Practicas De Biologia Molecular

PRACRICA 1 PREPARACION DE SOLUCIONES El propósito de esta práctica es ayudar al estudiante a entender los principios de preparación de las soluciones. Al final de esta práctica el estudiante será capaz de preparar soluciones porcentuales, normales y molares. SOLUCIONES: La concentración de una solución se define como la masa de soluto disuelta en una unidad de solvente o solución. SOLUCION VALORADA: Es una solución donde se expresa cuantitativamente la relación entre soluto y solvente o solución. Las soluciones generalmente se clasifican en: • • • •

Porcentual Molaridad Molalidad Normalidad o formalidad

Para poder realizar matemáticamente estas soluciones debemos conocer los factores de conversión y la regla de 3 simple. Unidad de peso 1 gr =1000 mg 1 mg =1000 ug 1 ug =1000 ng 1 ng =1000 pgr 1 p =1000 f

Unidad de volumen 1L = 1000 ml 1ml= 1000 ul

Regla de tres simple Base para las conversiones: 1 gr=1000 mg =50 mg ¿a cuanto equivale en gr? (50 mg) (1 gr) / 1000 mg = 0.05 gr

SOLUCIONES PORCENTUALES PROCIENTO DE PESO: Se define como los gramos (gr) de soluto disuelto en 100 gr de solución % Peso: gr de soluto * 100 gr de solución gr de solución: gr de soluto más mililitros de solvente PORCIENTO DE VOLUMEN: Se define como los mililitros (ml) de soluto disuelto en 100 ml de solución %V=ml de soluto * 100 ml de solución ml de solución: ml de soluto más mililitros de solvente PORCIENTO PESO/VOLUMEN: Se define como los gramos de soluto disuelto en 100ml de solución % P/V: gr de soluto * 100 ml de solución SOLUCIONES MOLES MOLARIDAD: Moles de solutos en un litro de solución M= n/V n= gr/PM M= Molaridad n= numero de moles V= Volumen de litros

SOLUCIONES NORMALES NORMALIDAD: Numero de equivalentes-gramos de soluto contenido en un litro de solución N= gr/peq/V #e, H o OH Por ejemplo: Peq Mg(OH)2= 58 Peq Al(OH)3= 78 Problemas: 1. Si tenemos 50 ug/ul ¿A cuantos ng/ul equivalen? 2. La concentración del estándar de DNA=0.578 ug/ul para una reacción se requiere 1ug en un volumen final de 50ul ¿Cuánta ADN tengo que agregar ala solución? 3. La enzima Kpn II viene a una concentración de 8-12U/ul para determinar la actividad enzimática la reacción requiere 1U ¿Cuánta enzima tengo que agregar? 4. De acuerdo a los siguientes datos: DNA=0.578 ug/ul, Buffer (10X)= 10ul, Xho= 5-10 u/ul se requiere hacer una reacción a: Vf= 50/ul V= 1ul/u Buffer concentración final 1X Xho II= 1u Agua= ¿? ¿Cuáles son las cantidades que utilizaremos cada uno de cada uno de los reactivos? 5. En una reacción tengo que agregar 1 U del estándar de la enzima, la concentración de estándar es de 10U/ul. ¿Cuántos ul tengo que tomar del estándar? Si la cantidad a tomar es muy pequeña tengo que hace runa dilución ¿Cuál seria la dilución? 6. ¿Qué normalidad tenia una solución si 600 ml de la misma tiene 60 gr de Acido fosforito? 7. Prepare una solución de acido Sulfúrico 0.5 N 500ml 8. Prepare una solución de HCl 2N 350ml 9. ¿Qué molaridad tiene una solución de Acido Sulfúrico si 600 ml de solución contiene 50gr de acido? 10. Se requiere preparar 50ml al 10% de los siguientes ácidos: HCl= 35% HNO3= 60% ¿Qué volumen de cada acido ocupara? 11. Tenemos una solución al 2% de acetato de sodio, pero necesito 50 ml de acetato de sodio 0.5% ¿Qué cantidad necesita de acetato de sodio al 20%? 12. ¿Qué cantidad de NaOH requiero para preparar 200 ml al 10%? 13. Si disuelvo 30 gr de glucosa en 100ml de H2O ¿Cuál es el % de glucosa en la solución? 14. A partir de Tris-borato ADTA (TE) 10X prepare 1 L de TBE 0.5X 15. A partir de Tris-EDTA (TE) 100X prepare 200ml de TE 1X 16. Prepare un gel de agarosa 0.8% en TBE 0.5 X, prepare 100ml 17. Prepare un gel de agarosa 0.8% en TBE 0.5 X, prepare 200ml 18. A partir de un stock de Syber gold a 10000 X, prepare 1 ml 1 X

19. Prepare Buffer de corrimiento de electroforesis (jugo azul), con las siguientes concentraciones: 0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de xiñene cyanol y 30% de glicerol. El resto de agua para 100ml 20. Prepare 50ml de proteinasa K a 20 mg/ml 21. Prepare 1 L de etanol al 70% 22. Prepare 180 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 20% 23. Prepare 10ml de bromuro de etidio 10mg/ml 24. Haga los cálculos para saber cuanto se requiere para una reacción de PCR con los siguientes datos • DNA Stock 50 ng Concentración Inicial DNA Buffer (10X) MgCl2 (25mM) dNTPs (10 mM) Iniciador 5´ (20 uM) Iniciador 3´ (20 uM) Taq (5U/ul) H2O Vol final

Concentración final 50 ng 1x 1.5 mM 0.2 m 0.3 uM 0.3 uM 0.2 U/ul 25 ul

1X

PRACTICA 2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR Objetivo: Conocerá los equipos mas comunes de laboratorio de biología molecular Reactivos y Equipos: • Balanza analítica • Minicentrifuga Refrigerada • Termomixer • Transiluminador • Campanas de flujo laminar • Incubadoras • PH metro • Purificador de H2O mili-Q • Acetato de sodio • Beffer PH 7 y 10 • Vaso de precipitado • Probeta de 50 ml Procedimiento: Preparar 10ml de solución de acetato de sodio 1M y ajustar a el PH de 5.5, utilizar agua mili-Q en el experimento Demostración teórica del uso de equipos de laboratorio • Campana de flujo laminar • Transiluminados • Termomixer

• Incubadoras • Minicentrifuga refrigerada Observaciones y resultados PRACTICA 4 OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La función biológica de los ácidos nucleicos, especialmente el DNA es la de contener la información hereditaria. En 1953 Watson y Crick resolvieron su estructura molecular, dando comienzo una nueva era en la bioquímica y la biología. El DNA se encuentra en el interior de núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Para extraerlo es necesario romper las células para separar el núcleo, romper este para liberar el DNA, separarlo de las proteínas y precipitarlo para extraerlo de la solución. Desde que se considera al DNA como el material genético se definieron 3 funciones principales: 1. Almacén de información genética. El ADN contiene las instrucciones precisas que definen las características hereditarias en un individuo. 2. Autoduplicación y Herencia. El ADN contiene tamben toda la información para su autoduplicación, ya que es el medio de transmitir las instrucciones a las células hijas o de un individuo a su descendencia 3. Expresión del mensaje genético El estudio del DNA ha llevado a importantes avances no solo en el área de biología molecular, también a dado lugar a avances en la medicina y las ciencias de la salud. Gracias a los estudios sobre esta molécula se sabe que muchas enfermedades tienen una base genética y pueden en algunos casos prevenirse o corregirse. Además del uso para el diagnostico de enfermedades, es una herramienta en la genética forense y nos permite asignar paternidad y parentesco. El primer paso para el estudio del ADN es extráelo de las células, como sabemos el ADN se encuentra en el núcleo por lo que primero debemos quitar todos los componentes celulares hasta llegar a el, posteriormente retirar las histonas y dejar la molécula libre para seguir con el análisis. Existen varios métodos ya bien conocidos de extracción de DNA, cuya base primero es el uso de sales que permiten romper las paredes celulares para liberar los componentes (TE), un agente reductor de proteínas (DTT) y una enzima que separe las proteínas pegadas al DNA (proteinasa K). La extracción de ADN es el paso crucial para el resto de las pruebas, ya que un ADN puro y sin degradar es el inicio de un resultado exitoso.

TSNT 1. Colocar 500ul de sangre periférica con EDTA en un tubo de 2 ml eppendorf 2. Añadir 200ul de solución amortiguadora de lisis TSNT al paquete celular y mezclar perfectamente por inversión.

3. Agregar 500ul de fenol saturado y mezclar por inversión. 4. agregar 100ul de cloroformo alcohol isoamílico y agitar vigorosamente hasta homogenizar completamente. 5. Añadir 200ul de TE-1x, mezclar y centrifugar por 8 minutos a 14000 RPM. Transferir la fase acuosa a otro tubo appendorf de 2ml 6. Precipitar agregando 1ml de etanol al 100% frío, mezclado por inversión(mezclar suavemente hasta observar una hebra blanca). No agitar vigorosamente, por que se rompe el DNA. 7. Centrifugar 8 minutos a 14000RPM y decantar el sobrenadante. 8. Agregar 500ul de etanol al 70% frío, mezclar y centrifugar 8 min. a 14000 RPM. Sacar a temperatura ambiente. 9. Resuspender con 50-100ul de TE-1x (Según el tamaño de la pastilla obtenida. 10. Etiquetar la muestra. 11. Disolver el ADNg a 55ºC por 10 min. 12. Correr un gel de agarosa al 1% 5ul de DNAg en la cámara de electroforesis a 100 volts.