Practica Tincion Gram.docx

PRACTICA No. 5 “TINCIÓN DE GRAM” Introducción El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetil glucosamina y ácido Nacetilmurámico (Rodríguez, 2005) La tinción diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tinción primaria o colorante primario. Su función es impartir color a todas las células. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la célula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido. Objetivos 

Conocer y manejar la técnica de tinción de Gram de acuerdo con la estructura celular de las bacterias Gram (+) y Gram (-).

Procedimiento Tinción Gram Lavar los portaobjetos

Tomar una gota de agua con el asa Tomar inoculo y homogenizar Fijar el frotis Agregar Cristal violeta por 1 min

Enjuagar y escurrir Añadir Lugol por 1 min Enjuagar y escurrir Añadir alcoholacetoma por 19 seg Enjuagar y escurrir Agregar safranina por 30 seg Lavar y escurrir Dejar secar junto al mechero

Resultados En la práctica obtuvimos un buen frotis debido a que cada una de las fases como se muestra en la Fig. 1, 2 y 3 se efectuaron de la manera correcta respetando los tiempos establecidos.

Fig.2 Frotis con Yodo Lugol. Fig.1Frotis de la muestra con cristal violeta

Fig.3Frotis con alcohol acetona, puede observarse la decoloración

Fig.4 Dejar secar los frotis junto al mechero

Observación al microscopio En la Fig.1, 2 y 3, debido a que no llevamos a cabo una buena tinción, se observaba mucha cantidad de colorante y no se podía observar con claridad la forma que estas tenían, pero en la Fig.4, pudimos observar con mayor claridad el frotis, añadiendo a esto que el microscopio ya era uno diferente y más preciso, observando como resultado Bacilos Gram (-)

Fig.1 Objetivo de 10X

Fig.2 Objetivo de 10X

Fig.4 Objetivo de 100X, con aceite de inmersión Bacilos Gram (-) x Reactivo Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina

Color observado Color morado oscuro Café amarillento Incoloro Rojo (rosa)

Discusión de resultados: Lo que observamos en el microscopio de nuestro frotis fueron bacilos Gram negativos, es decir, el color que poseen es rojo, y esto es debido a los colorantes utilizados de los cuales cada uno cumple una función específica en cada tipo de pared celular de la bacteria. Cada solución agregada crea una cierta función, las cuáles son: o El alcohol en las Gram – va a extraer los lípidos de la pared con lo cual aumentan los poros de esa pared y sale el colorante de cristal violeta. En la Gram+, que tienen menos lípidos, ocurre una deshidratación de

la pared y por lo tanto disminuyen los poros de la pared, entonces no sale el cristal violeta. o La fucsina es un colorante de contraste, en las Gram – va a quedar teñida de color rojo o rojizo y en las Gram + queda de color azul (violeta). o La Gram-, tienen gran cantidad de lípidos en su pared, el alcohol los extrae, origina grandes poros en su pared y a través de ellos el complejo cristal violeta – yodo, puede salir permitiendo que en su lugar sea ocupado por el colorante fucsina tomando por tanto un color entre rojo y rosado. o La Gram+, al actuar el alcohol se produce deshidratación. Al complejo cristal violeta – yodo debido a que disminuyen los poros de la pared y quedan teñidos de color púrpura – violeta.

Conclusión: El objetivo de la práctica se cumplió de manera satisfactoria, debido a que durante la observación al microscopio pudimos percatarnos de la presencia de bacterias Gram + y -. Cuestionario 1.- ¿Qué importancia tiene la tinción Gram? La importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica ya que en primera instancia permite caracterizar tamaño, forma y/o agrupación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Las

bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos

Gram

positivos

se

tiñen

de

azul,

mientras

que

aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos. 2.-Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram (+) y (-) Gram (-) G. ESCHERICHIA. E. coli G. SHIGELLA. S. dysenteriae, S. sonney G. SALMONELLA. S. enterica G. CITROBACTER. C. freundii Gram (+) G. MICROCOCCUS. M. luteus. G. STAPHILOCOCCUS. S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus G. STREPTOCOCCUS. S. pyogenes, S. pneumoniae G. ENTEROCOCCUS. E. faecalis. Otros ESTREPTOCOCOS. 3.- Cite 3 razones por lo cual los microorganismos deben de teñirse 

Para conocer su morfología, definida por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura de las bacterias en cuestión.



Obtener información sobre la morfología y composición química de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen.



Para obtener información de algún diagnostico en cuestión.

4.- ¿Por qué las bacterias Gram (-) se tiñen de rojo y las Gram (+) de color azul? Las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared,

mientras

que

las

bacterias

Gram-

tienen

una

capa

de

peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con alcohol-acetona que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Bibliografía Rodriguez, E., & Galindo, J. (2005). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.Google Books. Recuperado 6 Abril 2016, de https://books.google.com.mx/books?id=vwB0fgirgN0C&pg=PA63&dq=tinci on+gram&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwigtsz4hPnLAhVqu4MKHQ17Az8Q6AEI GjAA#v=onepage&q=tincion%20gram&f=false Stanier, R., & Villanueva, J. (1996). Microbiología. Google Books. Recuperado 6 Abril 2016, de https://books.google.com.mx/books?id=2u6Q2XCMDgC&dq=tincion+gram&hl=es&source=gbs_navlinks_s Vizcarrondo, M., & Gutiérrez, S. (2001). MORFOLOGÍA Y TINCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS. Recuperado 6 Abril 2016, de http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicr o/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf