Potencia-microbiana-1.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA QUÍMICA FARMACÉUTICA BILÓGICA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO

POTENCIA MICROBIOLÓGICA

ASESOR: MARÍA DEL ROCÍO GALICIA ROSAS

ALUMNOS: HURTADO ROBLEDO BERENICE MORA PEÑA MAURICIO ALBERTO REYES ESCOBEDO FRIDA ITZEL

EQUIPO: 14 GRUPO: 1801 SEMESTRE: 2016-2 16 DE MARZO DE 2016

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Contenido FUNDAMENTACIÓN ........................................................................................................................................................... 3 OBJETIVOS ............................................................................................................................................................................ 6 HIPÓTESIS .............................................................................................................................................................................. 6 METODOLOGÍA................................................................................................................................................................... 6 RESULTADOS......................................................................................................................................................................... 8 ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................................................................. 8 CONCLUSIONES ................................................................................................................................................................ 10 SUGERENCIAS .................................................................................................................................................................... 10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................................................... 11

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA FUNDAMENTACIÓN VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS La potencia o actividad de los antibióticos se calcula comparando el grado de inhibición de microorganismos sensibles y específicos determinada por concentraciones conocidas del antibiótico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya actividad se ha definido por un organismo reconocido por la autoridad sanitaria nacional. En los antibióticos puede haber ligeros cambios químicos que se traducen en pérdida de actividad antimicrobiana que no pueden demostrarse por métodos químicos, por esta razón, en caso de duda respecto a la actividad de un antibiótico, los métodos de valoración microbiológica prevalecen sobre los métodos químicos. Para valorar microbiológicamente un antibiótico, se pueden emplear dos métodos: Método cilindro-placa (método de difusión en agar) y Método turbidimétrico, ambos comparan la respuesta del microorganismo de prueba, frente a una Sustancia de referencia (SRef) de actividad conocida y una muestra tratadas en las mismas condiciones. 1 Método de cilindro en placa (difusión en agar). Se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical, a través de una superficie con agar inoculado con el microorganismo de prueba. La difusión origina zonas de inhibición del microorganismo cuyo tamaño (diámetro) está en relación con la concentración del antibiótico. 1 Método turbidimétrico. Se basa en medir espectrofotométricamente el crecimiento del microorganismo de prueba en un medio de cultivo líquido que permite su rápido crecimiento y en el que al adicionar concentraciones crecientes del antibiótico se inhibe el crecimiento en forma proporcional a la concentración adicionada. 1 VALORACIÓN CILINDRO – PLACA (MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR) Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las condiciones del diámetro de la zona de inhibición dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se corrigen basándose en el tamaño relativo de la zona de inhibición de la SRef comparado con el tamaño medio de la zona de inhibición de la SRef en todas las placas. 1

El antibiótico es, por definición, aquel que se opone a la vida. Los antibióticos son sustancias utilizadas para impedir el desarrollo de bacterias en el cuerpo humano. Algunos antibióticos, como la penicilina, el primer antibiótico descubierto por Fleming en 1929, son históricamente naturales, pero ahora la mayoría son antibióticos sintéticos.

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA El antibiótico actúa por mecanismos diferentes en función de su naturaleza y su objetivo es bloquear la proliferación de las bacterias inhibiendo alguno de los pasos de su desarrollo. Los antibióticos se prescriben en caso de infecciones bacterianas únicamente, y pueden utilizarse más de uno para tratar algunas infecciones severas. Los antibióticos se deben prescribir de forma correcta, ya que las bacterias desarrollan mecanismos de resistencia a los antibióticos que reducen su eficacia. 2 La Ampicilina es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectrro y activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente a las betalactamasa producidas por bacterias gram-postitivas o gram-negativas. La ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. 2 Micrococcus luteus es una especie de bacteria gram positiva. Se trata de una bacteria saprófita, de la familia de las Micrococcaceae. Posee una morfología de coco (esférico) y una agrupación en tétradas. Es una bacteria aerobia obligada (no puede vivir sin oxígeno), que puede ser encontrada en la tierra, polvo, agua y aire, formando parte de la flora bacteriana de la piel de los mamíferos Agar N° 11 Uso: Para el ensayo microbiológico de antibióticos en placa por el método de cilindros. Este medio puede usarse tanto para la capa básica como para la semilla. Principio: En la formulación de este medio se tienen dos peptonas, extracto de levadura y extracto de carne que proporcionan nutrientes suficientes para dar soporte de crecimiento a los microorganismos, el pH final dará una condición óptima para la actividad del Antibiótico durante la prueba. 3 Ley de Fick Teoria: Cuando en un sistema termodinámico multicomponente hay un gradiente de concentraciones, se origina un flujo irreversible de materia, desde las altas concentraciones a las bajas. A este flujo se le llama difusión. La difusión tiende a devolver al sistema a su estado de equilibrio, de concentración constante. La ley de Fick nos dice que el flujo difusivo que atraviesa una superficie (J en mol cm2 s-1) es directamente proporcional al gradiente de concentración.

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA El coeficiente de proporcionalidad se llama coeficiente de difusión (D, en cm 2 s -1). Para un sistema discontinuo (membrana que separa dos cámaras) esta ley se escribe: J= D* ∆c/ δ Donde ∆c es la diferencia de concentraciones molares y δ el espesor de la membrana.4 Curva del Crecimiento Bacteriano. La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación. La velocidad del crecimiento exponencial se expresa como el tiempo de generación “G”, y este se define como el tiempo que tarda una población en duplicarse, los tiempos de generación varían ampliamente entre los distintos microorganismos. La curva del crecimiento de una población bacteriana se divide en 4 fases:

* Latencia Cuando una población bacteriana es inoculada en un medio fresco el crecimiento no suele comenzar d inmediato, sino después de un tiempo llamado latencia. * Exponencial o logarítmica Es el periodo de la curva del crecimiento en el cual el microorganismo crece exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un cierto tiempo de generación la población se duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es máxima.

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA * Fase estacionaria En cultivos en recipientes cerrados una población no puede crecer indefinidamente de forma exponencial. Las limitaciones de crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, porque se alcance un número de células. * Fase de muerte Disminución progresiva en el número de células viables, y cuando esto ocurre se dice que la población ha entrado en fase de muerte. 2,4 Tipos de esterilización: - Esterilización por calor húmedo: el calor húmedo destruye a los m.o. por coagulación de sus proteínas celulares. 121°C, presión de 151 libras, 15 min. - Esterilización por calor seco: esta esterilización produce la destrucción de m.o. por oxidación de sus componentes celulares. 160°C, 1.5-3 hrs. OBJETIVOS  

Determinar la potencia microbiológica de ampicilina genérica y patente, mediante el método 2+2. Observar, analizar y determinar el tiempo óptimo de difusión.

HIPÓTESIS La ampicilina es un antibiótico, existe en genérico y patente. Se espera que la potencia microbiana sea la misma entre ellos. METODOLOGÍA Material  Tubos de ensaye  Cajas Petri con tapa de porcelana  Matraz Erlenmeyer 50 mL  Matraz Erlenmeyer 500 mL  Pipeta graduada de 5mL  Penicilindros Material biológico  Cepa de Micrococcus luteus EMITIÓ

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA Sustancias  Solución de ampicilina a 16 µ/mL (patente y genérico)  Solución de ampicilina a 8 µ/mL (patente y genérico) Equipo   

Espectrofotómetro Autoclave Incubadora

MÉTODO: Potencia microbiana Método 2+2

• Se realizo, el ajuste con los 8mL restantes y solución salina; utiizando una regla de 3 y se paso a un matraz con 100mL de agar N°11 (agar siembra) •Las cahas se marcaron en 4cuadrantes y se les agregó 18mL de de agar base, después de que se solidificó se le agrego 4 mL de agar siembra. •En cada cuadrante se colocó un penicilindro, y con ayuda de una jeringa de insulina se le agrego 0.15mL de cada solucion de antibiotico, utilizando asi 6 cajas

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Predifusión

•´Para predifusión se realizó el mismo procedimiento, pero solo se utilizo antibiotico estandar (patente) pero a distintos tiempos. .

Después de haber realizo todo el proceso, se metió a la incubadora durante 48 hrs. Para poder observar el halo de inhibición, en cada placa.

RESULTADOS No se obtuvieron resultados confiables. Al momento de realizar la lectura de las placas, y medir el halo de inhibición, se observó que había crecimiento microbiano en toda la placa, exceptuando en los espacios donde había antibiótico por el penicilindro. Solo en dos placas se observó un halo de inhibición en la parte de las muestra con concentración baja, pero el circulo no era muy visible. ANÁLISIS DE RESULTADOS Para comenzar se describir que toda la práctica tuvo muchos contratiempos, debido a imprevistos que no se pudieron controlar como: el tiempo de duración de la práctica, se sobrepasó a lo programado, ya que las necesidades no estaban cubiertas completo como lo era el uso de gas para mantener el área aséptica dentro del área de trabajo en el laboratorio. Para realizar los cálculos utilizando el método 2+2 se necesitaban los dos niveles de concentraciones de la muestra patente y muestra estándar en las concentración alta y baja; para poder graficarlos y observar el comportamiento de las dos muestras en forma de líneas rectas sobrepuestas; y ahí determinar la potencia del activo, respecto a la muestra genérica y muestra patente. En las placas se observó el crecimiento microbiano en todo la placa sin halos de inhibición, esto pudo haber sido por varias razones, por ejemplo:

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO POTENCIA MICROBIOLÓGICA CEPA RESIETENTE -

El uso de antibióticos supone una presión selectiva sobre las poblaciones bacterianas que puede llevar a la substitución de las poblaciones del microorganismo sensibles al antibiótico por otras que han desarrollado mecanismos de resistencia frente al mismo. Existen varios mecanismos de resistencia a los antibióticos. Las resistencias aparecen en las poblaciones por mutación y se establecen por la selección que ejerce la presencia del antibiótico en las poblaciones de microorganismos. Los mecanismos e resistencia más generales son cuatro: *Modificación de la diana del antibiótico (por ejemplo: mutación que hace a una PBP insensible a un β-lactámico) *Modificación del antibiótico (por ejemplo, las β-lactamasas que inactivan los βlactámicos o la cloranfenicol-acetil transferasa que inactiva el cloranfenicol) *Modificación de la vía de entrada del antibiótico (por ejemplo, cambios en las porinas que afectan a la entrada de antibióticos en Gram-negativos) *Sistemas de bombeo del antibiótico al exterior de la célula. - El problema de la resistencia a antibióticos es de gran importancia porque estos pierden su valor como agentes quimioterápicos muy rápidamente. Por esta razón es imprescindible el establecimiento de una política de antibióticos tanto a nivel del hospital como a niveles más altos de la política sanitaria. El mal uso indiscriminado de antibióticos favorece la aparición y la diseminación de las resistencias. - Para evitar la aparición de resistencias, una estrategia quimioterapéutica es la utilización de combinaciones de antibióticos. En ciertos casos estas asociaciones son más activas que la suma de los dos antibióticos por separado, en este caso se dice que la acción es sinérgica. Sin embargo, la combinación de antibióticos presenta en algunos casos problemas de aumento de la toxicidad y de efecto antagónico de los antibióticos entre sí. 5,2

POTENCIA MICROBIANA - El crecimiento microbiano es demasiado rápido, por lo que la inhibición no se observó al tiempo de las 48 hrs, porque la cantidad de antibiótico era muy poco ante el crecimiento del microorganismo si se desarrolló aceleradamente. - A menudo, pero no siempre, entre mayor sea la concentración del agente químico o más intenso agente físico, más rápidamente se destruyen los microorganismos. Pero generalmente la eficiencia no está relacionada con la concentración o intensidad. TAMAÑO DE LA POBLACIÓN - Debido a que la muerte es exponencial, una población muy grande requiere de mayor tiempo; si la población era demasiada concentrada, el ajuste desde un inicio fue el más óptimo.

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TIEMPO DE EXPOSICIÓN -

Cuanto más tiempo se exponga una población a un determinado agente, más organismos se destruirán; y en este caso no fue suficiente y tiempo para que al antibiótico realizara la acción para inhibir el crecimiento del m.o por medio de su mecanismo de acción.

OTRAS - Algunos antibióticos son activos únicamente frente a bacterias en crecimiento e inactivos frente a esporas y a eucariontes; entonces una razón más es que la cepa esté contaminada o el crecimiento no sea el adecuado. - No es la cepa de Micrococcus luteus, ya que no hubo inhibición por pate del antibiótico. La eficiencia del antibiótico varía considerablemente con respecto a la naturaleza de los organismos que son tratados porque su susceptibilidad es distinta. Por ejemplo: las endosporas bacterianas son más resistentes que las células vegetativas, las células jóvenes mueren con mayor facilidad y algunas especies soportan mejor condiciones adversas.

CONCLUSIONES Aunque la práctica no cumplió los objetivos de determinar la potencia microbiana existente en los antibióticos de Ampicilina (genérica y patente), ni tiempo de predifusión; se observó mucho análisis del comportamiento de los antibióticos en general y los microorganismos ante ellos. Además del incumplimiento de los objetivos, la hipótesis se descarta por falta de información en los resultados obtenidos.

SUGERENCIAS Como sugerencia es realizar la práctica en diferentes condiciones, probar con otras cepas u otros antibióticos para lograr el objetivo.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Secretaria de Salud. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 11° Edición. Comisión Permanente de los Estados Unidos Mexicanos. México; 2014. 2- Tortora. Introducción a la microbiología. 9° Edición. Editorial Panamericana. México; 2007.

3- DIBICO. Medios de cultivo deshidratados y preparados para uso microbiológico. Revisado el 13 de marzo de 2016; Desde: http://www.dibico.com/productos.php?t=med&m=d&IdCat=1 4- Sánchez. Principios de Microbiología Industrial. Editorial Química S.A. de C.V. 1981.

5- S/A. Microbiología clínica. Control de microorganismos: Inhibición del crecimiento. Revisado el 13 de marzo de 2016; Desde: http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema08.pdf 6- Vademecum. Ampicilina. Revisado el 13 de http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/a052.htm

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