Praktikum I Mikro.docx

PRAKTIKUM I STERILISASI TUJUAN -

Mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi, tyndakisasi

-

Mahasiswa mampu melakukan kerja aseptis.

A. PENDAHULUAN Sterilisasi adalah proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan (termasuk virus). Semua material sebagai subjek proses ini disebut sebagai bahan yang steril. Istilah steril tidak menggambarkan suatu bahan mutlak steril namun lebih tepatnya hampir tidak terdapat kehidupan karena steril tidak dapat dipastikan. Ketika sejumlah mikroorganisme terpapar terhadap suatu perlakuan sterilisasi seperti panas atau sinar UV, mereka tidak akan mati secara langsung spontan melainkan akan mati secara bertahap. secara teoretis dampak sterilisasi terhadap jumlah mikroorganisme yang homogen yaitu akan mematikannya secara eksponensial dengan kecepatan yang seragam. a. Pemanasan Dampak pemanasan terhadap kematian mikroorganisme sangat tergantung kepada suhu dan lama waktu sterilisasi. Panas menyebabkan enzim-enzim berhenti bekerja dan sel dapat kekurangan air. endospora bakteri lebih tahan panas daripada sel vegetatif, tetapi semua bentuk endospora tidak memiliki ketahanan yang sama persis terhadap panas. Misalnya endospora B.subtilis dapat dimatikan dengan pemanasan 100°C dalam waktu pendek, sedangkan endospora B.stearothermophilus dapat bertahan dalam air mendidih berjam-jam. b. Dengan api langsung Pemijaran dapat langsung membunuh mikroorganisme (termasuk endospora) yang disterilkan dengan cara membakar mikroorganisme sehingga cara ini adalah cara paling cepat. Namun kekurangannya adalah sangat terbatasnya cakupan alat yang disterilisasi menggunakan pemijaran dan ketidakpraktisan dalam mensterilisasi alat berukuran besar. Alat yang dipakai untuk sterilisasi dengan api yaitu: c. Bunsen burner, loop incinerator dan pembakar spirtus

Bunsen burner dan pembakar spirtus digunakan untuk sterilisasi alat inokulasi dengan pembakaran seperti sterilisasi jarum inokulum atauspreader. Untuk memastikan

kesterilannya

jarum

inokulum

dibakar

sampai

membara

dan spreader dapat dicelupkan alkohol lalu dibakar. Bunsen burner berbahan bakar gas yang disalurkan melalui pipa sedangkan pembakar spirtus berbahan bakar spirtus (methanol). Namun pembakar spirtus lebih mudah ditemukan di banyak laboratorium karena efisien dan portable. Tersedia juga alat loop incinerator / electric bunsen burner / electric incinerator untuk membakar jarum inokulum. Ujung jarum inokulum dapat dimasukkan ke dalam tabung keramik panas (815oC) selama 6 detik untuk mensterilisasinya Pembakar spirtus dapat menciptakan sirkulasi udara dari bawah ke atas melewati api karena proses pembakaran. Seringkali hal ini dianggap mampu menciptakan lingkungan udara yang aseptis disekitar pembakar spirtus, tetapi jika memang load kontaminasi besar dan banyak gangguan aliran udara maka hal ini juga tidak sepenuhnya benar. Oleh karena itu sebaiknya tetap menggunakan LAF jika menginginkan kerja pada udara yang steril. Bunsen burner dapat menimbulkan api dan aliran udara yang besar. Penggunaan pembakar spirtus atau bunsen burner tidak disarankan dalam protective cabinet. Namun jika terpaksa diperlukan maka api diatur menjadi kecil sehingga tidak mengganggu aliran udara . Gas torch Gas torch atau pembakar api portabel berbahan bakar gas sangat berguna saat dilakukan pengambilan sampel diluar laboratorium. Fungsinya adalah untuk mensterilisasi sample point yang dapat berupa kran, pipa atau yang lainnya sebelum pengambilan sampel dilakukan. Selain itu dapat digunakan untuk sterilsasi dengan api pada berbagai alat karena gas torch lebih nyaman digenggam dibandingkan pembakar bunsen atau pembakar spirtus.



Panas kering Mikroorganisme akan mengalami kekeringan jika dipaparkan pada suhu tinggi

dan akibatnya sel akan lisis dan mati. Kekurangan sterilisasi panas kering yaitu masih bertahannya endospora bakteri. Alat yang dipakai untuk sterilisasi panas kering yaitu: a. Oven Oven adalah suatu wadah yang mampu menjaga suhu pada 160-170 °C. Umumnya alat-alat yang disterilisasi dengan oven adalah alat gelas seperti cawan atau pipet ukur dan bukan untuk alat plastik atau karet. Sterilisasi dapat dilakukan pada suhu 170oC selama 1 jam. Waktu sterilisasi dihitung setelah oven mencapai suhu yang diinginkan. Oven yang baik memiliki termostat dan termometer atau alat perekam temperatur, dan juga dilengkapi indikator waktu dan pemprograman waktu. Setelah disterilisasi peralatan gelas sebaiknya didinginkan pada oven untuk mencegah keretakan karena penurunan suhu mendadak. Untuk pengecekan kinerja oven (verifikasi) dapat dilakukan dengan pengujian kehomogenan temperatur di seluruh sudut oven pada pemakaian pertama atau setelah adanya perbaikan. Verifikasi ini dilakukan dengan termometer terkalibrasi. Berbeda sedikit dengan peraturan ISO, Collins et al. (2004:46) menyatakan bahwa sterilisasi panas kering dilakukan pada suhu 160oC selama 2 jam atau 180oC selama 30 menit dengan waktu pemanasan (heating-up) selama 1 jam dan waktu penurunan suhu (cooling down) selama 2 jam. Oven dan inkubator memiliki perbedaan mendasar yaitu oven dilengkapi dengan lubang pengeluaran uap air dan umumnya tidak memiliki tutup kaca. Oleh karena itu penggunaan oven sebagai inkubator (walaupun oven dapat menjaga suhu yang diinginkan) akan mempercepat kehilangan air pada media. Peletakan alat-alat pada oven sebaiknya memperhatikan distribusi panas yang dihasilkan elemen. Disarankan untuk menghindari loading yang terlalu banyak dan penempatan tanpa jeda sehingga mampu mengurangi penetrasi panas. Semua alat sebaiknya dibungkus dengan bahan yang tidak mudah meleleh terkena panas seperti kertas sampul (kraft paper) bukan dengan plastik.

b. Microwave oven Microwave oven adalah alat yang mampu memanaskan dengan gelombang mikro pada tekanan atmosfer. Penggunaan alat ini selain untuk sterilisasi peralatan gelas dapat juga untuk memanaskan bahan cair atau mencairkan agar. Distribusi gelombang

mikro

sebaiknya

harus

homogen

untuk

mencegah

adanya

area overheating. Pemanasan dengan waktu lebih lama dengan pengaturan power rating yang rendah atau alat yang dilengkapi pemutar otomatis akan menghasilkan distribusi panas yang lebih baik. Jangan menggunakan peralatan metal (termasuk tutup yang terbuat dari besi), jika terdapat bahan ini maka dilepaskan terlebih dahulu sebelum disterilisasi. Media yang mengandung bahan tidak tahan panas sebaiknya jangan dipanaskan menggunakan alat ini kecuali jika telah terverifikasi dan terbukti dengan baik. Sebaiknya microwave oven tidak untuk sterilisasi media, sterilisasi media tetap menggunakan autoklaf. Stelah pemanasan menggunakan alat ini disarankan juga untuk didiamkan selama 5 menit sebelum dikeluarkan. 

Uap air panas Cara uap air panas membunuh mikroorganisme adalah bukan dengan

mengeringkannya

tetapi

dengan

menonaktifkan

enzim-enzimnya

sehingga

metabolisme berhenti bekerja. alat-alat yang menggunakan cara ini untuk sterilisasi antara lain: a. Steamers dan boiling water baths Steamers dan boiling water baths adalah semua alat yang terdiri dari suatu wadah untuk menampung air yang memiliki elemen pemanas dan bertutup (closefitting lid). Uap air yang dihasilkan alat ini berada pada tekanan atmosfer. Boiling waterbath mampu memanaskan air sampai atau hamper mendekati titik didih dengan atau tanpa menghasilkan uap air. Penggunaan umum alat ini adalah untuk mencairkan media agar atau membuat media tidak tahan panas dan tekanan. Hal yang perlu dipastikan saat pengoperasiannya adalah penjagaan batas air minimal sesuai manual sehingga menutupi elemen pemanas. pencairan kembali media agar steril dapat dilakukan pada waterbath suhu 47-50 °C. Media di angkat segera setelah semuanya mencair dan digunakan tidak melebihi waktu simpan 4 jam. Steaming (tyndallization) yang dikembangkan oleh John Tyndall adalah istilah untuk cara sterilisasi dengan uap air panas yang dapat mencapai suhu 100°C pada

wadah tanpa tekanan. Sterilisasi menggunakan uap air panas dapat dilakukan sekali atau tiga kali (tahap) dengan hari yang berlainan dengan memanaskannya pada 80 °C selama satu jam (Barrow dan Feltham 1993:14). Sedangkan menurut Hogg (2005:341) tindalisasi dilakukan pada suhu 90-100 °C selama 30 menit secara bertahap 3 kali. Selama jeda tahapan media diinkubasi pada 37°C semalam. Pemanasan tiga tahap dimaksudkan untuk memberi kesempatan endospora untuk berkecambah sehingga akan mati pada tahap pemanasan selanjutnya. Pasteurisasi adalah proses yang hampir sama namun lebih tepat digunakan untuk susu dan produk susu. Pasteurisasi tidak membunuh semua mikroba yang terdapat pada susu namun menguranginya sehingga akan lebih tahan lama disimpan. Bakteri thermoduric memiliki kemungkinan bertahan hidup lebih besar saat pasteurisasi. Pasteurisasi terdapat dua cara yaitu metode lama (yang dikembangkan oleh Louis Pasteur), dengan memanaskan susu pada 63 C selama 30 menit atau dengan flash pasteurisasi (HTST-High Temperature Short-Term) yaitu pemanasan cepat pada 72oC selama 15 detik kemudian didinginkan dengan cepat (Prescot et al. 2002:142). b. Uap air panas bertekanan Uap air panas bertekanan lebih efisien dan penetratif dalam membunuh mikroorganisme. Tekanan yang paling efisien yaitu 103 kpa (15 psi) selama 15 menit yang dapat dilakukan oleh autoklaf. c. Autoklaf (Autoclave) Menurut Morello et al. (2003:81) tekanan yang digunakan untuk sterilisasi pada umumnya 15 Psi atau sekitar 1 atm dan dengan suhu 121 oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan adalah 15 menit pada suhu 121oC. Dengan syarat suhu, tekanan dan waktu tersebut maka segala bentuk mikroorganisme dapat dimatikan. Autoklaf menggunakan uap air murni (lebih ringan dan lebih panas dari udara) untuk sterilisasi sehingga udara yang terdapat dalam wadah harus dikeluarkan. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan

udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga sama dengan tekanan atmosfer. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan turun sampai nol. Hal yang sering keliru adalah dengan menutup semua katup rapat-rapat sebelum udara dalam wadah digantikan oleh uap air. Adanya udara dalam wadah saat sterilisasi dapat mengakibatkan kurang efisiennya sterilisasi. Autoklaf hanya dapat mencapai suhu maksimal pada kondisi uap air murni. Autoklaf sebaiknya dilengkapi dengan: 1. Paling tidak memiliki satu katup pengaman 2. Alat pengatur yang mampu menjaga suhu dengan kisaran ± 3 °C dari temperatur yang diinginkan. 3. Probe suhu. 4. Alat pencatat waktu dan suhu dan 5. Saluran pembuang (ISO7128 2007:11-12). Sebagian besar media sangat terpengaruh oleh pemanasan yang berlebihan, tetapi sterilisasi menggunakan autoklaf adalah cara yang paling memuaskan untuk sterilisasi media atau bahan yang tahan panas lebih dari 100oC. Kombinasi waktu dan tekanan untuk sterilisasi media umumnya menggunakan suhu 115 °C (0.69 kg/cm2) selama 20 menit atau 121 °C (1.06 kg/cm2) selama 15 menit. Penetrasi suhu dan tekanan akan semakin menurun pada volume yang besar. Oleh karena itu jika mensterilisasi cairan melebihi 1L disarankan untuk melebihkan waktu sterilisasi. Wadah seperti tabung, erlenmeyer, botol sebaiknya diberi ruang kosong (head space) antara mulut wadah dengan batas cairan. Setelah selesai sterilisasi sebaiknya alat dan bahan dibiarkan dingin sampai 80oC di dalam autoklaf sebelum diangkat . Prosedur/teknik aseptis a. Mensterilkan meja kerja b. Memindahkan biakan c. Menuang media d. Pipetting

B. ALAT & BAHAN -

Alat

1. Erlenmeyer 2. Beaker glass 3. Batang pengaduk 4. Petridish 5. Incubator 6. Oven 7. Autoklaf 8. Luminar air flow

C. CARA KERJA Sterilisasi dengan udara kering (Oven) a) Menyumbat mulut alat-alat yang akan disterilkan dengan kapas atau tutup sekrup. b) Meletakkan di atas rak dengan rapi. c) Menutup rapat dengan mengencangkan sekrup, menekan tombol “on”, menunggu sampai suhu menaik secara perlahan. d) Apabila suhu telah mencapai 1700C, lalu mengatur tombol “timer” pada angka 2 (yang berarti 2 jam). e) Sterilisasi dengan uap panas bertekanan (Autoclave) 1. Menyiapkan alat atau bahan yang akan disterilkan, mengisi autoclave dengan air. 2. Memasukkan alat dan bahan yang akan disterilkan dan menyusun dengan rapi. 3. Mengencangkan semua sekrup, menyalakan kompor dan membiarkan katup pengatur uap terbuka sampai uap air banyak yang keluar. 4. Menutup katup uap sehingga tekanan perlahan naik hingga mencapai 2 atm dan suhu mencapai 1210C selama 15 menit. 5. Mematikan

kompor,

melonggarkan sekrup.

membiarkan

dingin,

kemudian

D. HASIL PENGAMATAN E. PEMBAHASAN Sterilisasi adalah suatu proses dimana kegiatan ini bertujuan untuk membebaskan alat atau bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu bahan atau alat bisa dikatakan steril apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun tidak, baik dalam bentuk vegetatif ataupun bentuk non-vegetatif (spora). Sebelum melakukan percobaan atau praktikum mikrobiologi khususnya pada praktikum penanaman (inokulasi) mikroba, atau pada penelitian-penelitian lainnya mengenai mikroba, alat yang digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu untuk menghindari kontaminasi dari maikroba atau zat-zat lain yang menempel pada bahan atau alat yang akan digunakan. Adapun metode sterilisasi yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu sterilisasi pemanasan basah, yaitu dengan menggunakan autoklaf.

Adapun pembahasan pada praktikum kali ini adalah :

1.

Persiapan alat yang akan di sterilisasi dengan autoklaf, yaitu pertama perlakuan

pada tabung reaksi yaitu dengan menyumbat lubang tabung reaksi dengan menggunakan kapas sepadat mungkin tetapi masih dapat dibuka (kapasnya, tidak menyumbat selamanya). Lalu kedua perlakuan pada cawan petri yang akan di sterilisasi juga menggunkan autoklaf yaitu dengan membungkusnya menggunakan kertas koran pada seluruh permukaan cawan petri dengan rapi. Lalu alat-alat tersebut pun siap untuk di sterilisasi dengan autoklaf.

2.

Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Prinsip kerja autoklaf adalah

menggunakan uap air bertekanan untuk mensterilisasikan suatu benda dengan mengkoagulasikan protein pada bakteri sehingga bakteri akan mati.

Sterilisasi

menggunakan autoklaf ini termasuk kedalam sterilisasi panas basah karena menggunakan uap air bertekanan dalam proses men-steril-kan benda nya. Sterilisasi basah ini dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu

yang berkisar antara 110°C dan 121°C. Bahan-bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini antara lain medium biakan yang umum, air suling, peralatan laboratorium, biakan yang akan dibuang, medium tercemar, dan bahan-bahan dari karet. Ada 4 hal utama yang harus diingat bila melakukan sterilisasi basah, yaitu : a. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betulbetul dari ruang autoklaf (sterilisator). b. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkenai uap,karena itu tabung dan labu kosong harus diletakan dalam posisi tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya. c. Bahan-bahan yang berpori atau berbentuk cairan harus permeabel terhadap uap. d. Suhu sebagaimana yang terukur oleh termometer harus mencapai 121°C dan dipertahankan setinggi itu selama 15 menit.

F. KESIMPULAN Dapat diambil kesimpulan pada praktikum kali ini adalah dapat mengetahui cara sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi, tyndakisasi, serta mampu melakukan kerja dengan aseptis.

G. DAFTAR PUSTAKA 

Imamkhasani. 2000. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme. UI Press; Jakarta.



Mored. 2005. Penuntun Dasar-Dasar Kimia. Lepdikbud; Jakarta.



Sudarmadji. 2005. Penuntun Dasar-dasar Kimia. Lepdikbud; Jakarta.



Walton. 1998. Kamus Istilah Kimia Analitik Indonesia. Pusat Pembinaan.



Abdullah mikrajuddin ;Buku fisika SMA dan MA jilid 1 utk kelas x ; 2006; gelora aksara pratama ß menjawab bagian-bagian mikroskop



J. Pelczar, 1986. Mikrobiologi fourt edition, New York, Me Graw Hill Book Company



Nur Muhammad, 2006. Mikrobiologi umum. THP Universitas Brawijaya. Gramedia



Schelegal,1994. Mikrobiologi umum edisi ke enam. FMIPA ITB Bandung. UGM Press



Waluyo, 2008. Teknik metode dasar mikrobiologia. Jakarta. Umum press



Zubaidah, Elok. 2006. Diktat kuliah mikrobiologi umum. THP Universitas Brawijaya. Gramedia press