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物理化学学报（ !"#$ %"&’"( )"(*&+ ） ,-.& /0123 450$63 7$8$ % !""#，!"（ !& ）：!!"# ’ !!"(

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用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片% 洪

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5 ! 北京大学生命科学学院E

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芳#

赵新生 #

分子动态与稳态结构国家重点实验室%

北京大学化学与分子工程学院化学生物学系 % 北京 摘要

朱圣庚 !

!&&"2! I

将 0 个鼠源噬菌体抗体克隆和 ! 个人源噬菌体抗体克隆偶联到羧基终止的硅片表面% 制成分析型模型芯

片 $ 挑选健康人体淋巴细胞为正常细胞的代表% O.P8 细胞为肿瘤细胞的代表% 提取细胞的全部蛋白质并用荧光 染料 QR3 标记 % 与制成的分析芯片反应 % 得到了不同的结合图谱 $ 实验结果表明 % 以噬菌体抗体为分子感受器的 分析芯片可用于识别不同细胞的蛋白质组 $ 关键词4

噬菌体抗体库%

中图分类号 4

S(!%

生物传感器%

噬菌体抗体芯片%

蛋白质组

SG2

由于长期分子进化的结果% 抗体获得了识别各

例% 但还未有直接用噬菌体抗体制备芯片的报导 $

种生物分子的能力% 并且具有高灵敏度、高特异性

本文首次将噬菌体抗体芯片的思想从实验上给予

和识别范围广的特点 % 是分析型芯片最常用的分子 感受器 M !1# N $ 然而目前已商品化的抗体种类有限% 其

实现 $ 我们从噬菌体抗体库中挑选了几个克隆 % 经

中相当部分只针对几类蛋白质 5如细胞因子 I $ 通过

硅片上% 制成一个简单的分析型蛋白质芯片% 并证

动物免疫或杂交瘤途径产生抗体不仅耗时、费力%

实其具有识别不同蛋白质 5组 I的能力 $

测序验证为正确的单链抗体后% 偶联到羧基终止的

还难以获得某些抗原 5如自身抗原、毒性蛋白或低 免疫原蛋白 I 的抗体 M3 N $ 因此% 发展蛋白质芯片首先

$

面临的问题是如何高通量地获得各种抗体分子

$% $

M 01( N

$ 另外% 与 TUV 分子的结构相比% 蛋白质有着较为复

实验部分 试

剂

杂的空间结构特征% 将蛋白质偶联到芯片上有可能

鼠源及人源噬菌体抗体库为本实验室构建 $ QR3 荧光标记试剂盒购自 X<8/78*98 公司 $

破坏蛋白质的空间结构% 使蛋白质丧失活性 $ 特别

$% !

对于分子量较大 5 W !& T8:+,D I、结构较复杂的抗 体% 偶联到芯片后能否保持活性也是制备抗体芯片 所要考虑的问题 $ 我们认为利用噬菌体抗体制备生物芯片有可 能解决上述两个问题 $ 从噬菌体抗体库中可以方 便获得各种噬菌体抗体% 并且只需分离克隆就能得 到纯的展示抗体 $ 此外% 由于噬菌体是一个丝状 体% 总会有一半以上展示在噬菌体上的单链抗体既 不会受到化学修饰% 也不会与芯片基底发生疏水相 互作用% 从而最大限度地保护了单链抗体的活性 $ 迄今为止% 用抗体制备蛋白质芯片已有许多的实 #&&01&21&2 收到初稿% #&&01&213& 收到修改稿 $

抗体库中分别挑选 0 个和 ! 个重组噬菌体克隆% 经 扩增后由博亚公司 5 Y9,8>98 Q,$ I测定其单链抗体的 核苷酸序列% 根据 Z8-8+ 规则% 定义各 QT[ 5互补决 定区域 I $ 将上述抗体克隆分别培养至对数生长期% 加 入 辅 助 噬 菌 体 \!3Z)2 进 行 超 感 染 $ 菌 体 用 #]F1VZ 液体培养基于 3& ^ 振荡培养过夜 $ 经两 次 X6L 5 聚乙二醇 I _ U8Q: 沉淀和一次乙酸沉淀分 离重组噬菌体% XY‘ 5 @O a 2$ 0% 磷酸缓冲溶液 I 溶解 后经 &$ 0( !7 滤膜过滤除菌 $ 测定重组噬菌体的 滴度% 用 XY‘ 将滴度调整为 !&!# *bB 5 菌落形成单

联系人4 赵新生 5 61789:4 ;<8,=>?@AB$ .CB$ *DE F.:4 &!&1G#2(!2#2E H8=4 &!&1G#2(!2&" I E

朱圣庚 5 61789:4 ;J? @AB$ .CB$ *DE F.:4 &!&1G#2((0(3E H8=4 &!&1G#2(!(#G I $ 研究发展规划 5 L!KKK&2(3&( I资助项目

实验步骤 5 ! I 噬菌体抗体的制备4 从鼠源和人源噬菌体

(

%

国家自然科学基金 5 #KK23&&3% #&333&!& I 和国家重点基础

2+% !’

赵新生等：用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片

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位 $ % 偶联前& 向各噬菌体抗体溶液中加入 !’( )体

噬菌体覆盖的硅片& 用 ?Y< 对其表面形貌进行

积浓度 $ 活化试剂 ) !’’ **+,・- /01 )碳二亚胺 $ 和 !’ **+,・- . ! 234 ) !5 乙酰琥珀碱 $ $ %

了纳米尺度的表征 % 扫描采用单晶硅针尖& @FLL;GR 模式& 以减少由于针尖与表面接触而导致的形貌的

) 6 $ 噬菌体抗体芯片的制备7 噬菌体抗体芯片

破坏 % 整个图像的尺寸为 6!*% 图 ! 显示表面固定

.!

所用硅基底均按已发表方法处理

% 将表面覆盖有 自然氧化硅的硅片先腐蚀成 4; . 3 表面& 然后与 89 :

噬菌体的形貌 & 我们发现共价连接的噬菌体能保持 其正常生理条件下的细丝状形态& 噬菌体呈致密排

!’5 十一碳烯酸甲酯在紫外光引发下反应& 使硅片 表面形成酯基终止的致密有机膜 % 最后通过酸化&

布& 并具有基本相同的取向& 这样的固定有利于保

形成羧基终止的有机覆盖膜 %

!" !

持噬菌体的生物活性 %

将处理好的硅片置于手动点样仪)<;=>+1?4@A>& 4B4 =+% ,CD& EA>*FGH $ 上& 通过接触式点样& 蘸取已 活化的重组噬菌体抗体溶液到羧基终止的芯片表 面& I J 偶联过夜 % 用原子力显微镜 2FG+ KKKF ) 0K =+*LFGH& M4? $ 观察噬菌体固定在芯片上的表面 形貌 % 检测前使用 ’% !( NO4@ )含 ’% !( 体积吐温 6’ 的 NO4 $清洗硅片 % ) # $ 细胞蛋白质的提取及标记7 用密度梯度离

全蛋白结合的荧光信号 芯片表面荧光成像的工作由灵敏度最高的激 光 共 聚 焦 扫 描 仪 完 成 & 扫 描 的 空 间 分 辨 率 为 !’ !*& 扫描的结果由扫描软件自动合成出图 6 所示 的荧光点阵图像& 斑点的亮度与该点实际的荧光强 度成正比& 所以该图像可以给出非常直观的点阵图 像的对比 % !" ;

心法分离健康人体外周血中的淋巴细胞& 用尖嘴滴 管吸出位于界面的淋巴细胞 % 3A-F 细胞按常规方 法在 P;C+G5!’’ 悬浮细胞& 经 9’’ R 离心 !’ *;G& 收集上清液 % 将上清液转移到 新的离心管& S’’’ R 离心 !’ *;G% 同样将上清液转

激光共聚焦扫描系统检测芯片与不同细胞

检测分析芯片与不同细胞全蛋白结合的荧 光信号 为进行精确的数据比较& 我们分别对图 6 中代

表不同噬菌体结合蛋白强度的荧光圆点用芯片统 计软件 EAGAN;V N>+ S% ’ 进行了统计& 统计所得平均 值以及标准偏差绘成图 #%

;

讨

论

与传统的研究方法相比& 蛋白质芯片具有较

移到新的离心管& "’’’ R 离心 !’ *;G% 再将上清液 !’’’’ R 离心 9’ *;G& 获得的上清液即为细胞的全

多优点 7 它可以对细胞蛋白质样品实现高通量分

蛋白溶液 %

平可达纳克级Z 操作简单& 易分析& 可以立即获得结

析Z 可以检测出样品中微量蛋白质的存在& 检测水

按照试剂盒的说明对全蛋白进行荧光标记& 并 与游离的荧光染料分离 % ) I $ 分析芯片对不同细胞全蛋白的检测7 用 6( NO4< )含 6( 体积脱脂奶粉的 NO4 $ 将偶联有噬菌 体抗体的蛋白质芯片在 #T J 封闭 ! U% 同时用等体 积 的 I( NO4< 封 闭 1H# 标 记 的 全 蛋 白 & 后 用 ’% !( NO4@ 洗涤芯片三次 % 将芯片置于细胞培养 板中& 用 1H# 标记的全蛋白没过芯片& #T J 反应 6 U% 用 ’% !( NO4@ 洗涤芯片三次 % 通过激光共聚焦扫描系统 ) 4=FG?>>FH /VL>AWW& NA>X;G5A,*A> KG=%& M4? $检测荧光信号 %

! !" #

结

果

利用原子力显微镜 $%&’ (观察噬菌体与硅 片的偶联

图#

噬菌体抗体偶联在硅片表面的原子力 显微镜照片

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图8 "#$% 8

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细胞全蛋白与分析芯片的反应图谱

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果 ’ 因此可以广泛用于生物学和医学的研究与实 践’ 通过传统免疫或杂交瘤等途径获得抗体费时、

J)) 个抗体探针 5有代表性的抗体制备芯片 + 蛋白质 组的差别即可从芯片图谱上反映出来 D!-F!J G ’ 我们用

费力+ 只适用于生产低密度的抗体芯片+ 无法满足

J 个噬菌体抗体克隆制备简单的芯片作为模型+ 与 两种细胞全蛋白反应+ 结果如图 - 所示 ’ 从图中可

制备高密度蛋白质芯片的要求 ’ 而噬菌体抗体是将

以看出+ 各噬菌体抗体克隆反应的信号不同+ 两种

抗体片段以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面+

细胞蛋白质组得到了不同的图谱 ’ 通过这个图谱+

保持了抗体相对独立的结构和功能+ 是极有希望应 用于分析芯片的分子感受器 ’ 通过噬菌体抗体技术

我们可以清晰地分辨出正常淋巴细胞和癌变 *16/ 细胞 ’ 在后续的工作中+ 我们将筛选出更多的展示

可以建立快速、廉价、高通量地获得抗体克隆的方

了抗体的噬菌体+ 制作成更大规模的点阵芯片+ 这

法+ 有望解决制约蛋白质芯片发展的瓶颈难题

样将更加确切地得到不同细胞间的差别图谱 ’

D EF!) G

’ + 已超

目前噬菌体抗体库的容量可达到 !) :BC 过体内 H 细胞的数目 ’ 因此+ 从理论上说+ 如果分

已无针对自身抗原的淋巴细胞克隆+ 这可能是鼠源

离到细胞中的各种蛋白质+ 就能够分别以这些蛋白

噬菌体抗体与两种人源细胞全蛋白反应信号高于人

质为抗原对噬菌体抗体库进行淘选+ 获得它们的特

源噬菌体抗体的原因+ 其中以 ,- 反应差异最大 ’

异单链抗体 + 以这些单链抗体制备的抗体芯片就可

通过这个结果+ 我们证明利用这种方法+ 可以进行

以获得整个蛋白质组的表达图谱 ’

更高通量地筛选针对某种细胞有高选择性的噬菌

!)

D!!F!( G

事实上+ 为了检测细胞蛋白质+ 无需获得各蛋 白质抗原一一对应的抗体 ’ 选择适当数量 I 例如

由于胚胎时期自身抗体克隆的消除+ 外周血中

体抗体 ’ 本文仅以 J 种噬菌体抗体克隆制成芯片+ 代表性不够+ 但从方法学上看+ 已初步得到肯定的 结果+ 证实了噬菌体抗体芯片思想的可行性 ’ 9*0*)*-,*+ ! (

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图!

噬菌体抗体芯片与不同细胞全蛋白反应的结果

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