Practica-5-actividad-de-la-enzima-succinato-dh.docx

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS Facultad de ciencias químicas

IV (Extensión Ocozocoautla) Facultad Campus de ciencias químicas Campus

IV (Extensión Ocozocoautla)

Profesor: Dra. Ana Olvia Cañas Urbina Licenciatura: Químico Farmacobiólogo

Alumna: Espinoza López Yuridia Gómez Pérez Maritza Elizabeth Hernández Nigenda Diana Laura. Morales Gonzáles Ana Laura. Zamayoa Espinosa Aida Patricia

Cuarto semestre

Ocozocoautla de Espinosa Chiapas

BIOQUIMICA

Noviembre del 2015

4° Semestre

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INTRODUCCIÓN Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones desde una molécula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente oxidante) (Jenner Us Martin, 2014). Según González nos dice que las enzimas oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo oxidasa. Según Sierra en el 2013 nos dice que las células de la gran mayorías de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de óxido reducción mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a través de la degradación de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético (ATP). La succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato. Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa. Según Gonzalez en el 2010 nos dice la coloración de la oxidación y reducción del azul de metileno al cambiar su estado redox.

Indicador

Azul de metileno

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Color (reducido) Color (oxidado)

Incoloro

Azul

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Figura 1.- Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de laboratorio. Bioquímica. Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla. UNACH, citado por Cañas en el 2015.

La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima está sujeta a una poderosa inhibición competitiva por parte de reactivos como el fenol lo cual constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio (Sierra, 2013). Para estudiar el transporte de cargas en la reacción se empleó un aceptor artificial de electrones (azul de metileno), cuya decoloración permite diferenciar la actividad enzimática en los ensayos a realizar en la presente práctica.

OBJETIVO Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reacción colorimétrica. MATERIALES Y MÉTODO

MATERIALES

2 tubos de ensaye

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Baño maría a 50°C

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pipetas de 5ml

Pinzas para tubo de ensaye

Reactivos  NaOH

 Azul de metileno al 0.1%

 Acido succínico

 Aceite mineral

 Fenol al 90%

 Hígado de pollo

METODOLOGÍA

Pesar 1g de hígado de pollo.

En el mortero molerlo con 3 o 4 ml de ácido succínico, hasta obtener una masa.

Transferir en partes iguales a 2 tubos.

Incube ambos tubos por 10 minutos en el baño maría (50%)

Observe los cambios

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RESULTADO Concentraciones: 𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:

(𝒑𝒐𝒓𝒄𝒆𝒏𝒕𝒂𝒋𝒆 𝒆𝒏 𝒎𝒂𝒔𝒂 ) (𝒈 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏) 𝟏𝟎𝟎

𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:

(𝟗𝟎 % ) (𝟐𝟎𝒈 ) = 𝟏𝟖 𝒈 𝒅𝒆 𝒇𝒆𝒏𝒐𝒍 𝟏𝟎𝟎 %

Se necesitan 18 g de fenol en 20 ml de disolución. 𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:

(𝟑 % ) (𝟓𝟎 𝒈 ) = 𝟏. 𝟓 𝒈 𝒅𝒆 á𝒄𝒊𝒅𝒐 𝒔𝒖𝒄𝒄𝒊𝒏𝒊𝒄𝒐 𝟏𝟎𝟎 %

Se necesitan 1.5 g de ácido succínico en 50 ml de disolución.

Tubo 1: Con fenol

Tubo 2: Sin fenol.

Ilustración 2: El tubo 1 contiene fenol y el tubo 2 no contiene. En el tubo 2 hubo cambio de coloración a transparente y en el tubo 1 no hubo separación y además formo un halo a incoloro. Después de calentar a baño maría.

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DISCUSION DE RESULTADOS En la práctica, se utilizó 1 gramo de hígado de pollo y se mezcló con ácido succínico; esto se hizo debido a que en el hígado se encuentra la enzima de interés, es decir, la enzima succinato deshidrogena y el ácido succínico es el que nos ayudó a reducir el azul de metileno en lugar del succinato. (Alberto, 2012) Después de mezclar el hígado con ácido succínico, obtuvimos una masa que fue repartida por partes iguales en dos tubos de ensayo; a uno de los tubos se le añadió fenol (tubo 1), el cual ayudo a inhibir la actividad de la enzima ya que ocurre una desnaturalización. En este paso se observó que el tubo 1 (con fenol), separó la masa de hígado con ácido succínico del fenol agregado. Posteriormente, se agregó azul de metileno a los dos tubos, haciendo que el tubo 1 se coloreara de azul y el tubo 2 (sin fenol) se coloreara de café, este paso se realizó, ya que el azul de metileno fue el aceptor de electrones del complejo succinato-FADH2. Después, se agregó aceite de bebé, ya que contiene aceite mineral, este se encargó de aislar los dos tubos de ensayo del aire del ambiente y así prevenir la oxidación temprana del FADH2. (Alberto, 2012) Finalmente, se calentó a baño María por 10 minutos a 50°C con el fin de que la enzima fuera liberada de la mitocondria. En general, cada uno de los reactivos desempeño una función importante en la realización de la práctica, como resultado final se obtuvieron dos tubos uno de color transparente (tubo 2) y en el otro se formó un halo incoloro (tubo 1), en ambos la enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico actuó como una oxidorreductasa, ya que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. El succinato cedió un H2 que es transferido del FADH2 al azul de metileno, por lo que este cambio su estado redox de coloreado a incoloro o viceversa. (Alvarado & et. Al. 2008)

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CONCLUSIÓN. Se logró llegar al objetivo debido a que se obtuvo como se esperaba una decoloración en el tubo 2, ya que hubo una reducción del azul de metileno que fueron cedidos desde el FADH2 obteniendo FAD oxidado y azul de metileno reducido, y en el tubo 1 no hubo una decoloración debido a la inhibición del fenol, con la realización de esta práctica se comprobó la acción de la enzima succinato deshidrogenasa.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido? En estado reducido el color es azul y en su estado oxidado es incoloro. 2. ¿Cuál es la función del fenol en la reacción? El fenol inhibe la actividad de las enzimas ya que desnaturaliza las proteínas, en este caso actividad.

a la enzima deshidrogenasa, provocando la pérdida de su

3. ¿En qué vía metabólica está involucrada la enzima succinato deshidrogenasa? Lista los activadores, inhibidores, Km y mecanismo de rx de ésta enzima La oxidación del succinato a fumarato está involucrada en la reacción 6 del ciclo de Krebs. Activadores: α glicerofosfato, acido beta oxibutirico, isocitrato y proteína SDHA F2. Inhibidores: 2-Oxoglutarato, oxalato y ácido oxaloacético Km: 0.3 mM En la succinato deshidrogenasa el anillo isoaloxazina del FAD está unido covalentemente a la cadena lateral de una histidina del enzima. El FAD es el aceptor de hidrógeno en esta reacción por que el cambio de energía libre es insuficiente para reducir al 𝑁𝐴𝐷 + .

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REFERENCIAS Alberto.(04 de marzo de 2012).Determinación de la actividad de succinato deshidrogenasa. Recuperado de http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci%C3%B3n-De-La-ActividadDe-Succinato/3600966.html. Alvarado & et.al. (2008). BIOQUIMICA II. Obtenido de http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/media/users/10/523320/files/51871/ Ma. BRENDA. (2015). Información sobre EC 1.3.99.1 - succinato deshidrogenasa. Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de: http://www.brendaenzymes.org/enzyme.php?ecno=1.3.99.1&Suchword=succinato+deshidrogenasa& organism%5B%5D=#INHIBITORS Berg, J., Tymoczko, J. & Stryer, L. (2008). Bioquímica. El oxalacetato se regenera por oxidación del succinato. (pp. 487-488). Barcelona: Reverté. Recuperado de: https://books.google.com.mx/books?id=HRr4MNH2YssC&pg=PA487&lpg=PA487& dq=MECANISMO+DE+RX+DEL+SUCCINATO+DESHIDROGENASA&source=bl& ots=LUtJN3Ci9x&sig=jdxTYlxJ-6wXAD96uB9SGdTllc&hl=es&sa=X&ved=0CCwQ6AEwA2oVChMI044uN3_yAIVwUImCh11BQsz#v=onepage&q=MECANISMO%20DE%20RX%20DEL %20SUCCINATO%20DESHIDROGENASA&f=false Cañas, A. (2015). Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de laboratorio. Bioquímica. Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla. UNACH. Obtenido de: https://anacanas.files.wordpress.com/2015/09/prc3a1ctica5.pdf González, J (s.f.). CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS. http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1

Obtenido

de:

González, M. (2010). Química. Indicador redox. Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox Gonzalez, M. (26 de Octubre de 2010). Indicador redox. Obtenido de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox Jenner Us Martin. (12 de marzo de 2014). Oxidorreductasa. Obtenido de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1

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Sierra, I. (28 de junio de 2013). Practica transporte de cargas 7. Obtenido de: http://es.slideshare.net/ingridjohanasierramejia/practica-transporte-de-cargas-7

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