Practica 7 Y 8 Turno 1 Grupo 4.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE

SAN MARCOS UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA DE AMÉRICA

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AMILOLÍTICOS Y PRODUCCION DE AMILASA EN CULTIVO SUMERGIDO Rojas Rua, Ada Jany; Vilca Somosa Paul Diego; Pamela; Medrano Villanueva Bryan Jose; Huaringa Olave Allison Valeria; Amaro Huamani Diego Alonso

Laboratorio de Microbiología General y Aplicada, EAP Ing. Agroindustrial, Facultad Química e Ing. Química, UNMSM, Lima.

RESUMEN: Las amilasas son enzimas que hidrolizan moléculas de almidón dando diversos productos incluyendo maltosa (β-amilasa), dextrina (α-amilasa) y glucosa. Se aislaron microorganismos con actividad enzimática productores de amilasa (amilolíticos) que constituyen a un grupo microbiano llamado zimógeno, son importantes en la microbiología agroindustrial, puesto que es la base para la disponibilidad de nuevas cepas que puedan ser utilizadas en producción industrial. Utilizamos muestras de suelo en la cual su número aumenta de acuerdo a la cantidad de sustrato La producción industrial de amilasa se realiza principalmente mediante fermentación sumergida, aunque existe también la posibilidad de producirla por fermentación en sustrato sólido. Las bacterias y hongos como Bacillus y Aspergellus son utilizados como microorganismos productores. PALABRAS CLAVES: amilolítica, zimógeno, amilasa, sustrato

ABSTRACT: Amylases are enzymes that hydrolyze starch molecules giving various products including maltose (β-amylase), dextrin (α-amylase) and glucose. Microorganisms with amylase-producing enzymatic activity (amylolytics) that constitute a microbial group called zymogen were isolated. They are important in agroindustrial microbiology, since they are the basis for the availability of new strains that can be used in industrial production. We use soil samples in which their number increases according to the amount of substrate The industrial production of amylase is mainly carried out by submerged fermentation, although there is also the possibility of producing it by fermentation on solid substrate. Bacteria and fungi such as Bacillus and Aspergellus are used as producing microorganisms. KEY WORDS: amylolitic, zymogen, amylase, substrate

Introducción Amilasas es la denominación que ha recibido aquella familia de carbohidrasas encargadas de la degradación del almidón, una de los polisacáridos más conocidos según Redleman (2000). Según Pandey et al. (2000), su uso en la biotecnología es importante para diferentes procesos industriales como lo son las industrias de los alimentos, del papel y los textiles, siendo muy útil al reemplazar los procesos de hidrólisis del almidón mediante métodos químicos, los cuales suelen dejar tras de sí residuos contaminantes. Estas son enzimas que se han reportado muy extensamente en los microorganismos (aunque también en animales y plantas), siendo la α-amilasa y la glucoamilasa las que se identifican con mayor frecuencia en estos. Debido a su gran importancia, la producción de estas enzimas a gran escala es sin duda beneficiosa. Sin embargo, primero debemos tener en cuenta que es necesario identificar a los organismos que son capaces de producirla. La OEA (2000) establece que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo va a depender del microorganismo elegido, teniendo en cuenta ciertos criterios como es la estabilidad genética de la cepa, que tenga una alta velocidad de crecimiento, que esté libre de contaminantes (como fagos), que tengan requerimientos nutricionales tales que sean satisfechos por medios de costo reducido, de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin perder sus características, que sea capaz de realizar el proceso fermentativo completo en un lapso corto de tiempo y que si fuese obtenerse un producto lo haga con el mayor rendimiento y con la mejor facilidad de extracción del medio posible . Las fuentes de cepa pueden ser naturales o de una colección de cepas. Una vez elegida la fuente de aislamiento, su éxito dependerá de la técnica usada por el mismo. Entre estas técnicas tenemos al aislamiento directo y el uso del enriquecimiento del cultivo. En el primero es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento posibilite la máxima expresión del material genético del organismo, basándose en la forma de crecimiento o en la formación de halos de degradación del sustrato u otro factor.

Materiales y métodos Parte I Enriquecimiento in situ. - Muestra de suelo enriquecido. - 4 placas Petri estériles. - 1 frasco de tapa de rosca o Erlenmeyer con 90 ml de agua destilada estéril. - 2 tubos con 9.9 ml de agua destilada estéril. - 3 tubos con 9 ml de agua destilada estéril. - 2 pipetas de 1 ml estériles. - 1 Erlenmeyer con 60 ml de medio de aislamiento para hongos Parte II Muestreo - Caja de vidrio o plástico con yodo metálico. - Aguja de Kölle. - Láminas porta y cubre-objetos. - 2 tubos en cuña con APD. Parte III y IV - 1 Tubo con 5 ml de agua destilada estéril. - 1 Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de medio de producción de amilasas. - Centrífuga. - 2 Tubos de centrífuga de 15 ml. - Sustrato para amilasa. - 4 Pipetas de 1 ml.

Procedimiento Parte I

Fecha 28/09 Fecha de inicio del cultivo

Sábado 29 de setiembre

se regó el área de cultivo

Domingo 30 de setiembre

Lunes 1 de octubre

Martes 2 de octubre

Miércoles 3 de octubre

Jueves 4 de octubre

Viernes 5 de octubre

Sábado 6 de octubre

Domingo 7 de octubre

Lunes 8 de octubre

Martes 9 de octubre

Miércoles 10 de octubre Muestreo (noche anterior a la práctica)

Aislamiento 1. Mezclar cuidadosamente la muestra de suelo. 2. Pesar 10 g de la muestra y agregarlos al frasco o Erlenmeyer que contiene 90 ml de agua destilada estéril y rotularlo como dilución 100. 3. Agitar el frasco durante 10 min. 4. Realizar las diluciones indicadas en el esquema siguiente: 5. De las diluciones 10-3, 10-5, 10-6 y 10-7 tomar 1 ml y agregarlo a una placa Petri estéril. 6. Adicionar a cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar de aislamiento. 7. Incubar las placas a 30°C durante 5-7 días. 8. Proceder con la parte II.

Parte II 1. Colocar las placas Petri dentro de una caja de vidrio o plástico (con tapa hermética) conteniendo yodo metálico hasta que el medio adquiera un color morado. 2. Las colonias de microorganismos amilolíticos presentarán un halo incoloro. 3. Elegir la colonia que presente el mayor halo de hidrólisis (incoloro). 4. Realizar un trasplante de la colonia elegida a dos tubos en cuñas de APD. Incubar los tubos a 30° C hasta la siguiente sesión de prácticas. 5. Realizar una observación microscópica de la colonia elegida. En base a la observación realice un intento de identificación.

Parte III 1. Inocule 6 x 106 esporas del microorganismo correspondiente a un Erlenmeyer conteniendo 80 ml del medio de producción. 2. Incube el Erlenmeyer en un baño con agitación a 30°C y 200 movimientos por minuto por 7 días.

Parte IV Determinación de la actividad de amilasa (prueba de Fehling) 1. En un tubo de ensayo agregar 2ml del reactivo de Fehling A y 2ml del reactivo de Fehling B. 2. Verter 3ml del filtrado a temperatura ambiente. 3. Introducir el tubo en baño maría durante 3 minutos. 4. Observar y dibujar los resultados.

Discusión y resultados Luego de realizada la observación microscópica de la colonia amilolítica, se observó lo siguiente: Se observaron grandes cantidades de cocos unidos en forma de cadenas largas dando lugar a los llamados estreptococos y cadenas largas de cocos pero a su vez su tienen forma de paquetes a los cuales llamamos estafilococos.

Debido a la pequeña tinción de color morado que se observaron en las respectivas placas Petri, se concluye la presencia de una gran cantidad de colonias amilolíticas en las placas de las diluciones 10−4 𝑦 10−5 . Además, se aprecia que mientras el color morado sea menor, la presencia de microorganismos aumenta, tal como se puede apreciar en la dilución de 10-4.

Ya que esta prueba es de microorganismos amilolíticos que hidrolizan almidón el medio de producción tuvo un gran porcentaje de almidón y tuvo un medio de pH de 6.5 pues el medio óptimo de las bacterias es de 7. Con respecto a la actividad de la amilasa mediante la prueba de Fehling se obtuvo un resultado positivo observándose un color mostaza medio anaranjado.

Conclusiones Luego de analizar los resultados (todos positivos) en las pruebas a las que fueron sometidos los microorganismos amilolíticos aislados, véase caja con yodo metálico para reconocer el halo de hidrólisis y prueba de Fehling para determinar la actividad de las amilasas, podemos concluir que:  

El suelo en el que se suministró la harina (sustrato) era de excelentes condiciones para la formación de microorganismos productores de enzimas amilolíticas. Efectivamente las colonias seleccionadas de las placas Petri (por el halo de hidrolisis) eran las adecuadas ya que en la prueba de Fehling se observó la coloración rojoladrillo (positiva en formación de azucares reductores).

Referencias bibliográficas Sonia Marcela Buitrago Morales, Etna Milena Sanchez Castelblanco. (2014). Aislamiento de microorganismos amiloliticos, celuloliticos y ligniloliticos a partir de suelos de humedales de Bogota. 2018, de SENNOVA Sitio web: http://revistas.sena.edu.co/index.php/sennova/article/download/89/101 Silvia Fernanda Gómez Arenas, Leonardo Fabio Sarmiento González, Diana Carolina Delgado Cardoz. (2015). Caracterización de microorganismos celulolíticos y amilolíticos de residuos sólidos orgánicos dispuestos en la planta Ecosangil del municipio de San Gil, Santander. 2018, de Matices Tecnologicos Sitio web: http://publicaciones.unisangil.edu.co/index.php/revista-maticestecnologicos/article/view/206 Claudia Sanchez, Carlos Mejia, Carlos Figueroa, Mabel Esquivia, Lina Agudelo. (2005). Estudio de cepas nativas amiloliticas. 2016, de VITAE, Revista de la Facultad de Quimica Farmaceutica, Universidad de Antioquia, Medellin Sitio web: http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03.pdf

Cuestionario

En la primera etapa de esta práctica del enriquecimiento se obtuvo la muestra de suelo, el cual posteriormente fue diluido a concentraciones de 10-1 , 10-2 ,…10-5 . En las muestras obtenidas después de realizar las diluciones, se realizó la siembra por el método de difusión, el cual arrojo como resultado grandes cantidades de colonias que se observó en las placas

La tinción de color morado que se observaron en las respectivas placas petri, se presencia de una gran cantidad de colonias amilolíticas en las placas de las diluciones 10-4 y 10-5. Además, se aprecia que mientras el color morado sea menor, la presencia de microorganismos aumenta, tal como se puede apreciar en la dilución de 10-4.