Pi-25323-00-reapan S34

                                                                              

1 Test per tube

Product catalog No: 25323­00

ReaPan S34                                                                                   Manufactured by

                                        

    

   

 

11/10/2009

2

ReaPan S34 1. INTENDED USE The ReaPan S34    reagent uses principle of Immuno­fluorescence to enumerate  Hematopoietic   stem   cells   in   cell   preparations.   It   is   available   in   a   unitized,  dried­down   format   and   is   ideal   for   enumerating   viable   CD34+   cells   in  peripheral blood, cord blood, and mobilized stem cell preparations on a flow  cytometry platform. This reagent is intended for specific use on open system  flowcytometer. (Eg.BDFACScan™, BDFACSCalibur™ ,FACSCanto™) 2.BACKGROUND The ReaPan S34 allow for flow cytometry based rapid and accurate assessment of  live hematopoietic progenitor cells in accordance with the International Society of  Hematotherapy   and   Graft   Engineering   (ISHAGE)   guidelines.   Success   of  Hematopoietic transplantations and hematopoietic progenitor cell storage is relative  to the absolute live CD34+ hematopoietic progenitor cells (HPC’s).    

 

11/10/2009

3

The ReaPan S34 reagent facilitates a robust, single platform method of enumerating  viable human CD34+ cells. The CD34 antigen is  an 110Kda single chain type1  trans­membrane glycoprotein, associated with human hematopoietic progenitor cells  (1).   Reagent   contains   workshop   approved   anti   mouse   anti­human   monoclonal  antibody specific to the CD45 antigen, CD34 specific Class III mouse anti­human  monoclonal antibody, and 7­Amino Actinomycin­D (7­AAD) dye (for the detection  of dead cells).  Viability dye 7­ Amino Actinomycin D is a DNA intercalating agent that stains only  cells in the late phases of cell death when the integrity of both the cell and nuclear  membranes is lost(6). It is important to exclude CD34 dead cells to assist in counting  true live CD34+ cells (5). Investigators have demonstrated  that graft containing 4­ 5X 106     CD34+ cells /Kg recipient ideal body weight(IBW) will result in rapid,  durable, trilineage engraftment(4). 3. REAGENT    

 

11/10/2009

4

The ReaPan S34 reagent is formulated in buffered saline with sodium azide  and   stabilizers.   R­Phycoerythrin   (PE)   –   is   labeled   to   mouse   anti­human  monoclonal CD34 antibody (clone­581), Atto­488 labeled mouse Anti­human  CD45   antibody (clone­H130) and optimized concentrations of 7­AAD (1,7).  7AAD is important to exclude CD34 dead cells to assist in counting true live  CD34+ cells (5).  Specificity of the reagent enhanced by the use of class III  mouse   monoclonal   antibody   to   CD34.   Class   III   epitopes   have   broader  distribution on both normal HPC’s and blast cells (3, 4).    A precise number of  fluorescent beads are included to facilitate reference number for absolute cell  count. Reagent is provided as a ready­to­test, in flow cytometer compatible  sample tubes. 4.  Precautions • Warning: The ReaPanS34 reagent contains Sodium azide. Sodium azide is  harmful   if   swallowed.   Wear   suitable   protective   clothing.   If   swallowed,  seek medical advice immediately. Contact with acids liberates toxic gas.     

 

11/10/2009

5

• •

• •

   

 

Azide should be flushed with large amounts of water during disposal to  avoid deposits in lead or copper plumbing. Warning: All blood specimens are considered biohazards. Handle them as  if they are capable of transmitting infection and dispose off with proper  precautions in accordance with governmental regulations. Warning:  The ReaPan  S34 reagent  contains  7AAD­  viability dye.  Pure  7AAD   is   a   potential   carcinogen,   although   this   compound   is   highly  diluted in the reagent it is recommended to avoid contact with eyes and  skin. The addition of the precise volume of blood is critical to obtain correct  results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the  manufacturer’s instructions. The ReaPanS34 reagent and the reference count beads are in dried form.  It is critical to ensure vigorous vortexing after addition of blood sample  11/10/2009

6

to ensure solubilization of the reagent and the beads. (Note: Vigorous  Vortexing will not affect the CD34+ population). • The  Total leukocyte count should Not exceed 30X103   cells/µL and  CD34+ cell count should not exceed 2000 cells/ µL( Please perform  Dilution if the Count exceeds  above the mentioned value) • Stained samples must be analyzed within Three hours to ensure precise  viable cell counting. • The   use   of   temperatures   condition,   Incubations   time   and   mixing  (Vortex) other than specified, may give erroneous results. 5.  Storage and Handling

   

 

•

Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the  reagent after the expiry date. (Refer the label)

• •

Do not freeze the ReaPan S34™. The ReaPanS34 reagent is light sensitive.  Do not  expose to direct  11/10/2009

7

light either during storage or sample processing. 6.Indication of Stability :        ReaPan S34 reagent is a dry glassy coating at the bottom of the reaction tube.  Do not          use if the reagents appears to be moist or it has become dislodged from the bottom of 

        the reaction tube.

7. Instrument The   ReaPanS34   reagent   has   been   tested   on   the   FACScan™   and  FACSCalibur™,FACSCanto™   systems   manufactured   by   Becton­Dickinson  and other open Flow Cytometers. ReaMetrix recommends running this reagent  on   these   instruments.   The   instrument   should   be   calibrated   for   setting  photomultiplier   tube   voltages,   fluorescence   compensation,   and   checking  instrument sensitivity according to the manufacturer’s guidelines. It is the responsibility of the user to optimize the performance of the reagent  for use in flow cytometer other than those mentioned above. 

   

 

11/10/2009

8

8.    SPECIMEN COLLECTION Universal   precautions   and   good   laboratory   practice   (GLP)   should   be   adopted  while processing blood and human tissue samples. The peripheral  Blood, Placental  blood, Apheresis  sample or bone marrow  sample should be collected in a sterile blood collection tube containing K3­ EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the  minimum volume of blood to be collected. The   anti­coagulated   sample   must   be   stored   at   room   temperature   (20°C   ­  25°C)   and   should   be   analyzed   ideally   within   24   hours   of   collection   and  within three hours of staining. Cryopreserved   blood   and   bone   marrow   should   be   processed   preferably  within 30 minutes after thawing (7).

   

 

11/10/2009

9

9. PROCEDURE Reagent Provided ReaPan S34 reagent              Reagents and materials required but not provided

• Blood collection tube containing K3­EDTA • Calibrated pipettes • Vortex mixer

• ReaLyse   Lysing  Solution  (RMX  Catalog  No.  25237­00)   or  similar  blood fix/lyse solution. • Sheath fluid (BD FACSFlow™ Catalog No. 340398 or equivalent) • Calibrite Beads    

 

11/10/2009

10

Assay Protocol

•

Mix blood sample (invert blood tube at least 10 times) and pipette  50µL of blood into the single use ReaPanS34 reagent tube.

•

Vortex each tube thoroughly for 30 seconds. Incubate for 30 minutes  at room temperature. Protect the tube from direct light.

•

Add 450µL of ReaLyse™ or equivalent fix/lyse solution to each tube  and vortex for 20 seconds. Return tubes to the dark for at least 15  minutes to ensure complete lysis. Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto cytometer  for analysis.

•

•

Analyze   the   sample   within   3.0   hrs   from   staining   and   fixing   the  sample.

Flow Cytometer Acquisition and Analysis    

 

11/10/2009

11

This protocol assumes that the flow cytometer has been setup according to the  manufacturer’s   instructions   (For   example,   In   the   case   of   FACScan™,   the  instrument   should   be   setup   and   calibrated   using   CaliBrite™   beads   and  FACSComp™ software). Open the CellQuest™ Pro software and connect to  the cytometer.  The fluorescence filters referred to in the subsequent sections are given below:

• • •

FL1 – 530 ± 30 nm FL2 – 585 ± 42 nm

FL3   –   670   nm   LP   (BD   FACSCalibur™)   or   650   nm   LP(BD  FACScan™) Instrument Setting: Before   collecting   the   sample   data   it   is   necessary   to   optimize   instrument  electronics   for   acquiring   good   quality   data.   Instrument   controls   (detectors,  compensation, threshold and amplifiers) are adjusted optimally to display cell     

 

11/10/2009

12

population of interest (This step is critical and must not be skipped to ensure  the accuracy of the test results). • Follow manufacturer’s guidelines to calibrate the system.

• Change the threshold channel From FL3 to FL1 (300±50) ISHAGE recommended cell enumeration strategy:  CD45+   events   are   selected   precisely   to   include   all   the   CD45+   cells   to  establish   the   minimum   size   range   for   lymph   blast   region   (R1).The   lower  extremity of R1 is set low enough to include all CD45+ dim CD34+events. It  has been demonstrated that the pre­selection of Lymphocytes increases  the  specificity   of   the   test   by   eliminating   nonspecifically   stained   debris   and  platelets  (1).  Region­2 is  adjusted to select  all  the CD34+  dim  and  bright  population to include all CD34+ cells. Region 3 is created as an amorphous  region   to   best   delineate   live   from   dead   cells.   Region   ­4   is   gated   on   the  cumulative regions R1, R2&R3 which demonstrates CD34+ cells which CD45     

 

11/10/2009

13

dim and are live.CD34+ positive cells share the morphological characters of  lymphocytes.   True   live   CD34+   cells   are   selected   on   Region­6(R6)   by  Intersecting   R1*R2*R3*R4   cell   population   with   respect   to   lymphocyte  population (View­5) and by eliminating platelet aggregates and monocytes (1) Draw dot­plot (View­1 View­2, View 3, View­4, View­5, View 6, View­7, and View­8

•

View­1: CD45­A488 fluorescence (FL1) versus side scatter (SSC­Lin ­                      scale).

•

View­2: CD34­PE Fluorescence (FL2) versus side scatter(SSC­Lin­                        scale)  

•

View­3: 7­AAD fluorescence (FL3) versus side scatter(SSC­Linear                      scale) 

•    

 

View­4:CD45­A488 Fluorescence(FL1) versus side scatter(SSC­                     Linear scale) 11/10/2009

14

•

View­5 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ for CD45                      reference

•

View­6 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ for                      Absolute CD34+ cell counting

•

View­7 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ For                         selection of beads.

•

View­8 CD45­A488 Fluorescence (FL1) versus 7­AAD Fluorescence                         (FL3) For selection of beads.

 Set the number of events to capture at 3000 for R8 gate (View8)

   

 

11/10/2009

15

     

View­1

View­2

View­3

Dot plot views:

• •    

 

View­1 CD45­A488 fluorescence (FL1 ­ log scale) versus side­scatter (SSC – Lin scale)  to establish lymph blast region.  View­2  CD34­PE   fluorescence   (FL2­log)   versus  –side   scatter  (SSC   –  Lin   scale),   to  capture CD34+ cells (R2),   11/10/2009

16

•

View­3  7­AAD   fluorescence   (FL3­log)   versus   –side   scatter   (SSC   –   Lin   scale),   to  eliminate dead cells from live cells (R3)  

View­4

Dot plot views: 

•    

 

View­5

View­6

View­4  Intersection population of (R1*R2*R3) fluorescence (FL1 ­ log scale) versus  side­scatter (SSC – Linear scale) to capture CD34+ cells (R4). 11/10/2009

17

• •

View­5 CD45­A488 (R5) population plotted on forward scatter (FSc­Lin) versus –side  scatter (SSC – Lin) as a reference plot for scatter properties. View­6 R4 gate applied on forward scatter (FSc­Lin) versus –side scatter (SSC – Lin). ,  to eliminate non CD34+ cells (R3).  

 

View­7

View­8

View­9

Dot plot views:    

 

11/10/2009

18

• • •

View­7  Beads (R7) population is selected on forward scatter (FSC­Lin) versus –side   scatter (SSC – Lin). View­8  Beads   (R7)   population   plotted   on   forward   scatter   (FSC­Lin)   versus   –side  scatter (SSC – Lin)to eliminate any cell contamination and get absolute beads count.  View­9 population plotted on forward CD45­A488 (FL1­Log) CD34­PE (FL2­Log) to  refer the threshold on FL1 Channel and avoid any loss of CD34+ cells. 

10. Calculations for CD34+ Counts:       Use the following Equation to enumerate absolute live CD34+ cell events        Acquire the regional stats for R6 on View ­6 for CD34+ live    Cells.       Acquire Gate Stats for G8 for bead events (R8) on view8.       Viable CD34+ cells/µl =     

 

11/10/2009

19

                             CD34+ events in region R6       Beads per Test

                           ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­X ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ X Dilution                               Bead events in ( R8)                Sample Volume µl (50)

*The bead per test value is provided on the reagent pouch and varies form lot to  lot. 11. WARRANTY. This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated  on the label at the time of delivery to the customer. There are no warranties,  expressed or implied, that extend beyond the description on the label of the  product. ReaMetrix’s  sole liability is limited to replacement  of the product.  Reametrix is not liable for property damage, personal injury, or economic loss  caused by the product.     

 

11/10/2009

20

Note: FACScan, CaliBRITE, FACSLyse, FACSComp, FACSCalibur are all registered   trade names of Becton­Dickinson. 

   

 

11/10/2009

21

12. REFERENCES 1. Sutherland DR., Marsh J.C. , David J. et al, Differential sensitivity  of   CD34   epitopes   to   cleavage   by  pasteurella   hemolytica  glycoproteases   implication   for   purification   of   CD34     Positive  progenitor cells. Exp Hematol 1992;20;590­599. 2. Michael  Keeney,Ian  Chin Yee,  Karin  Weir,  Jan Popma, Rakash  Nayar   and   D.Robert   Sutherland.Single   platform   cytometric  absolute   CD34+   cell   counts   based   on   the   ISAGE   guidelines.  Cytometry (Communications in clinical cytometry) 34:61­70(1998)  3. Mario   Otto,Xiaohua   Chen,William   J.Martin,Wing   Leung,James  Knowles,Marti  Holladay,Jim  Houston, Rupert  handgretinger  and  Raymond C. Barfield.­Selection of stem cells by using antibodies     

 

11/10/2009

22

that target  different  CD34 epitopes yields different patterns of T  cell differentiation Stemcells :2007:25:537­542.  4. 5. SJ Noga,GB Vogelsang, SC Miller, S Meusel, K Loper, R Case, B  Myers,  L  Rogers,   I  Flinn,  M  Borowitz   and  PO  Donnell.  Using  point   of   care   CD34   enumeration   to   optimize   PBMC   collection  conditions. CytoTherapy(2001) vol 3, No.1, 11­18. 6. P.Pranke, J.Hendrikx, G.Alespeiti,N.Nardi, P.Rubinstein, J.Visser­ Comparative  quantification of Umbilical  cord blood CD34+ and  CD34+   bright   cells   using   the   Procount™   BD   and     ISHAGE  protocols.­Brazilian   journal   of   medical   and   biological   research(2006)39:901­906. 7. Heeje Kim, Katharine A. Whartenby, Robert W. Georganatas III,  John Wingard, Curt I. Civin. Human CD34+ Hematopietic stem /     

 

11/10/2009

23

Progenitor cells express high levels of FLIP and are resistant to Fas  mediated Apoptosis. Stem Cells 2002; 20; 174­182. 8. AFCG Guidelines 2006

             

          

   

 

11/10/2009

24

Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.                50­B, II Phase, Peenya Industrial Area Peenya, Bangalore 560058, India Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451 E­mail: [email protected] www.reametrix.com Rev No. 2.0,  14­Apr­09

   

 

11/10/2009

25