Pi 25242 00 Rea T Count (cd4cd3)

1 Tube per test

Product catalog No: 25242­00

Rea T­Count CD4/CD3 Reagent

                                                                    

   Manufactured by 

     Rea T­Count Reagent­ CD4/CD3 1. INTENDED USE The Rea T­Count reagent is a two color immunofluorescence reagent  for   the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD3+CD4+)   T  lymphocytes combined with a precise number of fluorescent counting  beads   for   absolute   CD4+   and   CD3+   T­Cell   counts.     This   reagent   is  intended   for   flow   cytometry   based   analysis   in   unlysed   human   whole  blood samples. 2. BACKGROUND The Rea T­Count reagent contains fluorescently labeled antibodies that  bind   to   CD3   and   CD4   antigens   found   on   the   surface   of   circulating  leukocytes. The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known  collectively as the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in  this   reagent   binds   to   the   20kDa  ε   chain   of   this   complex.   The   CD4 

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antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of the  major   histocompatibility   complex   and   is   the   primary   receptor   for   the  Human Immunodeficiency Virus (HIV). Cells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer  lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ cell counts have been associated  with some forms of immunodeficiency. 

3. Rea T­Count Reagent The Rea T­Count reagent contains dried down reagents formulated in  buffered   saline,   sodium   azide   and   stabilizers.   The   reagent   has   CD4  monoclonal  antibody  (clone  RPA­T4)  labeled  with  Phycoerythrin   (PE)  and   CD3   (clone   UCHT1)   monoclonal   antibody   labeled   with   PE­ Dyomics649. The   monoclonal   antibodies   used   in   the   Rea   T­Count   were   assigned  these   specificities   at   the   8th   International   Workshop   on   Human  Leukocyte   Differentiation   Antigens.   A   precise   number   of   fluorescent  counting   beads   are   included   in   each   tube   to   allow   single­platform  determination of  absolute CD4+  and  T­cell counts. The  Rea T­Count 

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reagent   is   provided   in   dried   form   and   dispensed   in   FACSCount TM  compatible   sample   tubes   with   each   unit   containing   one   ready­to­use  test. Precautions 1. Warning: The Rea T­Count reagent contains sodium azide. Sodium  azide is harmful if swallowed. Wear suitable protective clothing. If  swallowed,   seek   medical   advice   immediately.   Contact   with   acids  liberates toxic gas. Azides should be flushed with large amounts of  water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing. 2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   bio­hazardous.  Handle   them   as   if   they   are   capable   of   transmitting   infection   and  dispose   off   with   proper   precautions   and   in   accordance   with  governmental regulations. 3. The addition of precise volume of blood is critical to obtain correct  results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the  manufacturer’s instructions.

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Storage and Handling 1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use  the reagent after the expiry date on the label. 2. Do not freeze Rea T­Count reagent. 3. The Rea T­Count reagent is light sensitive. Do not expose to direct  light either during storage or when mixed with blood. 4. INSTRUMENT The   Rea   T­Count   reagent   is   designed   to   be   used   on   FACSCount TM  manufactured by Becton Dickinson equipped with a convection cooled  540nm   laser   that   is   capable   of   detecting   two   fluorescent   colors   and  measures relative cell size. The CD3 cells fluoresce red and CD4 cells  fluoresce yellow. This instrument can be used for enumerating absolute  lymphocyte   counts   namely;   helper/inducer   (CD3+CD4+).Instrument  should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube   voltages,  fluorescence   compensation,   and   checking   instrument   sensitivity  according to the manufacturer’s guidelines.

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5. SPECIMEN COLLECTION The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube  containing   K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s  guidelines for the minimum volume of blood to be collected. The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­  25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.   Refrigerated,   hemolyzed,   and   previously   fixed   blood   specimens   can  yield erroneous results and should be rejected. 6. PROCEDURE Reagent Provided

1. Rea­T Count Reagent­ Part No: 25242­00 2. ReaFix Fixative solution (10X concentrate)­ Part No.:25325­00 3. ReaFix Diluent Solution­ Part No.:25326­00 6

Refer to the ReaFix Fixative solution (10X) package insert for  dilution instructions and warnings. Reagents and materials required but not provided

1. Blood collection tube containing K3EDTA

2. Calibrated pipettes 3. Vortex mixer 4. Becton Dickinson FACSCountTM  Instrument (Becton Dickinson Cat  No: 337858) 5. Sheath fluid (Becton Dickinson FACSFlow™ Catalog No. 340398 or  equivalent) 6. BD FACSCountTM Control kit (Becton Dickinson Cat No: 340166) 7. BD FACSCountTM Reagent CD4/CD3 Kit to set up controls (Becton  Dickinson Catalog No. 342512) Preparation of Control Samples

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Follow   Manufacturer   instructions   for   setting   up   the   control   in   the  FACSCountTM  Instrument  (Use BD FACSCountTM  Reagent  for setting  the control) Preparation of the patient samples

1. Blood samples must be collected in a (K3EDTA) vacutainer tube and  be stored no longer than 48 hours at room temperature.

2. Take one reagent tube per patient from the foil bag containing the  3. 4.

5. 6. 7.

Rea T­count tubes. Reseal the foil bag and return unused reagent  pairs to the appropriate place. DO NOT refrigerate the reagents. Label the reagent with the sample number found on the blood tube. Mix patient blood by inverting the tube 5 times. Reverse Pipette 50 µL of whole blood into the reagent tubes. Use a  new pipette tip for each tube. Cap the tubes and vortex vigorously for 30 seconds. Incubate   for   60   minutes   at   room   temperature.   Place   the   reagent  tubes in the workstation and close the cover to protect the reagents  from light.

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8. Uncap tubes and pipette 450 µL of ReaFix fixative solution into the 

reagent   tube.   Use   a   new   pipette   tip   for   each   tube.  Refer   to   the  ReaFix Fixative solution (10X) package insert for dilution instructions  to prepare 1X working ReaFix Fixative Solution 9. Recap the tubes and vortex for 15 seconds. 10. Run the tubes on the FACSCountTM within 24 hours of preparation.  Store samples at room temperature in the workstation until they are  run on the instrument. Vortex upright for 5 seconds before running. Entering patient information 1. Press [sample]. 2. Enter or verify reagent lot code and bead counts as provided on Rea T­ Count pouch. 3. Press [confirm] 4. Enter the patient accession number Running patient samples 1. Vortex the reagent pairs for 15 seconds.

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2. Uncap the reagent tube and place the reagent tube in the sample  holder so the CD4 tube is in the run position. 3. Press [run]

4. After a successful run the results will print out. If the sample fails  review reported error and refer to BD FACSCountTM guide to rectify  problem. 5. The patient results are displayed on the screen and automatically  printed. 6. The sample printout contains the following information: 7. Reagent information­reagent lot code and reference bead counts entered  for the sample run.  (This number should match the reagent lot code for  the control run.) 8. Date (mm / dd / yy) and time the patient sample was run 9. Control information­control run results, date controls were run, reagent lot  code entered for the control run, control lot code. 10. Patient accession number 11. Patient results 

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12. Absolute Counts ­ cells/µl of CD4 & CD3 13. A sample report is attached below (Figure 1) 14. Remove the reagent tube, recap the reagent tube and discard in the  biohazard waste container. 15. Repeat above steps until all patient samples have been run. 16. Discard the reagent pair in an appropriate biohazard container. 17. Shut down instrument as per manufacturer’s instructions. 18. A sample report is generated after every sample run. The sample  report is attached below (Refer Figure 1).

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Figure 1: Patient Sample Report

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7. LIMITATIONS    1. The Rea T­Count reagent has only been validated with K3EDTA or  K2EDTA treated whole blood. 8. WARRANTY This product is warranted only to conform to the quantity and contents  stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no  warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on  the label of the product. ReaMetrix sole liability is limited to replacement  of   the   product.   ReaMetrix   is   not   liable   for   property   damage,   personal  injury, or economic loss caused by the product.  Note: FACSCountTM is a registered trade name of Becton­Dickinson. 

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Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd. Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006 50­B, II Phase, Peenya Industrial Area Peenya, Bangalore 560058, India Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451 E­mail: [email protected], 

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www.reametrix.com Rev No. 3.0,  14­Oct­09

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