Preeklampsia Adalah Salah Satu Komplikasi Kehamilan Yang Paling Berbahaya.docx

Preeklampsia adalah salah satu komplikasi kehamilan yang paling berbahaya, dan penyebab utama kematian dan morbiditas ibu dan perinatal. Meskipun gejala klinis muncul terlambat, asalnya adalah awal, dan karenanya deteksi sudah layak pada trimester pertama. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki kelimpahan sirkulasi RNA non-coding kecil di plasma ibu hamil pada trimester pertama mereka, mencari transkrip yang paling baik memisahkan sampel preeklamsia dari wanita hamil yang sehat. Untuk tujuan ini, kami melakukan sekuens RNA noncoding kecil dari 75 preeklamsia dan sampel kontrol, dan mengidentifikasi 25 transkrip yang diekspresikan secara berbeda antara preeklamsia dan kelompok kontrol. Selanjutnya, kami menggunakan transkrip tersebut dan membuat jalur pipa untuk klasifikasi preeklampsia yang diawasi. Saluran pipa kami menghasilkan model regresi logistik menggunakan validasi silang 5 kali lipat pada banyak partisi acak ke dalam pelatihan dan set tes buta. Dengan menggunakan prosedur klasifikasi ini, kami mencapai nilai AUC rata-rata 0,86. Temuan ini menunjukkan nilai prediksi sirkulasi RNA non-coding kecil pada trimester pertama, menjamin pemeriksaan lebih lanjut, dan meletakkan dasar untuk memproduksi alat diagnostik awal non-invasif baru untuk preeklamsia, yang dapat mengurangi risiko yang mengancam jiwa untuk kedua ibu dan janin. reeklampsia (PE) adalah salah satu komplikasi kehamilan yang paling berbahaya, mempengaruhi 3-8% kehamilan; itu adalah penyebab utama kematian dan morbiditas ibu dan perinatal1,2. Ini terjadi pada trimester kedua atau ketiga, dan ditandai oleh de-novo pengembangan hipertensi bersamaan dengan baik proteinuria atau setidaknya satu fitur berat (trombositopenia, insufisiensi ginjal, gangguan fungsi hati, edema paru, gejala serebral atau visual) setelah kehamilan minggu 203. PE disebut "penyakit teori" yang mencerminkan kurangnya pemahaman tentang patogenesisnya. Beberapa mekanisme patofisiologi telah diusulkan dalam pengembangan PE, termasuk disfungsi endotelial4, jalur inflamasi5, stres oksidatif6, dan faktor angiogenik disregulasi7; meskipun masih tetap kurang dipahami8. Sudah umum diterima bahwa plasenta memiliki peran sentral dalam patogenesis PE, dan diasumsikan bahwa PE berasal dari plasentasi yang buruk, yang melibatkan suplai darah yang tidak memadai ke plasenta yang mengarah ke lingkungan hipoksia9-11. Oleh karena itu, meskipun penyebab PE belum jelas, orifinya adalah awal dan karenanya tes deteksi sudah layak pada minggu 10-1412,13. Dalam penelitian yang baru-baru ini diterbitkan, ditemukan bahwa pemberian aspirin dari 11 hingga 14 minggu kehamilan menghasilkan insiden PE yang lebih rendah dibandingkan dengan plasebo14. Selanjutnya, Rogerge dkk. menemukan bahwa efek aspirin dosis rendah untuk pencegahan PE hanya optimal ketika dimulai sebelum atau pada usia kehamilan 16 minggu15. Oleh karena itu, yang dapat diandalkan yang akan mendeteksi risiko yang lebih tinggi untuk mengembangkan PE pada tahap awal kehamilan, sebelum kehamilan minggu 16, sangat penting. Selama bertahun-tahun, banyak penelitian telah dicoba untuk menentukan biomarker dan target terapeutik untuk diagnosis dan pengobatan PE. Sejumlah karakteristik ibu telah diakui sebagai faktor risiko untuk mengembangkan PE, di antaranya etnis, usia, paritas, kehamilan ganda, dan riwayat PE pada kehamilan sebelumnya16-18. Selain itu, beberapa penanda biokimia potensial ditemukan untuk memprediksi dan mendiagnosis PE, termasuk faktor angiogenik / anti-angiogenik seperti fros-seperti kinase kinase 1 yang dapat larut (sFlt-1), faktor pertumbuhan plasental (PlGF), dan pertumbuhan endotel vaskular. faktor (VEGF) 19–21. Biomarkis biokimia potensial lainnya termasuk protein plasenta, hemoglobin janin bebas (HbF), dan penanda ginjal16. Selain itu, beberapa penanda mRNA potensial untuk PE ditemukan di maternal nal, di

antaranya gen antiangiogenik (seperti FLT1 dan endoglin), faktor hipoksia-inducible (seperti hif1α) dan corticotropin-releasing hormone22-24. Saat ini, tidak ada penanda yang terbukti konsisten, atau ada telah diimplementasikan dalam praktek klinis, akibatnya biomarker baru dan lebih baik untuk prediksi dini PE sangat dibutuhkan. RNA non-coding kecil (ncRNAs) adalah keluarga beragam molekul RNA yang tidak diterjemahkan (<200 nukleotida) yang merupakan bagian dari output genom yang terenkripsi25, 26. n nRNA kecil yang paling umum diketahui adalah mikroRNA (miRNAs), yang ~ 22 nukleotida panjang Molekul RNA yang mengatur ekspresi gen dengan memfasilitasi degradasi mRNA atau dengan menghambat translasi protein27. N nRNA kecil lainnya meliputi: RNA nukleolus kecil (snoRNA), yang memodulasi biogenesis dan aktivitas ribosom dengan modifikasi pasca-transkripsi RNA ribosom (rRNA) 28, 29; RNA nuklir kecil (snRNA), yang memfasilitasi mRNA splicing dan mengatur inisialisasi transkripsi-tion30,31; dan Transfer RNA (tRNA) ncRNA kecil yang paling melimpah - yang berperan dalam penerjemahan32. Peran ncRNA kecil pada penyakit manusia telah diteliti terutama dalam konteks regulasi ekspresi gen melalui miRNAs, dan telah dipelajari dengan baik dalam beberapa kondisi termasuk neurogenesis33, diabetes34, dan terutama kanker35–38. Namun demikian, penelitian terbaru menunjukkan bahwa disregulasi dari banyak jenis ncRNA kecil, selain miRNA, memiliki relevansi fungsional pada kanker serta pada kebanyakan penyakit manusia, dari gangguan neurologis hingga masalah kardiovaskular. 39,40. Penelitian yang muncul ini memperkuat asumsi bahwa ncRNA kecil memiliki peran yang jauh lebih besar dalam etiologi penyakit manusia daripada yang dipahami sebelumnya. Dalam PE, seperti pada penyakit lain, miRNAs telah menjadi nrRNA pertama yang keterlibatannya telah diselidiki. Teori yang diterima saat ini mengklaim bahwa PE dimulai dengan plasentasi abnormal yang mengarah pada respon ibu di inflamasi41. MiRNA memiliki peran penting baik dalam proses plasentasi42, dan dalam regulasi uterus dalam respons ammatory 43,44. MiRNA juga terkait dengan banyak mekanisme lain yang terkait dengan patogenesis PE termasuk angiogenesis45–48, hipoksia49,50, pengaturan tekanan darah51 dan diferensiasi sel, apoptosis, dan migrasi / remodelling46,52–55. Selain itu, dalam beberapa tahun terakhir, spesies miRNA yang berlimpah dan diungkap secara berbeda dalam sampel plasenta dari PE dan sampel kontrol telah dilaporkan 46,56-59, yang membuka kemungkinan untuk menemukan penanda baru yang efektif untuk diagnosis PE60. Selain itu, miRNAs beredar dalam darah ibu, yang terkait dengan risiko preeklampsia, diidentifikasi, pikir mereka ditemukan di dalam trimester kedua atau ketiga, munculnya gejala PE61-66. Saat ini tidak ada penanda yang ditemukan untuk diagnosis dini sebelum munculnya gejala. Hubungan potensial antara ncRNAs kecil dan PE saat ini lebih tentatif, berpikir beberapa ncRNA kecil telah dikaitkan dengan PE atau dengan mekanisme yang dikenal terlibat dalam patogenesis PE. Misalnya, salah pengaturan snoRNA baru-baru ini ditemukan pada plasenta wanita dengan PE67 yang parah. Selain itu, U1 snRNA ditemukan terkait dengan ammasi dengan menginduksi dalam rilis sitokin ammatory68. Dua jenis tRNA (tRNAVal dan tRNAGly) ditemukan untuk menghambat angiogenesis dengan memodulasi fungsi sel endotel69, dan pengaturan tRNA dan snRNA yang salah dideteksi pada sel yang dikultur di bawah kondisi hipoksia70. Secara keseluruhan, mereka dan bukti mengakumulasi lainnya menunjukkan bahwa miRNA serta ncRNA kecil lainnya mungkin memiliki peran dalam pengembangan PE dan dapat menjadi penanda potensial untuk diagnosis dini PE. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki kelimpahan sirkulasi ncRNA kecil dalam plasma ibu hamil di trimester pertama mereka, mencari transkrip yang paling baik memisahkan sampel PE dari wanita hamil yang sehat, dan dengan demikian dapat berfungsi sebagai biomarker potensial untuk diagnosis dini preeklampsia. .

Hasil Kami melakukan ncRNA kecil Sequencing Generasi Berikutnya dari PE dan sampel kontrol, dalam studi kontrol kasus bersarang, yang bertujuan untuk menemukan ncRNAs yang terbaik memisahkan PE dan sampel kontrol, dan untuk mengevaluasi nilai prediktif mereka untuk diagnosis dini PE. Karakteristik pasien. RNA diekstraksi dan ncRNA kecil disekuensing dari plasma dari 75 wanita hamil: 35 wanita yang mengembangkan PE onset dini (yaitu, PE yang berkembang sebelum 34 minggu kehamilan), dan 40 wanita dengan kehamilan uncomplicated normotensive (yaitu, satu set kontrol) . Semua wanita berada di akhir trimester pertama mereka (usia kehamilan 11 + 0-13 + 6 minggu). Yang penting, berbagai etnis dimasukkan dalam penelitian (lihat ringkasan karakteristik ibu pada Tabel 1). Semua wanita pada kelompok kontrol adalah wanita tanpa kondisi medis yang sudah ada sebelumnya, dengan kehamilan tanpa komplikasi yang menghasilkan pengiriman neonatus normal fenotipe normal dan dengan berat lahir normal untuk usia kehamilan saat melahirkan. Tak satu pun dari wanita-wanita ini memiliki riwayat hipertensi kronis. Kasus dan kontrol dicocokkan terkait usia ibu, nulliparitas, jenis kelamin janin, etnis dan status merokok. ey di ered signi cantly untuk rst trimester Mean arterial pressure (MAP) (p-value <0,0001), indeks pulserasi arteri uterus (UT PI) (p-value <0,0001), dan hipertensi kronis (p-value = 0,001), yang semua faktor risiko yang dikenal untuk pengembangan PE. Selain itu, kedua kelompok secara signifikan berbeda untuk keberadaan PE pada kehamilan sebelumnya yang merupakan faktor risiko juga, namun tidak ada hubungan antara ekspresi ncRNA yang bersirkulasi dan PE sebelumnya. Data hasil perinatal, (yaitu usia kehamilan saat melahirkan dan berat lahir) juga secara signifikan berbeda antara kelompok (p-value <0,001), karena awal-PE dan definisi kelompok kontrol. Analisis ekspresi diferensial. Masing-masing transkrip paling banyak dalam plasma perempuan diuji untuk ekspresi yang berbeda dalam PE vs sampel kontrol, dan 25 transkrip ditemukan secara berbeda dinyatakan (nilai p-yang disesuaikan <0,05, lihat Tabel 2 dan Gambar). 1): 16 transkrip diregulasi, dan 9 diregulasi ulang. Dari jumlah ini, 7 transkrip adalah tRNA dan rRNA yang dikodekan dalam mitokondria, 12 transkrip adalah mikroRNA, 4 transkrip yang panjang non-coding RNA (linc), satu transkrip adalah RNA ribosom dan satu transkrip diproses transkrip (yaitu, non-coding transkrip yang bukan milik salah satu kategori dalam Ensembl database). Kami menguji korelasi dari masing-masing transkrip yang diekspresikan secara berbeda dan gambaran klinis maternal, dan mengamati korelasi moderat namun signifikan antara miR-4433b dan 2 fitur klinis ibu: indeks pulsasi arteri uterina (UT PI; r = 0,395, p -value = 0,016), d

1425/5000 Pengontrolan Karakteristik (n = 40) PE (n = 35) p-nilai Umur ibu, tahun (IQR) 31,3 (25,9-34,6) 29,9 (28,1–34,5) 0,9200 Indeks Massa Tubuh, kg / m2 (IQR) 24,1 (22,6-28,7) 28,4 (24,4–31,7) 0,0125 Usia kehamilan, minggu (IQR) 12,8 (12,3–13,2) 12,7 (12,2–13,1) 0,3916 Panjang mahkota-pantat, mm (IQR) 63,9 (57,5–70,2) 62,9 (56,2–67,9) 0,3029 Mean arterial pressure (MAP), mm Hg (IQR) 83.2 (79.4-87.7) 97.1 (90.1-108.7) <0.0001

Indeks pulsasi arteri uterus (UT PI) (IQR) 1,5 (1,3–1,7) 2,5 (2–2,8) <0,0001 Usia kehamilan saat melahirkan, minggu (IQR) 39,8 (39,4–40,7) 31,4 (29,4–33,2) <0,0001 Berat badan lahir, g (IQR) 3,420 (3,198–3,578) 1,222 (951–1,565) <0,0001 Gender Janin, n (%) 0,65 perempuan 22 (55) 17 (42,5) laki-laki 18 (45) 18 (45) Etnisitas, n (%) 0,2848 Afro-Caribbean 15 (37,5) 19 (54,3) Asia Selatan 1 (2.5) 1 (2.9) Kaukasia 24 (60) 15 (42,9) Perokok rokok, n (%) 0,11 Tidak ada perokok 34 (85) 34 (97,1) Perokok 6 (15) 1 (2.9) Riwayat keluarga preeklampsia, n (%) 0,41 Ya 2 (5) 4 (11.4) No 38 (95) 31 (88,6) Paritas, n (%) 0,0018 Multiparous tanpa PE 15 sebelumnya (37,5) 6 (17,1) Multiparous dengan PE sebelumnya 0 (0) 8 (22,9) Nulliparous 25 (62.5) 21 (60) Hipertensi kronis, n (%) 0,001 Ya 0 (0) 8 (22,9) Tidak 40 (100) 27 (77,1)

Characteristic

Control (n =40)

PE (n =35)

Maternal age, years (IQR)

31.3 (25.9–34.6)

29.9 (28.1–34.5)

0.9200

Body Mass Index, kg/m2 (IQR)

24.1 (22.6–28.7)

28.4 (24.4–31.7)

0.0125

Gestational age, weeks (IQR)

12.8 (12.3–13.2)

12.7 (12.2–13.1)

0.3916

Crown-rump length, mm (IQR)

63.9 (57.5–70.2)

62.9 (56.2–67.9)

0.3029

Mean arterial pressure (MAP), mm Hg (IQR)

83.2 (79.4–87.7)

97.1 (90.1–108.7)

<0.0001

Uterine artery pulsatility index (UT PI) (IQR)

1.5 (1.3–1.7)

2.5 (2–2.8)

<0.0001

Gestational age at delivery, weeks (IQR)

39.8 (39.4–40.7)

31.4 (29.4–33.2)

<0.0001

Birth weight, g (IQR)

3,420 (3,198–3,578) 1,222 (951–1,565)

Fetal Gender, n(%)

<0.0001

0.65

female

22 (55)

17 (42.5)

male

18 (45)

18 (45)

Ethnicity, n(%)

0.2848

Afro-Caribbean

15 (37.5)

19 (54.3)

South Asian

1 (2.5)

1 (2.9)

Caucasian

24 (60)

15 (42.9)

Cigarette smokers, n(%)

0.11

No smoker

34 (85)

34 (97.1)

Smoker

6 (15)

1 (2.9)

Family history of preeclampsia, n(%)

0.41

Yes

2 (5)

4 (11.4)

No

38 (95)

31 (88.6)

Parity, n(%)

Multiparous with no previous PE

p-value

0.0018

15 (37.5)

6 (17.1)

Multiparous with previous PE

0 (0)

8 (22.9)

Nulliparous

25 (62.5)

21 (60)

Chronic hypertension, n(%)

0.001

Yes

0 (0)

8 (22.9)

No

40 (100)

27 (77.1)

bel 1. Karakteristik klinis PE dan kelompok kontrol. Perbandingan karakteristik ibu dan kehamilan antara kedua kelompok: wanita hamil yang telah mengembangkan preeklamsia (PE) dan wanita hamil dengan kehamilan tanpa komplikasi (kontrol). Nilai-P dihitung menggunakan tes pasti Fisher untuk variabel kategori, dan menggunakan uji Mann-Whitney U untuk variabel kontinu. Untuk memvalidasi ekspresi microRNAs yang diperoleh oleh sekuensing RNA kecil, kami menguji ve ekspresi microRNAs menggunakan qPCR di 14 sampel: 6 PE dan 8 kontrol. Kami menguji korelasi antara ekspresi microRNAs yang diperoleh dengan sekuensing dan oleh qPCR dalam sampel yang relevan, dan menemukan korelasi yang signifikan di semua mikroRNA yang diuji (lihat Tabel Tambahan S1), yang mengkonmisikan jumlah microRNA yang diperoleh dengan sekuensing. Untuk menilai 25 ekspresi transkrip yang diekspresikan secara berbeda di kemudian hari dalam kehamilan, setelah munculnya gejala PE, kami mengurutkan ncRNA kecil dalam plasma subset dari 40 wanita dalam minggu 20-22: 20 PE dan 20 kontrol. Karena ukuran set ini adalah setengah dari ukuran asli dan dengan demikian tidak bertenaga, dari 25 transkrip yang diekspresikan secara berbeda, hanya 9 transkrip yang secara signifikan diekspresikan dalam set terbatas 40 sampel tri-mester pertama (nilai p-disesuaikan) <0,05, lihat Tabel Tambahan S2). Pada trimester kedua, 4 transkrip dari 25 diekspresikan secara berbeda (nilai p yang disesuaikan <0,05, lihat Tabel Tambahan S3). Meskipun demikian, tidak ada transkrip yang menunjukkan perubahan PE yang signifikan dalam ekspresi di atas trimester (tes PE / trimester antar-aksi, lihat Tabel Tambahan S4). Hasil ini menunjukkan bahwa perubahan lipatan yang diamati pada trimester pertama dipertahankan selama trimester kedua juga, munculnya gejala PE, meskipun lebih banyak sampel dari kedua usia kehamilan diperlukan untuk menyelidiki lebih lanjut masalah ini. Klasifikasi Sampel Preeklamsia / Kontrol. Kami melanjutkan untuk membangun pipa umum untuk klasifikasi sampel PE, dan untuk memperkirakan kinerjanya. Karena tidak ada dari transkrip yang diekspresikan secara berbeda dapat sepenuhnya mendiskriminasikan PE dari sampel kontrol (lihat Gambar 1), kami memutuskan untuk menggunakan model multivariabel yang menggabungkan kemampuan yang berbeda dari beberapa transkrip dengan cara yang sinergis. Untuk tujuan ini, kami memilih untuk melatih model regresi logistik melalui prosedur validasi silang (CV) dan mengujinya pada set tes buta dalam proses iteratif (lihat Gambar 2). Dalam setiap siklus kami secara acak membagi set data sampel ke dalam satu set pelatihan dan satu set tes, dan kemudian melatih model regresi logistik menggunakan prosedur validasi lintas 5 kali lipat pada satu set pelatihan saja (lihat detail dalam Bahan dan Metode). Brie y, set pelatihan dibagi menjadi ve tumpang tindih dan ukuran yang sama besarnya, model regresi logistik dilatih pada empat himpunan bagian dan diuji pada bagian yang tersisa. adalah proses yang berulang kali. Fitur-fitur model e hanya terdiri dari ekspresi ncRNAs; di setiap langkah CV pemilihan fitur pra-proses dilakukan, yang termasuk analisis ekspresi yang berbeda hanya pada set pelatihan. Selain itu, di setiap langkah CV kami melakukan pencarian lengkap atas semua kemungkinan model. Kami membatasi

Transkrip Transkrip Menghitung

ID

Transkrip

Biotipe Rata-Rata Perubahan

Lipat

P-Nilai

Disesuaikan p-Nilai

mitochondrially encoded tRNA proline ENST00000387461 Mitochondrial tRNA 490 4.25 1.65 × 10−16 1.57 × 10−14 mitokondria dikodekan tRNA lysine ENST00000387421 Mitochondrial tRNA 433 2.27 3.43 × 10−6 1.63 × 10−4 microRNA 182 ENST00000385255 miRNA 1,325 0,54 5,45 × 10−6 1,73 × 10−4 microRNA 10b ENST00000385011 miRNA 7115 0,50 8,96 × 10−6 2,13 × 10−4 mucin 2, lendir oligomer / gel − membentuk ENST00000361558 transkrip diproses 901 2.34 1.68 × 10−5 3.19 × 10−4 microRNA 25 ENST00000384816 miRNA 5,585 0,61 5,38 × 10−5 6,39 × 10−4 RP11–259O2.3-001 ENST00000514519 lincRNA 409 2.97 4.92 × 10−5 6.39 × 10−4 microRNA 4433b ENST00000581329 miRNA 473 1,71 4,98 × 10−5 6,39 × 10−4 mitokondrially dikodekan tRNA histidine ENST00000387441 Mitochondrial tRNA 247 1.95 9.21 × 10−5 9.72 × 10−4 HELLP terkait panjang non-coding RNA ENST00000626826 makro lncRNA 729 2,02 1,08 × 10−4 1,03 × 10−3 microRNA 99b ENST00000384819 miRNA 344 0,65 1,57 × 10−4 1,31 × 10−3 microRNA 143 ENST00000385300 miRNA 1,632 0,62 1,66 × 10−4 1,31 × 10−3 mitochondrially encoded tRNA valine ENST00000387342 Mitochondrial tRNA 664 1,99 2,11 × 10−4 1,54 × 10−3 microRNA 151a ENST00000521276 miRNA 10,021 0,75 5,68 × 10−4 3,85 × 10−3 microRNA 191 ENST00000384873 miRNA 31,187 0,75 6,26 × 10−4 3,97 × 10−3 RNA, 5,8 S ribosomal pseudogene 4 ENST00000365096 rRNA 1,652 1,68 1,65 × 10−3 9,21 × 10−3 mitochondrially encoded tRNA serine 2 (AGU / C) ENST00000387449 Mitochondrial tRNA 1,250 1,72 1,61 × 10−3 9,21 × 10−3 microRNA 146b ENST00000365699 miRNA 1,323 0,75 2,67 × 10−3 1,41 × 10−2 microRNA 221 ENST00000385135 miRNA 587 1.44 3.97 × 10−3 1.98 × 10−2 mitokondrial dikodekan tRNA tirosin ENST00000387409 Mitochondrial tRNA 173 1,53 4,41 × 10−3 2,09 × 10−2 mitokondria dikodekan 16 S RNA ENST00000387347 Mitochondrial tRNA 6,218 1,63 4,82 × 10−3 2,18 × 10−2 microRNA let-7g ENST00000362280 miRNA 1.073 1.27 9.85 × 10−3 4.26 × 10−2 intergenic non-protein coding RNA 324 ENST00000315707 lincRNA 1.087 1.50 1.03 × 10−2 4.27 × 10−2 AC113133.1-201 (microRNA-486) ENST00000612171 Mirna 17,569 0,70 1,11 × 10−2 4,38 × 10−2 AC020956.3-001 ENST00000614316 lincRNA 902 1,71 1,18 × 10−2 4,47 × 10−2 Mean Transcript Biotype

Fold

Adjusted

Transcript

Transcript ID

Counts Change P-Value

p-Value

mitochondrially encoded tRNA proline

ENST00000387461 Mitochondrial tRNA

490

4.25

1.65 ×10−16 1.57 ×10−14

mitochondrially encoded tRNA lysine

ENST00000387421 Mitochondrial tRNA

433

2.27

3.43 ×10−6

1.63 ×10−4

microRNA 182

ENST00000385255 miRNA

1,325

0.54

5.45 ×10−6

1.73 ×10−4

microRNA 10b

ENST00000385011 miRNA

7115

0.50

8.96 ×10−6

2.13 ×10−4

mucin 2, oligomeric mucus/gel−forming

ENST00000361558 processed transcript

901

2.34

1.68 ×10−5

3.19 ×10−4

microRNA 25

ENST00000384816 miRNA

5,585

0.61

5.38 ×10−5

6.39 ×10−4

RP11–259O2.3-001

ENST00000514519 lincRNA

409

2.97

4.92 ×10−5

6.39 ×10−4

microRNA 4433b

ENST00000581329 miRNA

473

1.71

4.98 ×10−5

6.39 ×10−4

mitochondrially encoded tRNA histidine

ENST00000387441 Mitochondrial tRNA

247

1.95

9.21 ×10−5

9.72 ×10−4

HELLP associated long non-coding RNA

ENST00000626826 macro lncRNA

729

2.02

1.08 ×10−4

1.03 ×10−3

microRNA 99b

ENST00000384819 miRNA

344

0.65

1.57 ×10−4

1.31 ×10−3

microRNA 143

ENST00000385300 miRNA

1,632

0.62

1.66 ×10−4

1.31 ×10−3

mitochondrially encoded tRNA valine

ENST00000387342 Mitochondrial tRNA

664

1.99

2.11 ×10−4

1.54 ×10−3

microRNA 151a

ENST00000521276 miRNA

10,021

0.75

5.68 ×10−4

3.85 ×10−3

microRNA 191

ENST00000384873 miRNA

31,187

0.75

6.26 ×10−4

3.97 ×10−3

RNA, 5.8 S ribosomal pseudogene 4

ENST00000365096 rRNA

1,652

1.68

1.65 ×10−3

9.21 ×10−3

mitochondrially encoded tRNA serine 2 (AGU/C) ENST00000387449 Mitochondrial tRNA

1,250

1.72

1.61 ×10−3

9.21 ×10−3

microRNA 146b

ENST00000365699 miRNA

1,323

0.75

2.67 ×10−3

1.41 ×10−2

microRNA 221

ENST00000385135 miRNA

587

1.44

3.97 ×10−3

1.98 ×10−2

mitochondrially encoded tRNA tyrosine

ENST00000387409 Mitochondrial tRNA

173

1.53

4.41 ×10−3

2.09 ×10−2

mitochondrially encoded 16 S RNA

ENST00000387347 Mitochondrial tRNA

6,218

1.63

4.82 ×10−3

2.18 ×10−2

microRNA let-7g

ENST00000362280 miRNA

1,073

1.27

9.85 ×10−3

4.26 ×10−2

long intergenic non-protein coding RNA 324

ENST00000315707 lincRNA

1,087

1.50

1.03 ×10−2

4.27 ×10−2

AC113133.1-201 (microRNA-486)

ENST00000612171 miRNA

17,569

0.70

1.11 ×10−2

4.38 ×10−2

AC020956.3-001

ENST00000614316 lincRNA

902

1.71

1.18 ×10−2

4.47 ×10−2

Tabel 2. Diungkapkan secara jelas ncRNA kecil pada PE vs sampel kontrol. Setiap transkrip paling melimpah di dalam plasma wanita diuji untuk ekspresi yang berbeda dalam 35 PE vs. 40 sampel kontrol, dan 25 transkrip ditemukan diekspresikan secara berbeda (FDR disesuaikan p-value <0,05). ukuran model hingga maksimum enam transkrip, untuk menghindari over ting data dan karena penggunaan klinis praktis di masa depan. Model yang dipilih kemudian diterapkan pada bagian reaming dalam langkah CV dan tingkat kesalahan dihitung. Model yang memperoleh tingkat kesalahan terendah dalam semua langkah CV, kemudian diterapkan pada set tes buta dan kinerjanya dievaluasi. Kami mengulangi prosedur ini 100 kali, setiap kali dengan partisi acak untuk melatih dan menguji set, untuk meningkatkan stabilitas dan generalisasi hasil, dan untuk memperkirakan kebaikan prosedur pada kumpulan data buta baru. Dengan menggunakan prosedur ini, kami mencapai AUC rata-rata 0,86 (SE = 0,02) dan akurasi 0,76 (SE = 0,02). Sensitivitas rata-rata pada tingkat positif palsu 10% dan 5% adalah 0,45 (SE = 0,017) dan 0,28 (SE = 0,016) masing-masing. Gambar 3 menampilkan ringkasan pengukuran statistik yang dihitung untuk prosedur ini. Untuk tujuan memvalidasi pipeline komputasi, kami melakukan tes permutasi ke proses klasifikasi. Kami secara acak mengesampingkan kondisi sampel (yaitu, PE / kontrol) dan mengikuti langkah-langkah seperti yang dijelaskan di atas. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, statistik klasi kasi dalam tes permutasi didistribusikan secara normal dan mengikuti hasil klasifikasi acak, yang selanjutnya memperkuat efektivitas metode kami, dan menunjukkan nilai prediktif dari ncRNA yang bersirkulasi. Diskusi PE adalah gangguan multi-sistem terkait kehamilan muncul pada paruh kedua kehamilan, dan merupakan

penyebab utama mortalitas dan morbiditas ibu dan perinatal. Penyebab PE tidak diketahui, meskipun melibatkan pasokan darah yang tidak memadai ke plasenta yang mengarah ke lingkungan hipoksia9-11. PE tetap tidak dapat diprediksi dan didiagnosis hanya pada trimester kedua atau ketiga, akibatnya ada peningkatan permintaan untuk pemahaman yang lebih baik dari PE dan pengembangan tes diagnostik awal. Meskipun gejala klinis terlambat, PE dimulai dengan disfungsi plasenta pada trimester pertama, maka deteksi dini layak dilakukan pada minggu ke 10-1412. Mengembangkan prosedur skrining yang efisien non-invasif untuk mengidentifikasi wanita yang berisiko PE akan bermanfaat untuk pencegahan dini / pencegahan profilaksis. Metaanalisis yang dilaporkan baru-baru ini menunjukkan bahwa efek aspirin dosis rendah untuk pencegahan PE hanya optimal ketika dimulai sebelum atau pada usia kehamilan 16 minggu, maka wanita yang berisiko tinggi untuk PE harus diidentifikasi pada awal kehamilan15. Beberapa penanda biokimia dan mRNA potensial untuk PE prediksi awal sebelumnya dilaporkan16, meskipun tidak ada yang terbukti secara efektif memprediksi PE. NcRNA kecil memiliki peran penting dalam banyak proses seluler seperti regulasi gen, terjemahan, penyambungan, dan banyak lagi. Mereka dapat dimurnikan dari plasma ibu hamil trimester pertama dalam jumlah yang cukup untuk identifikasi dan kuantifikasi yang akurat, yang menunjukkan nilai potensial mereka sebagai biomarker untuk diagnosis dini PE non-invasif. Ough beredar miRNAs dalam darah ibu yang terkait dengan risiko preeklampsia yang diidentifikasi dalam tahap-tahap selanjutnya dari preg-nancy6166, saat ini tidak ada penanda seperti itu ditemukan untuk diagnosis dini sebelum munculnya gejala.

Gambar 1. Hasil normalisasi untuk transkrip yang diekspresikan secara berbeda dalam PE vs. sampel kontrol. Masing-masing transkrip paling melimpah di 35 PE vs 40 sampel kontrol diuji untuk ekspresi yang berbeda, dan 25 transkrip ditemukan diekspresikan secara berbeda (nilai p-p <0,05). Hitungan normal disajikan sebagai biola dan kotak kotak. Batas atas dan bawah kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25. Kumis atas dan bawah mewakili nilai maksimum dan minimum. Median ditandai dengan garis di setiap kotak. Pencilan ditunjukkan oleh lingkaran.

Dengan menggunakan analisis sekuensing RNA kecil, kami mengidentifikasi perubahan yang signifikan dalam kelimpahan ncRNA yang bersirkulasi dalam sampel plasma maternal kehamilan trimester pertama PE, dibandingkan dengan kehamilan tanpa komplikasi. Tujuh dari transkrip yang diatur sebelumnya (dan tidak ada yang diatur turun) adalah tRNA dan rRNAS yang dikodekan dalam mitokondria. Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa disfungsi mitokondria dimanifestasikan oleh stres oksidatif, gangguan diferensiasi, dan invasi trofoblast, yang telah dikaitkan dengan patho-genesis PE71-76. Apalagi Qiu dkk. menemukan bahwa kemungkinan PE berkorelasi positif dengan jumlah salinan DNA mitokondria dalam darah ibu77. Hasil kami menunjukkan bahwa selain mitokondria DNA, mitokond-drial non-coding RNA mungkin juga dikaitkan dengan perkembangan PE. Sejauh pengetahuan kami, ini adalah bukti pertama dari peningkatan kadar nRNA mitokondria pada plasma ibu pasien PE. Penelitian prospektif lebih lanjut diperlukan untuk menilai hasil ini dan untuk menyelidiki mekanisme melalui perubahan RNA mitokondria yang berperan dalam patogenesis PE.

Selanjutnya, 12 dari 25 transkrip yang diekspresikan secara berbeda adalah microRNA, yang paling penting yang sebelumnya terkait dengan mekanisme yang dikenal dalam patogenesis PE. Sebagai contoh, miR-10 turun-diatur dalam PE vs sampel kontrol, sesuai dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan penurunan regulasi miR-10 pada plasenta preeklampsia dibandingkan dengan plasenta normal dari kehamilan tanpa komplikasi59. MiR-10 secara langsung menargetkan reseptor faktor pertumbuhan endotel vaskular 1 (VEGF-R1, Flt-1) dan varian sambatan terlarutnya, sFlt-1, keduanya merupakan faktor anti-angiogenik78. Oleh karena itu, down-regulation miR-10 menyebabkan peningkatan ekspresi baik sFlt1 dan Flt-1, dan secara signifikan merusak perilaku angiogenik sel endotel manusia78. Telah diketahui bahwa angiogenesis adalah mekanisme utama yang terlibat dalam patogenesis PE. Baik sFlt-1 dan Flt-1 mengikat faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan faktor pertumbuhan plasenta (PlGF), yang memainkan peran kunci dalam mempromosikan angiogenesis. Sejumlah penelitian menemukan peningkatan kadar sFlt-1 dan penurunan kadar VEGF dan PlGF gratis sebelum timbulnya gejala klinis PE dalam sampel darah dari ibu hamil yang kemudian mengembangkan PE19,79,80, yang mendukung hasil kami menurunkan miR Ekspresi -10

Gambar 2. Diagram skematik dari ow kerja untuk sampel PE / kontrol klasifikasi. Data secara acak dibagi menjadi satu set pelatihan dan satu set tes. Prosedur validasi silang 5 kali lipat digunakan pada set pelatihan untuk mendapatkan model regresi logistik yang terbaik dari sampel yang ditetapkan dalam pelatihan, dan kemudian diuji pada set tes buta. adalah proses diulang 100 kali, setiap kali dengan partisi acak untuk pelatihan dan set tes, untuk meningkatkan stabilitas dan generalisasi hasil, dan untuk

memperkirakan kebaikan prosedur pada kumpulan data buta baru. Keakuratan klasifikasi dalam set tes buta dan statistik terkait dihitung dalam setiap iterasi, dan diringkas untuk evaluasi keseluruhan pipa. Sebagian besar sisa micoRNAs yang diekspresikan secara berbeda juga sebelumnya terkait dengan angiogenesis (miR-14345, miR-22147,48, dan miR-18246), serta mekanisme lain dalam patogenesis PE seperti dalam ammasi (miR-22181), hipoksia (miR-9949 dan miR-151a50), pengaturan tekanan darah (miR-14351) dan diferensiasi sel, apoptosis, dan migrasi / remodeling (miR- 14352, miR- 19153, miR18246, miR-2554, dan biarkan- 7 keluarga55). Selain itu, sama dengan miR-10, ekspresi miR-14382, 22183, -18246, -25 84, -151a85-87, dan -19184 yang telah terdeteksi pada plasenta dari kehamilan preeklamsi pada penelitian sebelumnya. Dua dari 12 microR-NAs yang bersirkulasi: mir- 18288 dan miR22166, juga ditunjukkan secara melimpah pada sampel plasma PE pada trimester ketiga. Selain itu, kami mengamati korelasi positif yang moderat namun signifikan antara miR-4433b dan 2 fitur klinis ibu, yang mungkin menunjukkan nilai prognostik untuknya. Dari sisa transkrip yang diekspresikan secara berbeda, 4 adalah panjang RNA non-coding (linc). Menariknya, HELLP terkait RNA non-coding panjang (LINC-HELLP) terlalu diekspresikan dalam PE vs sampel kontrol. Sindrom HELLP adalah penyakit terkait kehamilan, varian berat PE, menginduksi hemolisis, peningkatan enzim hati, dan kadar trombosit yang rendah pada ibu. LINC-HELLP adalah novel lincRNA yang baru-baru ini diidentifikasi ed89. Ini terlokalisasi di trofoblas luar biasa trimester pertama dan secara negatif mempengaruhi diferensiasi dari trofil-blasts90 ekstravili. Mutasi pada LINC-HELLP yang diidentifikasi dalam keluarga HELLP berdampak negatif pada trofoblas yang terjadi di seluruh dunia89, yang semuanya mendukung temuan kami. Karena heterogenitas PE dan sifat kompleks, kemungkinan tidak akan terdeteksi secara dini secara akurat oleh satu varia-ble. Memang tidak ada ncRNA yang diekspresikan secara jelas menampilkan pemisahan PE yang sempurna dan sampel kontrol, maka kami menggunakan model multivariabel yang menggabungkan beberapa transkrip untuk klasifikasi PE. Berdasarkan ekspresi ncRNA yang diekspresikan secara berbeda, kami membangun sebuah pipeline klasi kasi untuk PE, dan menampilkan e fi siensinya. Saluran pipa kami menghasilkan model regresi logistik yang dapat digeneralisasikan menggunakan validasi silang 5 kali lipat pada banyak

Gambar 3. Klasi kasi hasil pada set data nyata dan permutasi. Plot kepadatan pengukuran statistik yang diperoleh dengan 100 iterasi prosedur klasifikasi kami pada set data nyata (biru) dan permutasi (merah). Dataset nyata termasuk 35 sampel PE dan 40 sampel kontrol. Dataset permutasi mencakup sampel yang sama dengan shufing acak dari kondisi mereka (yaitu, PE / kontrol). Berarti ditunjukkan juga. Kepekaan: benar positif dari semua positif; Speci city: negatif sejati dari semua negatif; Akurasi: klasifikasi benar dari semua klasifikasi; Matthews's correlation coe cient (MCC): koefisien korelasi antara klasifikasi biner yang diamati dan diprediksi; AUC: area di bawah kurva ROC; Skor F1: mean presisi dan sensitivitas yang harmonis; Positive Likelihood Ratio: sensitivity / (1-speci city); Rasio Kemungkinan Negatif: (1-sensitivitas) / kota speci.

partisi acak ke dalam pelatihan dan set tes. Kami memilih prosedur pembelajaran mesin yang agak ketat untuk mengevaluasi klasifikasi, dengan menggunakan beberapa set tes buta yang dipilih secara acak, selain metode validasi silang. adalah prosedur yang memungkinkan kita untuk memperkirakan keakuratan klasifikasi yang diberikan kumpulan data baru yang tidak terlihat. Selain itu, kami melatih model kami pada sampel dari beberapa etnis untuk meningkatkan kemampuan generalisasi. Kami mengakui bahwa studi tambahan sangat penting untuk memvalidasi n nRNA yang diungkap secara berbeda, dan untuk menguji metode klasifikasi. studi validasi ose harus mencakup dataset yang lebih besar dengan sampel dari beberapa etnis dan negara lain. Temuan kami menunjukkan nilai prediksi sirkulasi ncRNA kecil di trimester pertama, dan menunjukkan aplikasi mereka dalam klasifikasi PE dan sampel kontrol. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah mengintegrasikan ke model fitur klinis lainnya dapat meningkatkan kinerjanya Studi kami memiliki beberapa keterbatasan, yang berasal terutama dari jumlah sampel yang relatif terbatas dalam dataset kami. Menggunakan dataset kecil untuk melatih dan menguji model prediksi dapat menyebabkan perkiraan kinerja yang terlalu tinggi. Untuk mengurangi efek ini, kami menerapkan prosedur validasi silang dalam 100 pengulangan dan menguji model pada berbagai tes tes acak luar. Namun demikian, kami mengakui hasil kami mungkin masih berlebihan, dan validasi lebih lanjut pada dataset independen diperlukan. Mendapatkan lebih banyak sampel dari berbagai asal-usul dan mengintegrasikan fitur klinis yang lebih prediktif, akan memungkinkan untuk meningkatkan generalisasi model kami, menguji kinerjanya, dan untuk lebih lanjut menyatakan ncRNA yang berbeda. Singkatnya, penelitian kami menunjukkan potensi sirkulasi ncRNA kecil sebagai biomarker yang terdeteksi dan akurat, yang harus divalidasi lebih lanjut dalam studi tambahan. Temuan kami meletakkan dasar untuk memproduksi alat diagnostik baru non-invasif untuk PE, yang akan berfungsi sebagai intervensi yang efektif, dan akibatnya, mengurangi risiko yang mengancam jiwa bagi ibu dan janin. Bahan dan metode Koleksi Sampel. adalah studi kasus-kontrol bersarang yang diambil dari skrining prospektif yang besar untuk hasil obstetrik yang merugikan pada wanita yang menghadiri kunjungan rutin pertama di rumah sakit mereka di kehamilan di King's College Hospital, Inggris. adalah kunjungan, yang diadakan pada kehamilan 11 + 0 hingga 13 + 6 minggu, termasuk (1) pencatatan karakteristik ibu, riwayat medis dan pengukuran klinis (2) pengumpulan sampel darah. Usia kehamilan ditentukan dari mahkota-rump length91 janin. Periode studi prospektif adalah dari Oktober 2006 hingga Januari 2013. Kasus PE dipilih secara acak, dan setiap kasus dicocokkan dengan kontrol yang diambil sampelnya pada hari yang sama atau berikutnya. adalah penelitian yang terdiri dari 75 wanita hamil: 35 wanita yang mengembangkan

awal-PE (yaitu, 34 minggu kehamilan) dan 40 wanita sehat dengan kehamilan tanpa komplikasi (yaitu, kontrol set). Semua wanita yang mengatur kontrol diberikan pada neonatus neonatus normal dan dengan berat lahir antara 5 dan 95 per sentiles untuk usia kehamilan saat melahirkan. Tak satu pun dari wanitawanita ini memiliki riwayat hipertensi kronis. Untuk bagian dari 40 wanita, sampel darah diambil juga pada trimester kedua (minggu ke 20 + 0-23 + 6). Para wanita memberikan informed consent tertulis untuk berpartisipasi dalam penelitian, yang disetujui oleh Komite Etika Penelitian NHS. Semua metode dilakukan sesuai dengan pedoman dan peraturan yang relevan. Data tentang hasil kehamilan dikumpulkan dari catatan rumah sakit bersalin atau praktisi medis umum wanita. Semua catatan kebidanan dari semua wanita dengan hipertensi yang sudah ada sebelumnya atau yang berhubungan dengan kehamilan diperiksa untuk menentukan apakah kondisi tersebut adalah preeklampsia, sebagaimana didefinisikan oleh Masyarakat Internasional untuk Studi Hipertensi pada Kehamilan92. Kit, dan quanti ed menggunakan spektrofotometer NanoDrop (ND-1000). Parameter absorbansi spektrofotometri dari sampel adalah: 260 / Ekstraksi nikNA Kecil dan Sequencing. RNA diekstrak melalui miRNeasy Serum / Plasma 280 nm ~ 1.8 dan 260/230 nm ~ 1.8. Pustaka RNA kecil disiapkan untuk pengurutan mendalam menggunakan kit persiapan sampel RNA kecil TruSeq Illumina. Selama proses ini, sampel diikat dengan 3 ′ dan 5 ′ adapter, reverse-ditranskrip dan kemudian diamplifier menggunakan PCR. Perpustakaan cDNA disiapkan dari 140-160 bp produk PCR (mewakili 20-40 n RNA molekul) dan diurutkan di jalur terpisah pada instrumen Illumina HiSeq 2500 di Satuan Sequencing urutan tinggi Technion. Sequencing Reads Profiling dan Analisis Ekspresi Diferensial. Pembacaan urutan dianalisis sebagai berikut: \ 1. \ alat fastq-mcf (http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqMcf) digunakan untuk kliping sekuens adaptor, kualitas rendah (yaitu, kualitas 30) mendasarkan pemangkasan dan penyaringan singkat membaca (yaitu, membaca dengan kurang dari 16 nt). \ 2. \ Pembacaan dipetakan terhadap ensembl database untuk ncRNAs manusia rilis 8393 menggunakan Burrows – Wheeler transform based alignment tool (BWA) 94. Hanya dipetakan secara unik membaca hingga 2 ketidaksesuaian dianggap. \ 3. \ Analisis ekspresi yang berbeda: Kami pertama kali melakukan analisis komponen utama (PCA) menggunakan metode prcomp dalam plot R. A PCA (yaitu, plot yang menunjukkan sampel dalam bidang dua dimensi yang dibentangkan oleh dua komponen utama mereka) digunakan untuk menemukan variasi yang tidak diinginkan hadir dalam data (yaitu, efek batch), dan untuk mendeteksi sampel outlier. adalah analisis menunjukkan adanya dua sampel outlier, yang dihapus dari analisis hilir, dan efek batch yang cocok dengan tanggal dari proses sampel dan sekuensing. Tujuan umum kami adalah untuk menemukan biomarker potensial untuk deteksi dini PE, oleh karena itu kami berfokus pada transkrip yang memiliki ekspresi substansial, dan mencari mereka yang diekspresikan secara berbeda. Kami menerapkan DESeq295 (dalam R) pada 100 transkrip paling banyak untuk mendapatkan daftar transkrip yang berbeda antara sampel kontrol dan PE. Kami memasukkan variabel batch dalam desain DESeq2 untuk mengoreksi efek batch. Hanya transkrip dengan p-value <0,05 per tingkat kesalahan penemuan palsu (FDR) yang dipertimbangkan. \ 4. \ e ekspresi transkrip yang diekspresikan secara berbeda dalam set terbatas 40 wanita dibandingkan antara trimester pertama dan kedua menggunakan DESeq295. Kami pertama kali melakukan analisis ekspresi yang berbeda pada set terbatas di setiap trimester secara terpisah seperti yang dijelaskan di atas. Kami kemudian menggabungkan sampel trimester pertama dan kedua dan menggunakan formula desain yang memodelkan kondisi (yaitu, PE / kontrol) perbedaan pada trimester pertama, perbedaan selama

trimester, dan kondisi-kondisi tertentu di atas trimester ( yaitu, kondisi term-termaksi: trimester). Kami melakukan tes kemungkinan rasio dengan model yang dikurangi yang tidak mengandung istilah interaksi, untuk menguji apakah kondisi menginduksi perubahan ekspresi gen pada trimester kedua dibandingkan dengan trimester pertama. Hanya transkrip dengan p-value <0,05 per tingkat kesalahan penemuan palsu (FDR) yang dipertimbangkan. Klasifikasi Sampel. Tujuan kami adalah untuk membangun klasifikasi umum dan memperkirakan kinerjanya. Untuk tujuan ini kami memilih untuk menggunakan regresi logistik dalam prosedur validasi silang (CV). Untuk mendapatkan model yang lebih dapat digeneralisasikan, konsep validasi silang diterapkan 100 kali. Dalam setiap siklus kami membagi sampel ke dalam pelatihan dan set tes, dan menerapkan CV 5 kali lipat pada set pelatihan. Yaitu, set pelatihan dibagi menjadi 5 himpunan bagian yang tidak tumpang tindih dan berukuran sama, model regresi logistik dilatih pada 4 himpunan bagian dan diuji pada bagian yang tersisa. proses diulang 5 kali, sehingga semua himpunan bagian digunakan sebagai himpunan tes di setiap langkah. Kami telah menerapkan prosedur pemilihan fitur di setiap siklus CV dan mempersempit daftar transkrip ke transkrip yang diekspresikan secara berbeda yang memiliki ekspresi substansial dalam subset saat ini (yaitu, dalam 100 besar transkrip paling banyak). Kami kemudian mengumpulkan transkrip yang sangat berkorelasi (yaitu, korelasi Pearson> 0,7) dan jumlah dinormalkan menggunakan DESeq295. Efek batch telah dihapus menggunakan metode ComBat dari paket SVA di R96,97, yang menyesuaikan untuk batch yang dikenal menggunakan kerangka kerja Bayesian empiris. Untuk pemilihan model kami telah menggunakan paket glmulti di R98, yang melakukan pencarian lengkap atas semua model yang mungkin, t setiap model ke set saat ini menggunakan glm dan peringkat mereka dengan kriteria informasi Akaike (AIC). Model e kemudian diterapkan pada reaming subset (yaitu, set tes batin) dan tingkat kesalahan dihitung. e model yang memperoleh tingkat kesalahan terendah dalam semua langkah CV, dipilih dalam setiap iterasi dan diuji pada tes luar. Dalam 100 iterasi kami menghitung sensitivitas rata-rata, spesifik kota, area di bawah kurva karakteristik operasi penerima (AUC) dan statistik terkait. Semua statistik kinerja dikalkulasi dari hasil prediksi pada tes luar yang ditetapkan dalam 100 iterasi. Sensitivitas pada 10% dan 5% false positive rates dihitung menggunakan validasi lintas 5 kali lipat di semua sampel dan rata-rata lebih dari 100 iterasi Reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) Validasi. RT-qPCR dilakukan ke valitanggal miRNAs yang dinyatakan secara berbeda diperoleh oleh RNA-Seq kecil menggunakan PE dan sampel kontrol. RNA diekstraksi melalui MiRNeasy Serum / Plasma Kit. The Terapan Biosystems ™ TaqMan ™ Advanced MiRNA Assay (Terapan Biosystems; ermo Fisher Scienti c, Inc.) digunakan untuk menguji ekspresi Mirna. PCR amplifikasi dan pembacaan dilakukan dengan Sistem PCR TimeOne ™ Real-Time (Teknologi Life; ermo Fisher Scientific, Inc.). Nilai ekspresi dihitung menggunakan metode siklus threshold pembanding99, dan dinormalkan dengan konsentrasi cDNA. Kami menggunakan konsentrasi cDNA sebagai faktor normalisasi karena konsentrasi RNA awal tidak terdeteksi menggunakan sistem NanoDrop atau Qubit, dan karena tidak adanya priori yang dikenal stabil miRNA normalisasi. Konsentrasi e cDNA diukur menggunakan QuBit dsDNA quanti cation system dan high assay reagents assay (Invitrogen). Koefisien korelasi momen produk Pearson dihitung menggunakan metode cor.test di R antara sekuensing penghitungan normalisasi dan nilai normalisasi QPCR (2 − Ct). Sampel outlier dihapus dari perhitungan korelasi karena masalah dalam ekstraksi RNA untuk sekuensing (satu sam-ple) atau karena hasil anomali di RT-qPCR (2 sampel). Ketersediaan data. Data yang dihasilkan selama dan / atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis yang sesuai atas permintaan yang wajar.