Practica-7-microbiologia-v2.docx

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Laboratorio de Microbiología General Profesora: Avelino Flores María del Carmen

Practica 7: Pruebas Bioquímicas. GARY ISRAEL MENDOZA GARCÍA CAROLINA ESTEFANIA TORRES POZOS ÁNGELES ANDREA PÉREZ PATIÑO

OBJETIVO: -

Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de bacterias bacilares Gram negativas. - Identificar el género y especie de la cepa

INTRODUCCIÓN: Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas involucradas en el metabolismo bacteriano .Pueden ser evidenciadas en medios de cultivos especiales que contiene los substratos (hidratos de carbono,aminoácidos,etc) sobre los cuales ellas actúan junto un sistema indicador. Las pruebas bioquímicas también evalúan la capacidad de reducir ciertos iones ,la presencia o ausencia de flagelos, la producción o no de hemolisinas ,el requerimiento de algunos factores especiales, la producción de algunas toxinas con capacidad virulenta ,etc.

FUNDAMENTOS: FUNDAMENTOS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

TSI (TRIPLE AZUCAR HIERRO). Determina la capacidad de los microorganismos de fermentar tres carbohidratos GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA .Además de la detección de producción de Sulfuro de Hidrogeno. Se utiliza el indicador ROJO FENOL.

LIA (TISINA HIERRO AGAR) Evalúa la descarboxilacion de la lisina y la fermentación de la glucosa. Además detecta la producción de Sulfuro de hidrogeno. Se utiliza el indicador PURPURA DE BROMOCRESOL.

MIO (MOVIMIENTO, INDOL Y ORTINA) Determina la movilidad, descarboxila la ornitina y degrada el triptófano para producir indol (CON REACTIVO EHRUCKO Y KOVACS) a través de la enzima triptofanasa. Se utiliza el indicador PURPURA DE BROMOCRESOL.

CITRATO (AGAR CITRATO DE SIMMONS) Determina la capacidad de los microorganismos de emplear el citrato como única fuente de carbono. Se utiliza el indicador AZUL DE BROMOTIMOL.

UREA (TRIPLE AZUCAR HIERRO) Determina la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la urea por medio de las enzimas ureasa.

Se utiliza el indicador ROJO FENOL.

MR-VP (ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER) Determina la capacidad de los microorganismos de FERMENTAR la glucosa con producción de ácido por la vía acido mixta o con producción de un producto final neutro (ACETONA) Se utiliza el indicador ROJO FENOL, KOH AL 40% Y ALFA NAFTOL 5%.,

MATERIAL Y REACTIVOS: Cepas bacterianas propuestas por el profesor Agar TSI Agar LIA Agar Urea Agar Citrato de simmons. Caldo MR-VP Agar MIO

DESARROLLO EXPERIMENTAL. AGAR TSI Determina la capacidad de un m.o para utilizar los hidratos de carbono: glucosa, lactosa y sacarosa .Ademas de la produccion de H2S

Siembra Fundamento

Interpretación

Indicador rojo de fenol

Color Amarillo =Acidez (A) Color Rojo=Alcalinidad (K)

Estría en superficie y picadura hasta el fondo.

La Producción de gas puede producir ruptura en el medio o burbujas.

Precipitado color negro quiere decir que hubo producción de H2S

Lectura después de 18-24 hrs de incubación .A 37°C

Lectura de las reacciones bioquímicas

K/N=sin cambios. A/A =Fermentación de los 3 carbohidratos. K/K =no hubo fermentación de los carbohidratos k/A =Fermentación de glucosa

AGAR LIA Determina la capacidad de un m.o para utilizar el aminoácido Lisina descarboxilandolo, la fermentación de la glucosa y producción o no de H2S

Indicador de acidez Purpura de bromocrisol

Color Amarillo =Acidez (A) Color Rojo=Purpura (K)

Doble picadura hasta el fondo del tubo y siembra en superficie

Siembra

Fundamento Lectura después de 18-24 hrs de incubación.48 hrs si es necesario. A 37°C

Interpretación

La Producción de gas puede producir ruptura en el medio o burbujas.

Precipitado color negro quiere decir que hubo producción de H2S

Lectura de las reacciones bioquímicas

R/A =Desanimación de la Lisina(ROJO/AMARILLO) K/K =descarboxilación de Lisina. k/A =Fermentación de glucosa.

AGAR CITRATO DE SIMMONS Determina la capacidad de un m.o de emplear el citrato como única fuente de carbono en ausencia de fermentación de azucares.

Color Azul=prueba positiva(+)

Siembra

Fundamento

Interpretación

Indicador azul de bromotimol

Sin cambio de color, pero con crecimiento=dudoso

Superficie unicamente

Lectura después de 18-24 hrs de incubación.48 hrs si es necesario. A 37°C

Sin cambio de color=prueba negativa (-)

AGAR UREA Determina la capacidad de un m.o de producir ureasa y desdoblar la urea, formando 2 moléculas de amoniaco. La ureasa es una enzima constitutiva

Color Violeta=prueba positiva (+)

Siembra

Fundamento

Interpretación

Indicador rojo de fenol

Superficie únicamente.

Lectura después de 18-24 hrs de incubación. A 37°C

Color Amarillo =prueba negativa (-)

AGAR MR-VP Determina la vía metabólica por la cual la bacteria es capaz de fermentar glucosa

Siembra

Fundamento

Interpretación

Indicador 10 gotas de Rojo de Metilo

En caldo con asa recta

Lectura después de 48 hrs a 37°C

10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de Alfa Naftol 5%.Esperar 15 min.

Color Rojo=prueba positiva (+) Color Rojo=prueba VP positiva (+) Color Amarillo=prueba negativa (-)

Color Amarillo o café=prueba VP negativa (-)

AGAR MIO Podemos observar si el m.o es móvil,si puede descarboxilar la ornitina y degradar el triptófano para producir indol .

Por picadura Siembra Fundamento

Interpretación

Movilidad

Enturbiamiento del medio o crecimiento más allá de la línea de inoculación

Indicador purpura de bromocresol

Color purpura=Ornitina positiva. (+).

Color Amarillo=Ornitina negativa (-)

RESULTADOS Y OBSERVACIONES. CEPA MC291 AGAR TSI

Resultados -A/A =Fermentación de los tres carbohidratos. -ACIDA - NEGRO

Lectura después de 18-24 hrs de incubación.48 hrs si es necesario. A 37°C

Reactivo de KOVACS O DE ERLICH

Color rojo=Indol positivo

LIA

-K/K =Prueba positiva a la descarboxilacion de lisina. -ALCALINA. NEGRO -Gas en el medio. -Prueba negativa a la desaminacion de lisina.

MIO

-Prueba positiva al movimiento. -Prueba negativa a la degradación de triptófano para producir indol. -Prueba negativa a la descarboxilación de ornitina. -Prueba positiva a la Fermentación de glucosa

CITRATO

-Prueba positiva.

UREA

-Prueba negativa a la hidrolizacion de urea.

RM-VP

-Prueba positiva.

ANALISIS DE RESULTADOS. CEPA MC291 AGAR

Análisis

TSI

La prueba es acida ya que el indicador viro de un color amarillo completamente, quiere decir que tiene una superficie y profundidad acida ( A/A) este cambio también representa la Fermentación de los tres carbohidratos .Además hubo producción de H2S ya que se formó un precipitado negro en el medio. La prueba salió positiva a la descarboxilacion de lisina ya que se puso de un color púrpura que quiere decir que tiene una superficie y una profundidad alcalina.(k/k).No hubo desaminacion de lisina pero hubo producción de H2S pues se formó un precipitado negro en el medio. También hubo presencia de gas ya que había una burbuja. El enturbiamiento del medio demuestra que salió positivo a la movilidad. Salió negativa a la prueba de indol ya que al agregarle el reactivo KOVACK no se presentó el anillo característico de color rojo. Salió negativo a la descarboxilacion de ornitina, ya que el indicador viro al color amarillo y este color se da cuando la fermentación de glucosa reduce el pH produciendo una condición acida. La prueba dio positiva ya que el indicador viro a un color azul intenso La prueba salió negativa a la hidrolizacion de urea, ya que el indicador viro a un color amarillo. La prueba salio positiva en las dos pruebas ya que tomo un color rojo

LIA

MIO

CITRATO UREA RM-VP

CONCLUSIÓN.

CUESTIONARIO: BIBLIOGRAFÍA: -Manacorda.M.A., Manual de practicas de Microbiologia General ,unidad academica :ES.S.S