Percobaan Ii.docx

PERCOBAAN II KINETIKA REAKSI ENZIM α-AMILASE

I.

TUJUAN PERCOBAAN 1.1 Menentukan V0 substrat larutan pati pada konsentrasi 0,002%-0,01% 1.2 Menentukan parameter kinetika Michaelis-Menten (KM) dalam reaksi pemecahan larutan pati. 1.3 Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase pada konsentrasi substrat larutan pati 0,002%-0,01%

II.

DASAR TEORI Enzim adalah biomolekul berupa protein berbentuk bulat (globular), yang terdiri atas satu rantai polipeptida atau lebih dari satu rantai polipeptida (Wirahadikusumah, 1989). Enzim adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh sel. Semua reaksi metabolisme dikatalis oleh enzim. Enzim bekerja dengan menurunkan energi aktivitas untuk suatu reaksi, sehingga secara dramatis dapat meningkatkan laju reaksi. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan sel juga terganggu. . Dengan adanya enzim, molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk (Grisham et al., 1999). Cara kerja enzim adalah sebagai berikut:

III. Enzim Gambar 1 Cara Kerja

Konsentrasi enzim yang sangat tinggi dalam suatu sistem yang kompleks akan berpengaruh terhadap terhadap kecepatan reaksi. (Dwidjoseputro, 1992). Pada konsentrasi substrat yang rendah, kenaikan substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis hampir secara linier. Jika konsentrasi substrat tinggi, maka peningkatan kecepatan reaksi enzimatis akan semakin menurun sejalan dengan peningkatan jumlah substratnya. kecepatan maksimum (v maks) reaksi enzimatis ditunjukan dengan garis mendatar yang menggambarkan peningkatan kecepatan yang rendah seiring penambahan konsentrasi substrat. (Dwidjoseputro, 1992)

Gambar 2. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap fungsi enzim Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat memperoleh makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel, memperoleh energi kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan, pergerakan, dan lain-lain. (Poedjiadi, 2006). Dalam reaksi biokimia, suatu enzim dapat dikenali untuk mengkatalisasi sekitar 4000 reaksi (Bairoch, 2000). Mekanisme enzim dalam mengkatalisis reaksi dapat dituliskan menjadi persamaan berikut 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 ⇌ 𝐸 + 𝑃

(1)

dengan k1 merupakan konstanta laju pembentukan enzim dan substrat menjadi kompleks enzim-substrat; k2 merupakan konstanta laju pembentukan kompleks enzimsubstrat menjadi enzim dan produk dan

𝑉=

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝐾𝑀 +[𝑆]

(2)

dengan 𝑉 adalah laju awal reaksi , 𝑉𝑚𝑎𝑥 adalah laju maksimal reaksi, [𝑆] adalah konsentrasi substrat, dan 𝐾𝑀 konstanta Michaelis. Enzim α-amilase memiliki nama kimiawi, yaitu endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1 famili 13(GH13). Enzim α-amilase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu memotong ikatan 1,4-α-D-glikosidik antara monomer glukosa pada rantai linier amilosa. Enzim ini dikategorikan sebagai endoenzim karena pemotongan pati dilakukan secara acak dari dalam. Mekanisme kerja enzim α-amilase pada amilosa dibagi dalam dua tahap, pertama degradasi secara cepat molekul amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang terjadi secara acak. Tahap kedua, degradasi α-amilase pada amilosa menghasilkan glukosa dan 7 maltosa dengan laju lebih lambat dan tidak secara acak (Winarno, 1973).

Gambar 3 Mekanisme SN2: pemutusan ikatan α 1,4-glikosidik oleh enzim α-amilase Pengukuran aktivitas α-amilase dilakukan dengan dengan menggunakan larutan iodin melalui metode Fuwa. Aktivitas α-amilase dapat diukur berdasarkan penurunan kadar pati yang larut, kadar dekstrin yang terbentuk, dan pengukuran viskositas atau jumlah gula pereduksi yang terbentuk (Judoamidjojo dkk., 1989). Pada percobaan ini digunakan reagen lugol untuk mengecek kadar pati. Reagen Lugol merupakan larutan Kalium Iodida dengan Iodium dalam air. Kemampuan enzim dalam hidrolisis pati dapat diketahui dari jumlah pati tersisa dalam larutan. Spektofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum

dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Prinsip kerja alat ini berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Apabila radiasi atau cahaya putih dilewatkan melalui larutan berwarna, maka radiasi dengan panjang gelombang tertentu akan diserap (absorbsi) secara selektif dan radiasi lainnya akan diteruskan (transmisi). Absorbansi adalah perbandingan intensitas sinar yang diserap dengan intensitas sinar datang. Nilai absorbansi ini akan bergantung pada kadar zat yang terkandung di dalamnya, semakin banyak kadar zat yang terkandung dalam suatu sampel maka semakin banyak molekul yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu sehingga nilai absorbansi semakin besar atau dengan kata lain nilai absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi zat yang terkandung didalam suatu sampel.

III.

DATA PENGAMATAN Konsentrasi Substrat (%)

0.002

Waktu (s)

Absorbansicontrol

Absorbansisampel

10

0.134

0.184

20

0.133

0.183

30

0.132

0.182

40

0.131

0.18

50

0.129

0.18

60

0.129

0.179

70

0.129

0.178

80

0.129

0.177

90

0.128

0.176

100

0.128

0.176

110

0.128

0.175

120

0.127

0.175

130

0.127

0.174

0.004

140

0.127

0.173

150

0.127

0.173

160

0.127

0.172

170

0.127

0.172

180

0.127

0.172

240

0.127

0.169

300

0.126

0.167

360

0.127

0.167

420

0.126

0.168

480

0.126

0.168

540

0.126

0.167

600

0.127

0.167

10

0.17

0.227

20

0.168

0.223

30

0.166

0.219

40

0.164

0.217

50

0.164

0.214

60

0.162

0.211

70

0.161

0.209

80

0.161

0.206

90

0.16

0.204

100

0.16

0.202

110

0.159

0.2

120

0.158

0.198

130

0.158

0.196

140

0.158

0.195

150

0.158

0.194

160

0.158

0.192

170

0.158

0.191

180

0.157

0.19

0.006

240

0.157

0.182

300

0.156

0.173

360

0.156

0.166

420

0.156

0.158

480

0.156

0.149

540

0.155

0.138

600

0.157

0.125

10

0.306

0.35

20

0.296

0.337

30

0.286

0.327

40

0.279

0.322

50

0.274

0.31

60

0.27

0.304

70

0.268

0.297

80

0.265

0.291

90

0.262

0.286

100

0.261

0.28

110

0.26

0.273

120

0.257

0.268

130

0.255

0.264

140

0.254

0.259

150

0.253

0.253

160

0.252

0.247

170

0.25

0.24

180

0.249

0.235

240

0.245

0.225

300

0.242

0.182

360

0.24

0.152

420

0.237

0.148

480

0.237

0.147

0.008

0.01

540

0.236

0.148

600

0.234

0.148

10

0.411

0.4

20

0.399

0.384

30

0.393

0.37

40

0.387

0.357

50

0.384

0.346

60

0.381

0.337

70

0.378

0.326

80

0.377

0.318

90

0.375

0.311

100

0.374

0.301

110

0.373

0.295

120

0.372

0.285

130

0.372

0.275

140

0.371

0.269

150

0.37

0.261

160

0.37

0.253

170

0.369

0.244

180

0.368

0.234

240

0.364

0.174

300

0.362

0.111

360

0.361

0.069

420

0.359

0.063

480

0.359

0.062

540

0.358

0.062

600

0.358

0.062

10

0.454

0.471

20

0.442

0.455

30

0.435

0.441

40

0.43

0.429

50

0.426

0.42

60

0.423

0.411

70

0.419

0.4

80

0.419

0.393

90

0.418

0.386

100

0.415

0.377

110

0.413

0.37

120

0.413

0.362

130

0.412

0.354

140

0.412

0.347

150

0.411

0.338

160

0.41

0.33

170

0.409

0.32

180

0.408

0.311

240

0.406

0.252

300

0.403

0.194

360

0.402

0.156

420

0.401

0.148

480

0.401

0.147

540

0.401

0.146

600

0.402

0.146

Tabel 1. Data absorbansi pada λ 600nm pada masing masing kosentrasi substrat.

IV.

PENGOLAHAN DATA 4.1 Penentuan ΔAbsorbansi ΔAbsorbansi = 𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 Konsentrasi

Waktu

(%)

(s)

Akontrol

Asampel

ΔAbsorbansi

0,002

0,004

10

0,134

0,184

-0,05

20

0,133

0,183

-0,05

30

0,132

0,182

-0,05

40

0,131

0,18

-0,049

50

0,129

0,18

-0,051

60

0,129

0,179

-0,05

70

0,129

0,178

-0,049

80

0,129

0,177

-0,048

90

0,128

0,176

-0,048

100

0,128

0,176

-0,048

110

0,128

0,175

-0,047

120

0,127

0,175

-0,048

130

0,127

0,174

-0,047

140

0,127

0,173

-0,046

150

0,127

0,173

-0,046

160

0,127

0,172

-0,045

170

0,127

0,172

-0,045

180

0,127

0,172

-0,045

240

0,127

0,169

-0,042

300

0,126

0,167

-0,041

360

0,127

0,167

-0,04

420

0,126

0,168

-0,042

480

0,126

0,168

-0,042

540

0,126

0,167

-0,041

600

0,127

0,167

-0,04

10

0,17

0,227

-0,057

20

0,168

0,223

-0,055

30

0,166

0,219

-0,053

40

0,164

0,217

-0,053

50

0,164

0,214

-0,05

0,006

60

0,162

0,211

-0,049

70

0,161

0,209

-0,048

80

0,161

0,206

-0,045

90

0,16

0,204

-0,044

100

0,16

0,202

-0,042

110

0,159

0,2

-0,041

120

0,158

0,198

-0,04

130

0,158

0,196

-0,038

140

0,158

0,195

-0,037

150

0,158

0,194

-0,036

160

0,158

0,192

-0,034

170

0,158

0,191

-0,033

180

0,157

0,19

-0,033

240

0,157

0,182

-0,025

300

0,156

0,173

-0,017

360

0,156

0,166

-0,01

420

0,156

0,158

-0,002

480

0,156

0,149

0,007

540

0,155

0,138

0,017

600

0,157

0,125

0,032

10

0,306

0,35

-0,044

20

0,296

0,337

-0,041

30

0,286

0,327

-0,041

40

0,279

0,322

-0,043

50

0,274

0,31

-0,036

60

0,27

0,304

-0,034

70

0,268

0,297

-0,029

80

0,265

0,291

-0,026

90

0,262

0,286

-0,024

100

0,261

0,28

-0,019

0,008

110

0,26

0,273

-0,013

120

0,257

0,268

-0,011

130

0,255

0,264

-0,009

140

0,254

0,259

-0,005

150

0,253

0,253

0

160

0,252

0,247

0,005

170

0,25

0,24

0,01

180

0,249

0,235

0,014

240

0,245

0,225

0,02

300

0,242

0,182

0,06

360

0,24

0,152

0,088

420

0,237

0,148

0,089

480

0,237

0,147

0,09

540

0,236

0,148

0,088

600

0,234

0,148

0,086

10

0,411

0,4

0,011

20

0,399

0,384

0,015

30

0,393

0,37

0,023

40

0,387

0,357

0,03

50

0,384

0,346

0,036

60

0,381

0,337

0,044

70

0,378

0,326

0,052

80

0,377

0,318

0,059

90

0,375

0,311

0,064

100

0,374

0,301

0,073

110

0,373

0,295

0,078

120

0,372

0,285

0,087

130

0,372

0,275

0,097

140

0,371

0,269

0,102

150

0,37

0,261

0,109

0,01

160

0,37

0,253

0,177

170

0,369

0,244

0,125

180

0,368

0,234

0,134

240

0,364

0,174

0,19

300

0,362

0,111

0,251

360

0,361

0,069

0,292

420

0,359

0,063

0,296

480

0,359

0,062

0,297

540

0,358

0,062

0,296

600

0,358

0,062

0,296

10

0,454

0,471

-0,017

20

0,442

0,455

-0,013

30

0,435

0,441

-0,006

40

0,43

0,429

0,001

50

0,426

0,42

0,006

60

0,423

0,411

0,012

70

0,419

0,4

0,019

80

0,419

0,393

0,026

90

0,418

0,386

0,032

100

0,418

0,377

0,038

110

0,413

0,37

0,043

120

0,413

0,362

0,051

130

0,412

0,354

0,058

140

0,412

0,347

0,065

150

0,411

0,338

0,073

160

0,41

0,33

0,08

170

0,409

0,32

0,089

180

0,408

0,311

0,097

240

0,406

0,252

0,154

300

0,403

0,194

0,209

360

0,402

0,156

0,246

420

0,401

0,148

0,253

480

0,401

0,147

0,254

540

0,401

0,146

0,255

600

0,402

0,146

0,256

Tabel 2. Data absorbansi pada λ 600nm pada masing masing kosentrasi substrat. 4.2 Penentuan nilai epsilon (ε) ∆Amax

[S] (%) 0.002

-0.04

0.004

0.032

0.006

0.09

0.008 0.01

0.256

Tabel 3. Data ∆Amax untuk tiap konsentrasi substrat Nilai epsilon adalah nilai gradien dari kurva grafik ∆Amax terhadap konsentrasi. Data tersebut dapat di-plot sebuah grafik, maka didapatkan grafik sebagai berikut

∆Absorbansi maksimum 0.3 y = 36.829x - 0.1181 R² = 0.9952

∆Absorbansi maksimum

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 -0.1

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

Konsentrasi

Grafik 1 Grafik ∆Amax terhadap konsentrasi

0.012

Dari grafik diatas, didapatkan nilai gradien garis sebesar 36,829. Artinya nilai epsilon (ε) sama dengan 36,829.

4.3 Penentuan laju awal (V0) Untuk menentukan laju awal, dibuatlah semua kurva yang memplotkan ∆A terhadap masing-masing konsentrasi. Dari data pada tabel 4.1 didapatkan kurva grafik sebagai berikut 0.15 y = 0.0007x + 0.0011 R² = 0.9987

0.1

y = 0.0007x - 0.0269 R² = 0.9971

∆A

0.05 0 0

20

40

60

80

100

y = 0.0004x - 0.0527 R² = 0.9805 y = 0.0001x - 0.0577 120 140 160 R² =180 0.9917200

-0.05 y = 3E-05x - 0.0511 R² = 0.8918

-0.1

Waktu (s) 0,002%

0.004%

0.006%

0.008%

0.01%

Grafik 2 Grafik ∆A terhadap masing-masing konsentrasi substrat

Untuk mendapatkan nilai V0 digunakan persamaan berikut V0 =

𝑚 𝜀𝑏

=

𝑑𝐴 𝑑𝑡

𝜀𝑏

dengan, b = 1 cm kuvet. Dari perhitungan dengan persamaan di atas, didapatkan hasil sebagai berikut V0 =

0.00003 36,289

= 8,14575 x 10-7

Dengan menggunakan perhitungan yang sama untuk tiap konsentrasi, didapatkan data di tabel di bawah ini

[S] (%)

dA/dt

V0 (%/s)

0.002

0.00003

8.14575 x 10-7

0.004

0.0001

2.71525 x 10-6

0.006

0.0004

1.0861 x 10-5

0.008

0.0007

1.90068 x 10-5

0.01

0.0007

1.90068 x 10-5

Tabel 4 Data hasil perhitungan V0 untuk tiap konsentrasi substrat

4.4 Penentuan Parameter Kinetika Untuk menentukan parameter kinetika berdasarkan grafik LimeweaverBurk, perlu dicari terlebih dahulu nilai 1/[S] dari tiap konsentrasi dan nilai 1/V0 dari tiap laju awal. Dengan berdasarkan pada data tabel 4.3, didapatkan data sebagai berikut 1/[S]

1/V0

500

1227633.333

250

368290

166.6666667

92072.5

125

52612.85714

100

52612.85714

Tabel 5 Data nilai 1/[S] dari tiap konsentrasi dan nilai 1/V0 dari tiap laju awal Dari data pada tabel 4.4 dapat digambarkan grafik sebagai berikut

Grafik Lineweaver-Burk 1400000 y = 3075.6x - 343615 R² = 0.982

1200000 1000000

1/v0

800000 600000 400000 200000

0 -200000 0

100

200

300

400

1/[S]

Grafik 3 Grafik Lineweaver-Burk

500

600

Persamaan pada grafik Lineweaver-Burk adalah 1 𝐾𝑚 1 1 = . + 𝑉0 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

(3)

Dari persamaan tersebut dan persamaan pada grafik 4.3, diketahui bahwa 1 𝑉𝑚𝑎𝑥

= −343615

Maka 𝑉𝑚𝑎𝑥 = −2,9 𝑥 10−6 %/𝑠 |𝑉𝑚𝑎𝑥 | = 2,9 𝑥 10−6 %/𝑠 Diketahui pula bahwa 𝐾𝑚 = 3075,6 𝑉𝑚𝑎𝑥 Dengan menggunakan nilai Vmax yang telah diketahui, maka didapatkan 𝐾𝑚 = 3075,6 𝑥 2,9 𝑥 10−6 = 8,9 𝑥 10−3 4.5 Penentuan Aktivitas

4.5.1 Unit aktivitas Untuk menentukan unit aktivitas, digunakan persamaan 𝑈𝑛𝑖𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 =

𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑒𝑛𝑥𝑖𝑚

Diketahui Venzim = 120µL, maka didapatkan 𝑈𝑛𝑖𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 =

2,9 𝑥 10−6 = 2,416 𝑈 120𝜇

4.5.2 Aktivitas total Untuk menentukan aktivitas total, digunakan persamaan 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑈𝑛𝑖𝑡 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 Diketahui volume total larutan enzim, subtrat, KI, dan HCl/Buffer adalah 1mL, maka didapatkan 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 0,02416 𝑥 1 𝑥 10−3 = 2,416 𝑈 𝑚𝐿 4.5.3 Aktivitas Spesifik Untuk menentukan aktivitas spesifik enzim, digunakan persamaan

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑠𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 =

𝑈𝑛𝑖𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑚𝑔 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚

Diketahui konsentrasi enzim = 27,95 mg/L dan volume enzim = 120 µL, maka didapatkanlah 𝑚𝑔 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 = 27,95 𝑥 120 𝑥 10−6 = 3,354 𝑥 10−3 𝑚𝑔 Dari hasil tersebut bisa didapatkan 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑠𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 =

V.

2,416 𝑈 = 720,33 𝑈/𝑚𝑔 3,354 𝑥 10−3 𝑚𝑔

PEMBAHASAN 5.1 Metode Fuwa Pada percobaan kali ini, untuk mengukur aktivitas enzim α-amilase dilakukan dengan menggunakan Metode Fuwa dengan menggunakan larutan iodin secara stop essay. Percobaan dilakukan dengan substrat pati dengan berbagai konsentrasi yang kemudian dibagi menjadi larutan kontrol dan larutan sampel. Dimana larutan kontrol diberi Buffer Fosfat dan larutan sampel diberi reagen HCl. Lalu absorbansi diukur dengan spektofotometer UV-Vis pada panjang gelombang antara 550-700nm. Pati bereaksi secara kimiawi dengan larutan Iodin, reaksi ini terlihat sebagai warna birukehitaman. Larutan iodin pada dasarnya berwarna kuning kecoklatan. Akan tetapi, larutan iodin dapat membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan pati. Perubahan warna yang terjadi merupakan reaksi pertama yang terjadi. Warna biru-kehitaman terjadi bila molekul iodium masuk ke dalam bagian yang kosong pada molekul zat pati (amilosa) yang berbentuk spiral. Setelah itu terjadi reaksi pengikatan pati oleh active site dari enzim α-amilase , yang kemudian menghidrolisis ikatan α-1,4 glikosidik dari pati. Bila zat pati ini telah dihidrolisus dan diuraikan menjadi maltosa atau glukosa, warna biru tidak terjadi karena tidak adanya bentuk spiral. Oleh sebab itu, absorbansi warna biru yang terukur oleh spektrofotometer di akhir reaksi menunjukkan jumlah pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim. Hal ini berpengaruh terhadap absorbansi yang semakin menurun terhadap waktu karena warna yang semakin pudar. Penambahan

buffer pada percobaan ini bertujuan untuk mempertahankan keasaman larutan pada pH optimal enzim sehingga kerja enzim dapat maksimal. Sedangkan penambahan HCl pada larutan kontrol membuat efektivitas enzim terganggu karena pH enzim menurun drastis menjadi asam, sehingga enzim dapat terdenaturasi. Karena itu, absorbansi yang diperoleh juga semakin menurun terhadap waktu dikarenakan beberapa enzim masih dapat bekerja sampai pada saat semua enzim terdenaturasi yang mengakibatkan absorbansi akan menjadi spontan. (Howard, 2015). Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 600nm karena senyawa kompleks Iodine-Amilosa memiliki absorpsi maksimum pada panjang gelombang 600 nm. Keuntungan metode Fuwa yaitu lebih spesifik untuk mengidentifikasi aktivitas enzimdengan waktu reaksi yang singkat selama 10 menit inkubasi dan pati digunakan sebagai substratnya. Semakin kecil absorbansi sampel maka semakin baik aktivitas dari enzim tersebut (Fuwa, 1954). Keunggulan spektrofotometer UV-Vis untuk pengukuran aktivitas α-amilase adalah(1) dapat dilakukan pengujian secara langsung tanpa penambahan reagen apapun, (2) berlangsung cepat, tanpa proses inkubasi, (3) hubungan konsentrasi protein dengan absorban adalah linier.

5.2 Perbandingan Perolehan Data Hasil Percobaan dengan Literatur Dari percobaan yang dilakukan dengan metode Fuwa dan rumus MichaelisMenten dan Lineweaver-Burk. Pertama-tama, larutan pati diencerkan dengan metode Serial Dilution hingga didapat larutan pati dengan konsentrasi 0,002%; 0,004%; 0,006%; 0,008% dan 0,01%. Masing-masing konsentrasi diberi 2 perlakuan yaitu kontrol dan sampel. Pada larutan control diberikan HCl, enzim α-Amilase dan reagen lugol. Larutan kontrol dibuat dengan menambahkan pati sebanyak 750µL, HCl 1M sebanyak 100µL, 30µL lugol (I2/KI), dan 120µL enzim secara berurutan. Pada larutan kontrol diberi 750µL pati, 100µL larutan buffer, 30µL reagen lugol (I2/KI), dan 120µL enzim secara berurutan. . Reagen lugol disini bekerja dengan pati membentuk I3- yang berwarna biru-kehitaman dan tersangkut dalam coli pati.

Penambahan HCl pada larutan kontrol dapat menyebabkan turunnya pH secara drastis sehingga larutan menjadi bersifat asam. Hal ini akan mendenaturasi enzim sehingga kinerja enzim menjadi terganggu dan proses hidrolisis pati menjadi terganggu. Secara literatur seharusnya nilai absorbansi larutan kontrol akan berhenti pada titik tertentu yang menandakan kerja enzim α-Amilase sudah berhenti menghidrolisis pati. Namun pada hasil percobaan, nilai absorbansi pada larutan kontrol masih terus menerus menurun, artinya enzim α-Amilase belum berhenti bekerja. Pada larutan sampel, penambahan buffer mengakibatkan pH dari larutan terkontrol tepat pada titik itu. Hal ini mengakibatkan jumlah pati menurun karena enzim α-Amilase melakukan kerjanya yaitu menghidrolisis pati sehingga kemampuan I3- untuk membentuk kompleks dengan pati menjadi berkurang. I3- didapat dari reagen lugol. Nilai absorbansi terus menurun pada kedua larutan sampel menandakan bahwa enzim bekerja dalam menghidrolisis pati sehingga warna bitu-kehitaman yang terbentuk dari senyawa I3- semakin lama semakin pudar. Secara teori, seharusnya nilai absorbansi dari larutan kontrol lebih besar dari larutan sampel. Pada kondisi kontrol, penambahan HCl mengakibatkan fungsi enzim terganggu sehinga reaksi enzim akan terhambat, akibatnya warna biru tetap bertahan. Namun dari hasil percobaan di tabel 2, beberapa absorbansi larutan sampel lebih besar dari larutan kontrol. Hal ini bisa terjadi karena beberapa hal, seperti larutan yang kontam atau pH yang tidak pas.

5.3 Nilai Parameter Kinetika Michaelis-Menten (KM) Parameter Kinetika Michaelis-Menten(KM) merupakan konstanta yang berbanding lurus dengan kecepatan laju reaksi dari enzim. Nilai KM menunjukkan jumlah substrat yang diperlukan untuk mencapai nilai kelajuan reaksi tertentu. Vmax adalah laju maksimum dari suatu reaksi enzimatis untuk reakssi membentuk produk ataupun substat. Vmax pada reaksi ditentukan oleh konsentrasi kompleks enzim substrat. Pada saat seluruh enzim sudah terikat dengan substrat, maka Vmax tercapai, sehingga laju reaksi akan menjadi konstan.

Dari percobaan yang telah dilakukan, didapatkan data Vmax dan KM sebesar 2,9 𝑥 10−6 %/𝑠 dan 8,9 𝑥 10−3 M. Secara literatur, aktivitas enzim α-amilase didapat nilai Vmax sebesar 21853.0µmol/min/mg dan nilai KM sebesar 2.4 mg/mL (Khanra, Choudhuri, Panja, & Bhattacharyya, 2016). Hasil percobaan dan literatur memiliki perbedaan nilai yang cukup jauh. Hal ini bisa disebabkan oleh beberapa hal, seperti perbedaan larutan konsentrasi pati dan kondisi pH yang diuji, karena pada literatur, konsentrasi larutan pati yang digunakan adalah rentang 0,5mg/mL – 8 mg/mL pada suhu 37oC dan pH 7. Selain itu bisa juga terjadi karena adanya kontaminasi pada larutan. Perbedaan nilai juga bisa terjadi karena reagen lugol yang mungkin tidak lagi pada kondisi idealnya karena reagen terlalu banyak terpapar sinar.

5.4 Aktivitas Enzim 5.4.1 Definisi Aktivitas Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kerja enzim untuk menghasilkan produk sebanyak 1 mmol (mikromol) per menit. Dengan persetujuan internasional, 1,0 unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pengubahan 1,0 mikromol substrat per menit pada 250C pada keadaan pengukuran optimal. Kerja enzim / aktivitas enzim dinyatakan sebagai Unit (U)/mL. Aktivitas spesifik adalah besarnya aktivitas enzim per jumlah protein yang terkandung dalam campuran enzim yang diuji. Aktivitas spesifik merupakan suatu ukuran kemurnian enzim, nilainya meningkat selama pemurnian suatu enzim dan menjadi maksimum dan tetap (konstan) jika enzim sudah berada pada keadaan murni. Enzim dengan aktivitas spesifi k yang tinggi menunjukkan tingkat kemurnian enzim tersebut tinggi. Aktivitas Total adalah aktivitas total adalah seluruh unit enzim yang bisa diekstrasi dari sampel. Aktivitas total merupakan aktivitas enzim dikalikan dengan volume total enzim (U/mL x mL)= U . Menurut Lehninger (1982: 240-252) faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim selain konsentrasi enzim, adalah suhu, pH substrat, konsentrasi substrat, inhibitor, dan aktivator.

5.4.2 Data hasil percobaan aktivitas enzim Enzim α-amilase dari hasil percobaan memiliki unit aktivitas sebesar 2,416 U (μmol/menit) artinya terjadi proses katalisis 2,416 μmol substrat dalam satu menit. Aktivitas spesifik dari percobaan ini adalah sebesar , artinya 1 mg enzim α-amilase yang digunakaan dalam percobaan ini dapat mengkatalisis 720,333 μmol substrat dalam satu menit. Aktivitas total dari enzim adalah 2,416 , artinya enzim memiliki kemampuan dalam mengkatalisis 2,416 μmol substrat dalam satu menit.

VI.

KESIMPULAN Dari hasil percobaan, dapat disimpulkan bahwa: 1. V0 enzim α-amilase sebesar 1,55 x 10-5 untuk konsentrasi substrat 0,01%; 1,69 x 10-5 untuk konsentrasi substrat 0,008%; 8,21 x 10-6 untuk konsentrasi substrat 0,006%, 3,42 x 10-6 untuk konsentrasi substrat 0,004%; dan 8 x 10-7 untuk konsentrasi substrat 0,002%. 2. Enzim α-amilase memiliki nilai Vmax dan KM sebesar 2,9 𝑥 10−6 %/𝑠 dan 8,9 𝑥 10−3 M. 3. Aktivitas spesifik enzim α-amilase adalah 720,33 𝑈/𝑚𝑔.

VII.

DAFTAR PUSTAKA Bairoch, A. (2000). The Enzyme Database in 2000. Nucleic Acid Res 28 (1): 304-5. Clark, J.M. and Switzer, R.L. (1976). Experimental Biochemistry, 2nd Ed. Wh. Freeman and Company, San Fransisco, USA. Dwijoseputro.(1992).Pengantar Fisiologi Tumbuhan.Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Fuwa, H. (1954). A New Method for Microdetermination of Amylase Activity by the Use of Amylose as the Substrate. The Journal of Biochemistry, 41(5), 583-603. Grisham, Charles M.; and Reginald H. Garrett. (1999). Biochemistry. Saunders College Pub. Philadelphia.

Howard, W. (2015). Konversi Enzimatik Pengujian Aktivitas Enzim alpha-amilase. Bandung:ITB. Judoamidjojo, M., A.A. Darwia, dan E.G. Sa’id. (1992). Teknologi Fermentasi. Edisi 1. Rajawali Press, Jakarta. Khanra, K., Choudhuri, I., Panja, S., & Bhattacharyya, N. (2016). Partial purification and biochemical characterization of amylase from Aeromonas caviaeNK1isolated from Industrial waste of India. Journal of Biology and Life Science, 7(1). doi:ISSN 2157-6076. Poedjiadi, Anna. dan F.M. Titin Supriyanti.(2006).Dasar-Dasar Biokimia.Jakarta: UI Press. Soeharsono. (2006). Biokimia 1. Yogyakarta: UGM Press. Tatsuo, K. (2014). Iodine Chemistry and Application. New York: Wiley & Sons. Winarno.(1973). Pangan, Gizi, Teknologi dan Konsumen. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Wirahadikusumah, M. (1989). Biokimia (Protein, Enzim, Asam Nukleat). ITB. Bandung.