los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. 1. Fichas de seguridad Nombre

Feniltiourea

Ácido ascórbico

Fórmula

C7H8N2S

C6H8O6

Aspecto

Polvo solido Color beige Inodoro

Cristales blancos

Peligrosidad

P

Primeros auxilios CONSULTAR AL MEDICO EN TODOS LOS CASOS Inhalación: sacar al aire libre, proporcionar oxígeno. No utilizar técnicas boca a boca cuando la víctima haya ingerido o inhalado la sustancia; inducir la respiración artificial con un dispositivo medico efectivo Piel: quitarse inmediatamente la ropa y los zapatos contaminados. Lavar inmediatamente con agua abundante al menos durante 15 minutos. Lavar las prendas contaminadas antes de volver a usarlas. Ojos: enjuagar inmediatamente con abundante agua, también debajo de los parpados al menos durante varios minutos. Ingestión: enjuagar la boca, NO causar el vómito. Inhalación: aire limpio y dejar en reposo. Piel: no hay afección Ojos: enjuagar con abundante agua por varios minutos, consultar un médico. Ingestión: reposo y someter a atención médica.

Catecol

C6H6O2

Cristales incoloros Xn

Buffer fosfato

HPO4−2 con H2PO4-

Liquido incoloro amarillo

Inhalación: aire limpio y reposo, prestar atención medica Piel: quitar ropas contaminadas aclarar con abundante agua por varios minutos o ducharse. Ojos: enjuagar con abundante agua por varios minutos y si es fácil, retirar los lentes de contacto consultar al medico Ingestión: enjuagar la boca y prestar atención médica. Inhalación: trasladar al aire limpio Piel: quitar ropas contaminadas y enjuagar con agua Ojos: aclarar con abundante agua por varios minutos Ingestión: dar a beber agua, consultar al médico.

Bibliografia. Suárez, P., Andreu, A., Colman, S., Clausen, A., & Feingold, S. (2009). Enzimatic browning : phenotypic , biochemical and molecular characterization of native potatoes from Argentina. Revista Latinoamericana de La Papa, 15(1), 66–71. Retrieved from http://www.papaslatinas.org/v15n1p66.pdf Alzate T., L. M., Arteaga G., D. M., Guerreo E., C. A., & Rojano, B. A. (2013). Nueva fuente de antioxidantes para el control de pardeamiento enzimático: una alternativa para la reducción de pérdidas en poscosecha de frutas. Journal of Engineering & Technology (2256-3903), 2(2), 22–32. Retrieved from http://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&db=aph&AN=125024059&site=e ds-live Gerdemann C 1 , Eicken C , Krebs B (2015). La estructura cristalina de catecol oxidasa: nueva percepción de la función de las proteínas de cobre tipo 3. Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Universität Münster, Wilhelm-KlemmStrasse 8, 48149 Münster, Alemania. Retrieved from http://www.genome.jp/dbgetbin/www_bget?ec:1.10.3.1 Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Obtenido de Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo: http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Fi cheros/301a400/nspn0379.pdf Integrated database retrieval system.Enzime: 1,10,3,1. Obtenido de Integrateddatabase retrieval system: http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.10.3.1

Universidad del Pais Vasco. Universidad del Pais Vasco. Obtenido de Universidad del Pais Vasco: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph Krebs, B., Merkel, M., & Rompel, A. (3 de Marzo de 2004). http://www.scielo.org.ar/. Obtenido de http://www.scielo.org.ar/: http://www.scielo.org.ar/pdf/aaqa/v92n13/v92n1-3a01.pdf N.Hakulinen, C. ( 2013). The European Bioinformatics Institute. Obtenido de The European Bioinformatics Institute: https://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/cgibin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=4j3q&template=protein.html&r=wiring&l=1&ch ain=A

Verificación de la actividad enzimática y efecto de la feniltiourea

RESULTADO ESPERADO:La feniltiourea inhibe el pardeamiento enzimático, esta se unirá al cobre de la catecolasa e impedirá el acoplamiento de enzima-sustrato actuando como un agente quelante utilizando en su estructura los iones de cobre formando complejos, en las pruebas donde no se adiciona la feniltiourea presentara pardeamiento. DIAGRAMA DE FLUJO: Tomar 4 tubos, pipetear:

Tubo 1: 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL)Catecol 0.2%. Tubo 2: 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL) Agua destilada. Tubo 3: 1 (mL)Catecol 0.2% + 1 (mL) Agua destilada. Tubo 4: : 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL)Catecol 0.2% + 1(mL)Feniltiourea

Colocar los tubos en baño de maría a 37oC durante 25 minutos. Observar como inicial y final de cada unos los tubos.

Emplear codigo para determinar el color.

Efecto de la temperatura RESULTADO ESPERADO:observar la actividad enzimática depender de la temperatura, a temperaturas extremas como 4ºC y 90ºC las enzimas perderán su función por la desnaturalización proteica, desdoblamiento de la proteína y por consecuente pérdida de la estructura terciaria, en cambio a temperatura cercana al ambiente o corporal de su localización biológica las enzimas tendrán el máximo funcionamiento o la reacción tendrá una mayor velocidad hasta el equilibrio en la formación de productos disminuyendo la energía de DIAGRAMA DE FLUJO Adicionar a cada uno 1 mL del extracto enzimático. enzimático

tubos a diferentes temperaturas durante 10 minutos, de esta manera:

Tubo 1 a 0oC Despues de 10 min, agregar 1 mL de catecol al 0,2%. Y dejar 5 min mas a tem° indicada.

Luego tomar tubos 1, 3 y 4 colocarlos en baño de agua a 37oC durante 10 minutos, observar yregistrar.

Observar el cambio de color segun codigo.

(en hielo)

Tubo 2 a 37oC (en baño de agua) Tubo 3 a 60oC (en baño de agua) Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo)

Efecto De ph : RESULTADO ESPERADO:La actividad enzimática dependerá del comportamiento de la enzima ya sea acido o básico con el sustrato (mecanismo catalítico de la enzima), los aminoácidos ácidos y bases que contiene el sitio activo son los determinaran el pH óptimo por el grado de disociación de los grupos funcionales presentes en el sitio activo, el pH de mejor actividad enzimática no necesariamente es el mismo del interior de la célula esto sucede por los iones que participan en la desnaturalización a valores de pH, o por la disponibilidad de los iones OH- en el medio para oxidar más rápido el catecol. DIAGRAMA DE FLUJO: Tomar 4 tubos, y medir volumenes:

Tubo 1: Buffer pH=3 - 2(mL) + 1 (mL) Extracto enzimático. Tubo 2: Buffer pH=5 (mL)-2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático. Tubo 3: Buffer pH=7 (mL) - 2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático. Tubo 4: Buffer pH=9 (mL) - 2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático.

Colocar los a una temperatura de 37oC durante 10 minutos. Agregar a cada uno 1 mL de catecol,continuar calentamiento por 15 min.

Obsevar y registrar, plantear Ph optimo.

Efecto del ácido ascórbico RESULTADO ESPERADO:el ácido ascórbico es un antioxidante por lo cual actuara como un inhibidor del pardeamiento enzimático porque en agua liberara iones de hidrogeno, que son el remplazo de los iones de hidrogeno que se remueven por la catecolasa impidiendo la formación de moléculas de colores, por lo cual en la prueba debería minimizar el pardeamiento enzimático hasta que se convierte en deshidroscorbico en la otra muestra la enzima monofenol oxidasa tendrá más sustrato (agua) y ayudara en la reacción para la obtención del color pardo.

DIAGRAMA DE FLUJO

Cortar un trozo de cada muestra (5 mm)de espesor y divídirlo en dos partes iguales.

Raspar la superficie de ambos trozos, de cada muestra, con una cuchilla.

Cubrir uno de los trozos con agua destilada y al otro con ácido ascórbico.

Después de 1 minuto cubra los trozos con catecol.

Esperar 5 minutos y observar