Plasmid Introduction Report Tri Parental Conjugation [pt]

Engenharia Biomédica 08/09 IST 3º Ano - 1º Semestre

Laboratório Engenharia Genética TP1

INTRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS EM BACTÉRIAS

Relatório elaborado por: • • • •

Ariana Gonçalves, nº 57301 Carlos Santiago, nº58445 Filipe Condessa, nº 58370 Miguel Machado, nº 58557

Introdução: Este  trabalho  experimental  teve  por  objectivo  transferir  DNA  recombinado  de  Escherichia Coli para Pseudomonas Aeruginosa por conjugação triparental.  Para  tal,  vai  utilizar‐se  uma  bactéria  –  P.  aeruginosa  mutante  –  à  qual  foi  retirado  o  gene  que  codifica  uma  proteína  bifuncional  com  actividades  de  fosfoglicomutase  e  fosfomanomutase  fundamentais  para  a  produção  do  polissacárido  alginato  (o  gene  algC)  e  tentar devolver‐lhe a capacidade de produzir essa proteína. Irá ser reintroduzido o gene algC  que lhe é natural, através do plasmídeo pNZ49, e também dois outros plasmídeos: o pLC100,  com o gene pgmG, e o plasmídeo pMM66(HE), onde o pgmG foi clonado. 

Mapas de restrição dos plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49.   Para introduzir os plasmídeos na bactéria, vai recorrer‐se a uma técnica à qual se dá o  nome  de  conjugação  triparental.  O  seu  nome  advém  do  facto  de  utilizar  um  intermediário  para tornar a conjugação possível. A conjugação é um fenómeno que pressupõe determinadas  condições para a sua realização. Por um lado, é necessário que o plasmídeo que pretendemos 

transferir possua um gene que o torne mobilizável entre células, o gene mob. Por outro lado, a  conjugação envolve a formação de uma estrutura que serve de “ponte” para a transferência  do plasmídeo, à qual se dá o nome de pilus; para que o pilus se forme, é necessária a presença  do gene tra na célula. Verificadas estas condições celulares, a conjugação é viável.   No caso dos plasmídeos utilizados neste trabalho: pLC100, pMMB66(HE) e pNZ49 são  mobilizáveis,  i.e,  contêm  o  gene  mob  (mob+).  Contudo,  não  são  autotransmissíveis,  pois  não  contêm o gene tra: são mob+tra‐. É nesta altura que se recorre a um terceiro elemento: uma  estirpe de E. coli que contém o plasmídeo pRK2013 portador dos genes tra e mob. Esta nova  estirpe,  ajudante,  quando  em  contacto  com  as  outras  estirpes  de  E.  coli,  transferirá  o  seu  plasmídeo,  conferindo‐lhes  a  capacidade  de  conjugação  com  a  P.  aeruginosa.  Nesta  altura,  apenas nos resta garantir que as condições físicas próprias para a conjugação se mantenham,  para  que  haja  transferência  dos  plasmídeos  das  estirpes  de  E.  coli  dadoras  para  a  de  P.  aeruginosa, receptora. Sabe‐se também que estes plasmídeos são suportados por uma vasta  gama de hospedeiros que sejam bactérias Gram‐negativas, podendo assim replicar quer em E.  coli  ,  a  célula  dadora,  quer  em  P.  aeruginosa,  que  neste  trabalho  funciona  como  célula  receptora.  Completada  a  experiência  de  transferência  do  plasmídeo,  há  que  evidenciar  que,  de  facto,  houve  reintrodução  de  um  gene  produtor  da  proteína  bifuncional  na  P.  aeruginosa.  E,  para verificar que a experiência foi bem sucedida, pode analisar‐se a expressão fenotípica do  dito  gene,  i.e.,  confirmar  a  formação  da  enzima.  Esta  confirmação  faz‐se  verificando  se  há  produção do exopolissacárido alginato, que, na prática, significa o aparecimento de um muco.  Contudo, é fulcral que se elimine do sistema as estirpes de E. coli, visto que estas também são  produtoras  de  fosfoglicomutase,  o  que  interferiria  com  a  avaliação  dos  resultados.  Esta  selecção é feita através do uso do meio PIA (Pseudomonas Isolation Agar), dado que E. coli não  cresce em meio PIA e que P. aeruginosa é naturalmente resistente a ampicilina. As placas de  PIA  contendo  carbenicilina  visam  seleccionar  os  transconjugantes  de  P.  aeruginosa,  ou  seja,  impede o crescimento de E. coli e também de P. aeruginosa que não contenham os plasmídeos  pLC100, pMMB66(HE) e pNZ49, visto que estes conferes imunidade à carbenicilina.           

Resultados: Para o cálculo da frequência recorreu-se à seguinte expressão: º

ê

é º

é

Para cada plasmídeo, o número total de células foi obtido a partir do cálculo das Unidades Formadoras de Colónias por volume (UFC/mL) resultantes da contagem do número de colónias formadas no meio de cultura PIA (não selectivo) para as concentrações 10-5, 10-6 e 10-7. Por sua vez, o número de células transformadas resulta o número de colónias formadas no meio de cultura PIA-Km (selectivo) para as concentrações 10-1, 10-2 e 10-4. De uma forma geral, as UFC/ml serão calculadas a partir da expressão: º

ó çã

10

Há que referir que não foram contadas as colónias para as concentrações mais elevadas, quer em meio PIA (10-5) quer em PIA-Km (10-1), devido ao seu elevado número. Plasmídeo pNZ49 Tabela 1. Estimativa de UFC/mL.

Meio de Cultura PIA-Km PIA-Km PIA-Km PIA PIA

Diluição -2

10 10-3 10-4 10-6 10-7

Nº colónias

UFC/mL

86 26 5 107 46

86000 260000 500000 1.07x109 4.6x109

Tabela 2. Frequência e valores médios de UFC transformadas e UFC totais.

Valor Médio de UFC Transformadas Valor Médio de UFC Totais Frequência

2.82x105 2.83x109 9.947*10-5

Imagem 1. Colónias de P. aeruginosa com o plasmídeo pNZ49.

Plasmídeo pMMB66(HE) Tabela 3. Estimativa de UFC/mL.

Meio de Cultura

Diluição

Nº Colónias

UFC/mL

PIA-Km PIA-Km PIA PIA

10-3 10-4 10-6 10-7

301 112 127 9

3.0x106 1.12x107 1.27x109 9.0x108

Tabela 4. Frequência e valores médios de UFC transformadas e UFC totais. 7.11x106 1.09x109 6.5x10-3

Valor Médio de UFC Transformadas Valor Médio de UFC Totais Frequência

Imagem 2. Colónias de P. aeruginosa com o plasmídeo pMMB66.

Plasmídeo pLC100 Tabela 5. Estimativa de UFC/mL.

Meio de Cultura

Diluição

Nº Células

UFC/mL

PIA-Km PIA-Km PIA-Km PIA-Km PIA-Km PIA PIA PIA

10-2 10-2 10-3 10-4 10-4 10-5 10-6 10-7

209 36 3 1 6 972 127 28

209000 36000 30000 100000 600000 9.72x108 1.27x109 2.61*109

Tabela 6. Frequência e valores médios de UFC transformadas e UFC totais. 1.95x105 1.681x109 1.160x10-4

Valor Médio de UFC Transformadas Valor Médio de UFC Totais Frequência

Imagem 3. Colónias de P. aeruginosa com o plasmídeo pLC100.

Antes da experiência: Tabela 7. Características dos Plasmídeos utilizados.

Plasmídeo

Hospedeiro

Descrição

Tamanho (Kb)

pMMB66(HE) pLC100 pNZ49 pRK2013

E.coli HB101 E.coli HB101 E.coli HB101 E.coli HB101

Vector, Apr Gene pgmG, Apr Gene algC, Apr Kmr, tra+

8.9 10.3 11.6 4.8

Tabela 8. Características das estirpes Bacterianas utilizadas.

Estírpe

Fenótipo

Genótipo

P. Aeruginosa 8858 E. Coli HB101

AlgF-

algChsr R, hsd M, rec A

Fenótipo

Genótipo

Depois da experiência: Tabela 9. Características observadas.

Estírpe

+

P. Aeruginosa 8858

Alg (img. 4) + Alg (img. 5) Alg (img. 6)

+

pgmG + algC pgmG ; algC

Imagem 4. P.aeruginosa com pLC100, 10-2, com formação de alginato

Imagem 5. P.aeruginosa com pNZ49, 10-2, com formação de alginato

Imagem 6. P.aeruginosa com -6 pMMB66(HE), 10 , sem formação de alginato

Gráfico 1. Logarítmo de frequência (ordenadas) em função do tamanho do plasmídeo (abcissas). 0 ‐0,5

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

‐1 ‐1,5 ‐2

pMMB66(HE)

‐2,5 ‐3 ‐3,5 ‐4 ‐4,5

pLC100 pNZ49

14000

Discussão:    A utilização da estirpe ajudante E. Coli HB101 foi fulcral para este trabalho dado que,  embora os plasmídeos pLC100, pNZ49 e pMMB66(HE) possuam o gene mob que permite a sua  mobilização, não possuem o gene tra, presente no plasmídeo pRK2013 de E. Coli HB101 e que  torna possível a criação do pilus e, consequentemente, torna a conjugação viável.   O  uso  dos  plasmídeos  pLC100,  pMMB66(HE)  e  pNZ49,  que  codificam  resistência  ao  antibiótico  carbenicilina,  garantiu  que  apenas  as  espécies  transformadas  se  desenvolvessem  no meio de cultura PIA‐Km. Contudo, deveriam ter sido efectuados ensaios de controlo para  confirmar  as  premissas  nas  quais  se  efectuaram  os  cálculos  das  frequências,  ou  seja,  que  apenas as espécies transformadas de interesse se desenvolveram em meio de cultura PIA‐Km.    A  existência  de  conjugação  triparental  foi  observada  pela  expressão  do  fenótipo  mucoso  aquando  da  utilização  de  apenas  dois  plasmídeos:  pNZ49  (algC  de  P.  Aeruginosa)  e  pLC100  (pgmG  de  E.Coli).  Dado  que  a  estirpe  receptora  é  uma  estirpe  de  P.  Aeruginosa  mutante  sem  capacidade  de  produção  de  alginato,  confirma‐se  que  estes  plasmídeos  codificam uma proteína bifuncional com actividade de fosfoglicomutase e fosfomanomutase.  Com  efeito,  o  fenótipo  mucoso  observado  recorrendo  ao  plasmídeo  pLC100  permite‐nos  concluir a existência de completamentação heteróloga, visto que o plasmídeo pLC100 contém  o gene pgmG proveniente de S. elodea. Da mesma forma, a observação do fenótipo mucoso  aquando  da  utilização  do  plasmídeo  pNZ49  permite‐nos  concluir  a  existência  de  completamentação homóloga visto este conter o gene algC de P. Aeruginosa. Por outro lado, a  não observação do fenótipo mucoso aquando da introdução do plasmídeo pMMB66(HE) seria  de esperar visto ser um vector sem genes para codificar proteínas bifuncionais com actividade  de fosfoglicomutase e fosfomanomutase, pelo que não poderia haver formação de alginato.    As frequências obtidas foram:  • 6.5x10‐3 para pMMB66(HE)  • 1.160x10‐4 para pLC100  • 9.947x10‐5 para pNZ49.    Apesar de não haver uma relação linear entre o tamanho do plasmídeo e a frequência  com  que  ele  é  transmitido,  para  estes  três  exemplos  ficou  provado  que  há,  de  facto,  uma  dependência.  Constata‐se  que  quanto  maior  é  o  tamanho  do  plasmídeo,  menor  é  a  probabilidade de este ser transferido para outras células, como seria  aliás de esperar.    Os  resultados  obtidos  vão  ao  encontro  do  que  é  dito  na  teoria,  pelo  que  se  pode  considerar que o trabalho foi bem sucedido.   

Bibliografia:   Arsénio Fialho, Jorge Leitão, Leonilde Moreira, Cristina Viegas e Isabel Sá‐Correia. Guia de  Trabalhos Laboratoriais de Engenharia Genética. Lisboa: Secção de Folhas da AEIST, 2008.  S.B. Primrose, R.M. Twyman. Principles of Gene Manipulation and Genomics 7th Edition.  Oxford: Blackwell Publishing 2007