Perlu Ditambahin Lagi.docx

MAKALAH HIBRIDISASI DNA

Disusun untuk Memenuhi Tugas Bioteknologi Farmasi Dosen Pengampu : Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt.

Disusun Oleh : Amelia Windi Astutik (162210101003) Yuniar Aisyah (172210101005) Ainun Nazizah (172210101017) Faradia Salsabela (1722101010 Dinar Mutia Rani K (1722101010

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2019

2

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah Yang Mahas Esa karena berkat limpahan rahmat-Nya, kami dapat menyelesaikan tugas makalah mata kuliah Bioteknologi Farmasi dengan judul “Hibridisasi DNA”. Kami juga mengucapkan banyak terimakasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam pengerjaan makalah ini. Kami juga menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat pada makalah ini, oleh karena itu kami mengharapkan saran dan masukan yang membangun agar kami dapat berbuat lebih banyak di kemudian hari. Semoga makalah ini berguna bagi penulis pada khususnya dan pembaca pada umumnya.

Jember, 28 Februari 2019

Penulis

3

DAFTAR ISI

4

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pentingnya gen merupakan bagian dari genom yang membawa sifat suatu organisme dalam melakukan riset biologi molekuler dan pengembangan bioteknologi melatar belakangi adanya teknik hibridisasi. Identifikasi dan karakteristik gen sering diperlukan untuk penelitian molekuler antara lain isolasi, kloning maupun ekspresinya. Maka dari itu, pelacak spesifik gen diperlukan untuk mengidentifikasi keberadaan atau ekspresi dengan mudah dan akurat. Hibridisasi adalah mekanisme dasar di balik uji-uji diagnostik yang menggunakan probe asam nukleat. Teknik ini didasarkan pada perpaduan dua basa nukleotida dan rantai asam nukleat yang komplementer, misalnya DNA dengan DNA atau RNA; RNA dengan RNA. Uji-uji yang menggunakan hibridisasi membutuhkan proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti membran nilon atau nitroselulosa. Prinsip pemindahan DNA dari gel menuju membran berlangsung secara kapileri, dengan demikian sistem yang digunakan adalah capillary transfer. Kemudian, suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. DNA probe adalah suatu fragmen DNA, RNA, atau protein pelacak target gen. Proses hibridisasi juga dapat dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan ke dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada jika hibridisasi dilakukan pada bahan solid. Hal ini sangatlah penting dalam aplikasi sebagian besar diagnostik mikrobiologi, terutama yang memiliki konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. 1.2 Rumusan Masalah 1. Apa pengertian dari hibridisasi DNA? 2. Apa tujuan dilakukannya hibridisasi DNA? 3. Bagaimana proses hibridisasi DNA? 4. Bagaimana hasil dari metode hibridisasi DNA? 5. Apa perbedaan teknik hibridisasi DNA dengan teknik yang lain? 5

6. Bagaimana aplikasi hibridisasi DNA dalam bidang kesehatan? 1.3 Tujuan 1. Dapat mengetahui pengertian dari hibridisasi DNA. 2. Dapat mengetahui tujuan dilakukannya hibridisasi DNA 3. Dapat mengetahui proses hibridisasi DNA. 4. Dapat mengetahui hasil dari metode hibridisasi DNA. 5. Dapat mengetahui perbedaan antara teknik hibridisasi DNA dengan teknik yang lain. 6. Dapat mengetahui aplikasi hibridisasi DNA dalam bidang kesehatan.

6

BAB II PEMBAHASAN 2.1 Pengertian Hibridisasi DNA Hibridisasi merupakan proses identifikasi gen-gen hasil analisis RFLP dengan menggunakan restriksi enzim yang sesuai dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang spesifik yang telah diberi label baik radioaktif maupun non-radioaktif. Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarosa ke nilon berpori atau membran nitroselulosa, pada tahap ini sangat disarankan menggunakan membran nilon karena DNA akan berikatan lebih kuat dibandingkan di membran nitroselulosa. Hibridisasi asam nukleat merupakan salah satu teknik yang sekarang digunakan secara luas dalam biologi molekuler. Teknik ini sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA. Hibridisasi dapat diterapkan pada beberapa keperluan seperti mencari informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetik dan sidik jari DNA. Transfer DNA disebut dengan Southern Blotting, mengacu pada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Southern transfer dan hibridisasi DNA digunakan untuk mempelajari bagaimana peran den dalam genom dengan penetapan titiktitik restriksi dan segmen DNA genomik. Pada protokol dijelaskan, pertama DNA genomik dipotong dengan enzim restriksi dengan teknik RFLP, hasil pemotongan dengan teknik RFLP ini dipisahkan dengan gel elektroforesis, dan transfer kapiler ke membran yang telah didenaturasi. Semua fragmen hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membran tersebut dalam bentuk untai tunggal. Pola fragmen akan sama dengan yang ada pada gel. 2.2 Tujuan Hibridisasi DNA Hibridisasi DNA saat ini sangat diperlukan dalam pengembangan teknologi, khususnya teknologi kesehatan, karena aplikasi

dari hibridisasi DNA tersebut dapat

diterapkan pada : 1. Mencari informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom 2. Analisis transkripsi dan regulasi DNA 3. Deteksi penyakit genetik dan sidik jari DNA

7

2.3 Proses Hibridisasi DNA Tiga komponen yang diperlukan dalam hibridisasi DNA : DNA target, DNA probe, dan sistem deteksi. Teknik hibridisasi meliputi dua proses yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer, dan proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa, sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan. Kondisi yang dapat mempengaruhinya adalah apakah dua rantai asam nukleat akan berhibridisasi dengan daya ikat yang kuat. Kondisi ikatan yang kuat akan mendukung perpaduan dua basa dari dua rantai yang komplementer dengan tepat, sedangkan kondisi ikatan yang lemah akan menyebabkan banyaknya perpaduan dua basa yang tidak sesuai di antara dua rantai asam nukleat DNA yang ditransfer pada nilon berpori atau membran nitroselulosa. Proses selanjutnya adalah hibridisasi dengan probe. DNA probe yang telah dilabel akan berkomplementasi dengan target melalui hibridisasi, sehingga dapat mendeteksi keberadaan gen tertentu.

Berikut langkah-langkah kerja hibridisasi DNA : 1. Isolasi DNA 2. Pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) DNA hasil isolasi dipotong dengan enzim restriksi tertentu yang dipilih dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA, sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya dielektroferesis pada sel agarosa. Hasil RFLP pada gel agarosa, fragmen-fragmen DNA tidak akan terlihat seperti pita-pita DNA terpisah, tetapi akan terlihat seperti pita-pita yang berkesinambungan bila diwarnai dengan etidium bromida. Oleh karena itu, bila hanya mengandalkan kemampuan etidium bromida saja, umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme, karena pita-pitanya tidak spesifik. Dengan demikian, perlu dilakukan hibridisasi dan visualisasi untuk mendeteksi fragmen tertentu dengan probe yang spesifik. Hibridisasi dan visualisasi dilakukan dengan Southern blotting. 3. Transfer DNA Prinsip proses transfer DNA adalah proses fisika sederhana dengan sistem kapiler. Fragmen-fragmen DNA hasil pemisahan pada gel elektroforesis kemudian 8

didenaturasi dengan larutan bufer denaturan. Biarkan pada kondisi suhu ruang. Siapkan wadah, penyangga, pembatas, batangan kaca, beberapa lembar membran filter seperti membran 3M dengan ukuran yang telah ditentukan, membran nilon, setumpuk kertas tisu yang mempunyai daya serap rendah, untuk memaksimalkan hasil transfer larutan bufer, dan larutan bufer transfer. 4. Eksperimen hibridisasi DNA adalah pita ganda yang hanya diikat oleh ikatan hidrogen antara basabasa nukleotidanya, sehingga di kondisi tertentu pita ganda DNA akan mudah menjadi pita tunggal. Oleh karena itu, ketika pita tunggal DNA dihibridisasi dengan pita tunggal, DNA probe akan langsung berikatan secara kuat secara komplemen pada kondisi yang optimal, atau hibridisasi dengan apapun molekul DNA yang komplemen dengan urutan basa pita tunggal DNA tersebut. Sebelum hibridisasi, dilakukan prehibridisasi dengan larutan denaturan. Membran didenaturasi di bufer denaturasi, sehingga memperoleh membran dengan pita tunggal DNA dan proses prehibridisasi. Lakukan inkubasi pada suhu 60oC semalaman, kemudian masukkan ke kantong plastik yang sesuai dengan ukuran membran dan berisi caian probe spesifik yang juga merupakan pita tunggal DNA. Plastik ditutup rapat, hindari adanya gelembung di dalamnya karena akan menghambat kerja probe. Bila ada gelembung, keluarkan hati-hati secara vakum. Untuk penggunaan probe radioaktif, gunakan wadah khusus untuk proses hibridisasi ini, letakkan membran din wadah tersebut dan masukkan larutan probe sesedikit mungkin. Inkubasi pada suhu 60oC sampai waktu yang telah ditetapkan. DNA probe akan menghibridisasi urutan basa nukleotida yang komplemen saja, sedangkan urutan basa lainnya tidak. Kemudian, cuci membran sampai bersih dari sisa larutan probe. Membran diekspos dengan sinar-X pada film khusus, kemudian film dicuci seperti mencuci film pada umumnya. Setelah film dicuci kemudian dikeringkan. Hasil bisa diidentifikasi di atas boks lampu. Mutasi akan menghasilkan sisi pengenalan enzim restriksi yang baru pada suatu sekuens DNA. Teknologi RPLF secara ideal akan menghasilkan suatu seri pita pada gel, yang dapat diberi penilaian berdasarkan ada atau tidaknya pita tertentu atau sebagai marker kodominan. Perbedaan antar genotipe biasanya divisualisasikan sebagai pola fragmen restriksi yang berbeda.

9

2.4 Hasil dari Hibridisasi DNA Hibridisasi DNA didasari berdasarkan pembentukan dupleks dua untai asam nukleat yang komplemen. Hibridisiasi akan memperoleh kombinasi genetic yang diperoleh melalui perilangan dua atau lebih yang berbeda genotipnya. Pembentukan molekul DNA hibrida yang mengandung untai DNA dari dua spesies yang berbeda . Jumlah urutan komlementer yang sama dalam dua untai merupakan indikasi dari tingkat keterkaitan spesies. 2.5 Perbedaan antara Hibridisasi DNA dengan Teknik Lainnya Dalam biologi molekular,hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalui perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNA – DNA, DNA– RNA, atau RNA – RNA dapat terbentuk melalui proses ini. Hibridisasi DNA – DNA (Hibridisasi Southern) terbentuk dalam Southern blotting sedangkan hibridisasi DNA – RNA (Hibridisasi Northern) terbentuk dalam Northern blotting 1. Hibridisasi Southern Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. Hibridisasi southern biasa digunakan untuk melacak adanya DNA yang sesuai dengan pelacak,misalnya untuk mengetahui integrasi transgen di dalam organisme transgenik. Berdasarkan prinsipnya, hibridisasi southern dapat dibagi kedalam 4 tahap, yaitu : (1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa ataunilon); (2) pelabelan pelacak; (3) prehibridisasi dan hibridisasi; dan (4)deteksi hasil hibridisasi. Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan melalui beberapa cara, yaitu (1) penetesan DNA (dot blot) langsung dimembran; (2) fiksasi DNA bakteri replika (plasmid rekombinan) dimembran; (3) fiksasi DNA fage rekombinan dari satu 10

replika plak dimembran; dan (4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnya telah dimigrasikan dengan elektroforesis) ke membran. Membran yang dipergunakan untuk memfiksasi DNA biasanya menggunakan membran nilon karena lebih kuat daripada membran nitroselulosa. Dot blot dan hibridisasi terhadap DNA replika hanya dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA tetapi tidak dapat mengetahui ukurannya.Sebaliknya, hibridisasi southern terhadap DNA yang difiksasi ke membran dengan

cara

transfer

melalui

metode

southern

(southern blotting) dapat diketahui ukuran DNA targetnya (Suharsono danWidyastuti, 2006). Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.Metode ini diambil dari nama penemunya yaitu

Edward

M.Southern. Prinsipnya

adalah kapilaritas, dimana

bufer

yang

merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran.

Karena

muatan

DNA

negatif

sedangkan

muatan

membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran.

Membran

yang digunakan

pada

proses

blot southern

adalah

membran nitroselulosa.

2. Hibridisasi Nothern Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali pada tahun 1977, dua tahun setelah teknik Southern Blot. Sebenarnya secara umum teknik ini mirip dengan Suothern Blot. Yang membedakan adalah sampel yang digunakan, yaitu RNA. Dan yang perlu diingat adalah pada umumnya RNA lebih mudah terdegradasi, sehingga sebisa mungkin tangan kita tidak bersentuhan langsung dengan sampel RNA. Maka dari itulah, saat bekerja Northern Blot diharuskan memakai kaos tangan, bahkan masker. Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi) suatu mRNA (gen) pada organ atau jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang, dan lainsebagainya. Hibridisasi northern merupakan modifikasi dari hibridisasi southern. Namun, target dari hibridisasi northern adalah RNA yang telah dipisahkan dengan elektroforesis gel agrosa menggunakan pelacak DNA berlabel. Hibridisasi northern dibentuk dalam Northern Blotting.

11

2.6 Aplikasi Hibridisasi DNA di Bidang Kesehatan Hibridisasi DNA sangat diperlukan dalam perkembangan teknologi DNA, khususnya didalam bidang kesehatan. Pengaplikasian yang paling sering dilakukan berbasis hibridisasi DNA adalah diagnosis penyakit, saintis kedokteran sekarang dapat mendiagnosis ratusan kelainan genetik manusia dengan menggunakan teknologi DNA. Mereka dapat mengidentifikasi semakin

banyak

individu

yang

mempunyai

penyakit

genetik

sebelum

munculnya gejala, atau bahkan sebelum lahir. Ada juga kemungkinan untu mengidentifikasi karrier (pembawa) alel resesif yang secara potensial berbahaya, namun tanpa gejala-gejala. Gen gen telah diklon untuk banyak penyakit manusia, termasuk hemolia, fenilketonuria, fibrosis sistik dan distrofi

otot

Duchenne.

Analisis

hibridisasi

memungkinkan

untuk

mendeteksi bentuk alel abnormal dari gen yang ada di dalam sampel DNA. Bahkan dalam kasus gen belum di klon sekalipun, keberadaan alel abnormal dapat di diagnosis dengan akurasi yang masuk akal jika penanda RELP yang berhubungan dekat telah ditemukan. Alel untuk penyakit Huntington dan sejumlah penyakit genetik lain sebelumnya dideteksi dengan cara tak langsung. Begitu gen dipetakan lebih tepat, gen itu dapat di klon untuk pengkajian dan untuk digunakan sebagai probe untuk menemukan DNA yang identik atau mirip seperti yang sekarang dilakukan untuk penyakit Huntington, fibrosis sistik, dan banyak penyakit lainnya. (reece, 2002)

Gambar.1 12

Diagram ini menggambarkan segmen DNA homolog dari keluarga yang sebagian anggotanya memiliki penyakit genetik. Dalam keluarga ini, versi penanda RFLP yang berbeda dikaitkan dengan alel yang berbeda, sehingga memungkinkan pengujian itu daoat diaplikasikan. Jika anggota keluarga ini telah mewarisi versi penanda RFLP dengan dua tempat restriksi (bukan satu), maka besar kemungkinannya bahwa individu itu juga telah mewarisi alel penyebab penyakit tersebut.

13

BAB III PENUTUP

14

DAFTAR PUSTAKA

reece, campbell ; mitchell. 2002. Biologi Jl. 1 Ed. 5 - Google Buku. https://books.google.co.id/books?id=dwjGlYV4t8gC&printsec=frontcover&dq=biologi+ jl+1&hl=id&sa=X&ved=0ahUKEwiowojR4uTgAhWIq48KHUJNCz8Q6AEIKTAA#v= onepage&q=gambar 20.10&f=false [Diakses pada March 3, 2019].

15