Practica 02. Actividad Enzimatica Y Naturaleza De Enzimas.docx

NDEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMASN I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos, resultando complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica.

II. REACTIVOS A UTILIZAR: -

NaOH 1N

-

Amilasa salival 1%

-

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6

-

SO4 Cu 20%

-

Solución iodada

-

Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

-

NaCl 0.15M

-

HCl 3N y 0.05N

-

Almidón al 1% en solución acuosa

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: el SISTEMA A.

SISTEMA A. TUBOS COMPONENTES (en ml)

I

II

III

IV

V

VI

Amilasa al 1%

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

NaOH 1N

-

2.4

-

-

-

-

HCl 3N

-

-

2.4

-

-

-

Ácido Tricloro acético 20%

-

-

-

2.4

-

-

Sulfato de Cobre al 20%

-

-

-

-

2.4

-

2.4

-

-

-

-

2.4

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6

a. Observar el aspecto y color producido e interpretar. b. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. c. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. d. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B:

SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml)

I

II

III

IV

V

VI

Almidón al 1.0% en solución acuosa

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

NaCl 0.15 M

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

Agua Destilada

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

a. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC. b. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del sistema (B). c. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. d. A continuación armar el siguiente sistema:

TUBOS COMPONENTES (en ml)

I

II

III

IV

V

VI

5

5

5

5

5

5

De los tubos del sistema (B), agregar:

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Solución yodada

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

HCl 0.05N

e. Observar el color producido e interpretar los resultados.

IV. CUESTIONARIO: 1. Explique cuál es el mecanismo de acción de las sales pesadas sobre la proteína (enzima). 2. ¿Cómo actúan los ácidos y bases fuertes sobre la proteína (enzima)? Identifique cuáles son los ácidos y fuertes empleados. 3. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. 4. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos. 5. ¿Cómo actúa la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima? 6. ¿Cómo repercute la modificación de la estructura proteica, producida por agentes físicos y químicos, sobre la actividad enzimática?

NDETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICAN I. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia; permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. 2. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática, utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa; verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción.

II. REACTIVOS A UTILIZAR: -

Solución de almidón pH 6.0 al 1%. Cloruro de sodio solución 0.1M Enzima al 1% (amilasa salival). Ácido Clorhídrico 0.05N Solución yodada. Reactivo Folin Wu: a. Solución Cúprica alcalina. b. Solución fosfomolíbdica.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)  Armar el siguiente sistema: SISTEMA A: TUBOS COMPONENTES

I

II

Solución de almidón pH 6.0 al 1%

5 ml.

5 ml.

Solución de cloruro de sodio 0.1M

1 ml.

1 ml.

Agua destilada

4 ml.

3 ml.

 Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos.  Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.  Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. 

Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. De cada uno de los tubos del sistema anterior, transferir 0.5 ml. a este nuevo sistema. TUBOS COMPONENTES

I

II

5 ml.

5 ml.

De los tubos I y II: Sistema A

0.5 ml.

0.5 ml.

Solución yodada

0.5 ml.

0.5 ml.

Ácido clorhídrico 0.05 N



Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: Sistema A

I 1ml.

II 1ml.

Solución Cúprica alcalina

1ml.

1ml.

Hervir 8 minutos Enfriar 

Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante

IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? 2. Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. 3. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato, donde se observe la energía de activación y el estado de transición. 4. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 5. ¿Cómo se puede objetivar la presencia del sustrato residual? 6. ¿Cómo demostrar si se ha producido o no reacción enzimática en un experimento realizado? 7. ¿Cómo se pueden objetivar los productos de una reacción enzimática ?