Pengujian Sifat Biokimia.docx

PENGUJIAN SIFAT BIOKIMIA Mas’arisaldy Khairul Barkatullah1, Gusti Nor Aida Fasha1, Witiyasti Imaningsih2 1. Program studi S1 Biologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral Ahmad Yani Km 36, Banjarbaru, 70713, lndonesia 2. Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral Ahmad Yani Km 35,8 Banjarbaru, 70713, lndonesia Email: [email protected] Abstrak

Sifat biokimia suatu mikroba membantu mempercepat proses identifikasi dan klasifikasi mikroba tersebut. Pada percobaan ini digunakan uji katalase, uji produksi hidrogen sulfida, uji indol, dan tes hidrolisis gelatin. Hasil uji katalase beragam, hasil uji produksi hidrogen sulfida adalah semuanya negatif, hasil uji indol adalah semuanya negatif, hasil tes hidrolisis gelatin adalah E. coli positif, S. aureus negatif. Setiap perlakuan memiliki hasil yang berbeda-beda pada mikroorganisme tergantung pada mampu atau tidaknya bakteri tersebut memecah bahan yang menjadi perlakuannya. Keywords: Biokimia, Mikroba, Identifikasi

1. PENDAHULUAN Sifat biokimia suatu mikroba membantu mempercepat proses identifikasi dan klasifikasi mikroba tersebut. Uji atau tes yang lazim dilakukan pada mikroba antara lain adalah catalase test, citrate test, uji koagulasi, uji DNase, hippurate test, uji produksi hidrogen sulfida, uji indol, lecitihinase test, fermentasi asam campur, tes oksidasi, tes potassium hidroksida, urease test, tes hidrolisis gelatin, dan Voges-Proskauer (VP) test. Uji mikroba dilakukan pada mikroba terutama untuk mendapatkan spesifikasi reaksi mikroba tersebut terhadap materi kimiawi pada lingkungannya [1]. Bakteri aerobik dan bakteri anaerobik fakultatif memproduksi enzim katalase. Fungsi enzim katalase adalah untuk melakukan detoksifikasi pada hidrogen peroksida (H2O2). Bakteri anaerobik aerotoleran memiliki enzim peroksidase, bukan enzim katalase. Bakteri anaerobik obligat tidak memiliki dismutase superoksida dan katalase. Uji untuk mengetahui kandungan enzim katalase dalam bakteri disebut catalase test, biasanya uji ini digunakan untuk membedakan antara Staphylococcus sp. dan Micrococcus sp. yang positif mengandung enzim katalase dengan Streptococcus sp. dan Enterococcus sp. yang negatif mengandung enzim katalase [2]. Beberapa bakteria dapat melakukan metabolisme yang menghasilkan senyawa mengandung sulfur ketika diberikan hidrogen sulfida (H2S). Hidrogen sulfida toksik, mudah terbakar, dan aromanya menyengat. Jika besi yang dapat

larut atau garam timbal (e.g. ferric citrate) digunakan dalam medium berisi H2S yang juga mengandung sodium thiosulfat (Na2S2O3) maka akan terjadi reaksi dengan H2S. Uji ini disebut dengan uji produksi hidrogen sulfida yang biasanya digunakan untuk diferensiasi Campylobacter sp. [3]. Bakteri yang mengandung enzim triptofanase dapat menghidrolisis asam amino tryptophan menjadi indol, asam piruvat, dan amonia. Keberadaan indol dapat ditunjukkan menggunakan reagen Kovác atau spot-indole test. Pada spotindole test, indol direaksikan dengan p-Dimethylaminocinnamaldehyde membentuk kompleks merah. Uji indol mengkonfirmasi keberadaan strain Eschericia coli atau Brachyspira sp. dengan kombinasi tes lain. Reagen Kovác lebih sensitif dibanding spot-indole test namun tidak efektif digunakan untuk bekteri anaerobik [4]. Uji hidrolisis gelatin digunakan untuk mendeteksi kemampuan organisme membentuk gelatinase, sebuah enzim yang mampu me-liquify gelatin. Hidrolisis gelatin mengindikasikan keberadaan gelatinase. Guna uji hidrolisis gelatin membantu dalam identifikasi dan diferensiasi spesies Bacillus, Clostridium, Proteus, Pseudomonas, dan Serratia [5]. 2. METODE PENELITIAN Uji Katalase. Gelas objek dibersihkan dan masing-masing biakan diambil dengan lup inokulasi. Larutan H2O2 3% diteteskan tepat di atas bakteri tersebut. Adanya gelembung-gelembung O2 yang terbentuk dari hasil masing-masing biakan bakteri tersebut diamati pada gelas objek. Produksi Indol. Medium Tryptone Broth diinokulasikan dengan masing-masing biakan murni. Sampel kemudian diinkubasikan pada suhu 35-37ºC selama 24 jam. Tabung yang berisi medium tanpa diinokulsikan digunakan sebagai kontrol. Sebanyak 0,5 ml reagen Erlich ditambahkan ke dalam setiap tabung. Perubahan yang terjadi dalam tabung diamati, jika terbentuk cincing berwarna mera keunguan maka ada senyawa indol yang terbentuk. Produksi H2S. Semua biakan diinokulasikan ke dalam medium TSIA miring dengan tusuk tegak dan diakhiri dengan cara gores sejajar diatas media. Sampel kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 30-35ºC. Terbentuknya H2S diamati dengan ditunjukkan oleh adanya warna hitam di sepanjang tusukan. Perubahan warna pada medium tersebut diamati yang diakibatkan fermentasi gula-gula dan adanya pembentukan gas. Hidrolisis Gelatin. Tabung-tabung yang berisi nutrient gelatin disiapkan. Masing-masing medium diinokulasikan dengan masing-masing biakan. Tabungtabung nutrient gelatin tanpa biakan digunakan sebagai kontrol. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1-7 hari atau sampai reaksi positif muncul. Adanya hidrolisis di uji setelah 2 hari dan seterusnya dengan cara membenamkan tabung yang berisi biakan ke dalam es yang sedang mencair atau potongan es. Kontrol dan gelatin diamati, yang tidak terhidrolisis akan tetap cair.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN Tabel 1. Hasil Uji Katalase NO

Gambar

Nama Biakan

Hasil Pengujian

Escherichia coli

(+)

Staphylococcus aureus

(+)

1

2

3

Enterobacter aerogenes

(-)

4.

Bacillus subtilis (+)

5.

Proteus vulgaris

(-)

Uji katalase atau catalase test mendeteksi bahwa ada enzim katalase pada bakteria yang diuji pada saat di tambahkan H2O2. Reaksi tersebut membentuk 2 molekul air dan melepaskan O2 sehingga terbentuk gelembung udara. Reaksi dari uji katalase adalah sebagai berikut: Catalase

2 H2 O2 →

2H2 O + O2

Uji katalase pada Eschericia coli menunjukkan adanya gelembung yang sesuai dengan definisi hasil positif uji katalase. Menurut literatur terdapat E. coli yang merupakan bakteri catalase-positive yakni E. coli dengan strain INIA P114. Maka dapat diduga bahwa E. coli yang diamati pada percobaan ini adalah E. coli strain INIA P114 [6]. Uji katalase pada Staphylococcus aureus menunjukkan adanya gelembung yang sesuai dengan definisi hasil positif uji katalase. Menurut literatur S. aureus adalah bakteri yang mengandung enzim katalase sehingga dapat menekan pertumbuhan free radicals. Hasil percobaan sesuai dengan literatur, menunjukkan bahwa S. aureus memiliki enzim katalase [7]. Uji katalase pada spesies Enterobacter aerogenes atau yang sekarang lazim dikenal sebagai Klebsiella aerogenes menunjukkan absennya gelembung sehingga diduga K. aerogenes tidak mengandung enzim katalase. Menurut literatur, strain A3CK, A7CK, dan A27CK dari genus Enterobacter mengandung enzim katalase, analisis terhadap K. aerogenes juga menunjukkan adanya enzim katalase berupa urease. Hasil percobaan tidak sesuai dengan literatur, diduga strain biakan yang digunakan berbeda atau terjadi kesalahan dalam prosedur pengamatan [8, 9, 10]. Uji katalase pada Bacillus subtilis menunjukkan adanya gelembung, pertanda adanya enzim katalase. Menurut literatur, seluruh Bacillus menunjukkan hasil positif pada tes katalase. Hasil percobaan sesuai dengan literatur, menunjukkan bahwa B. subtilis memiliki enzim katalase [11]. Uji katalase pada spesies Proteus vulgaris menunjukkan tidak ada gelembung, pertanda negative-catalase. Menurut literatur, P. vulgaris menunjukkan hasil positif pada tes katalase. Hasil percobaan yang negatif tidak sesuai literatur, diduga karena kesalahan dalam prosedur pengamatan [12]. Tabel 2. Uji Produksi Indol NO

Gambar

Nama Biakan

Hasil Pengujian

Kontrol

(-)

1

2

3

Enterobacter aerogenes 1 dan 2

(-)

E. coli 1 dan 2

(-)

Ket : (+) terbentuk cincin (-) tidak terbentuk cincin Produksi indol atau indole test yang digunakan pada percobaan ini secara spesifiknya adalah spot-indole test (SIT) karena menggunakan reagen Ehrlich (pdimethylaminobenzaldehyde). Hasil positif SIT adalah terbentuknya cincin ungu. Cincin tersebut dibuat oleh reaksi deaminasi reduktif tryptophan melalui molekul intermediat asam indolpiruvat, dapat digambarkan sebagai berikut:

Hasil yang ditampilkan oleh Enterobacter aerogenes atau Klebsiella aerogenes dan Eschericia coli menunjukkan hasil negatif, namun menurut literatur E. coli adalah bakteri indol-positif [13, 14]. Tabel 3. Hasil Pengamatan Produksi H2S No

Gambar

Nama Biakan

1 Kontrol

Hasil Pengujiaan (3 X 24 Jam)

(-)

B. subtilis 1 dan 2

2

P. vulgaris 1 dan 2

3

(-)

(-)

Ket : (+) terbentuk H2S (-) tidak terbentuk H2S Tes hidrogen sulfida menentukan adanya senyawa yang mengandung sulfur dalam bakteri yang akan direduksi menjadi sulfida dalam proses metabolisme. Tes ini menggunakan medium yang berisi senyawa besi (iron compound). Hasil positif ditunjukkan adanya warna hitam yang berakibat dari produksi sulfida dan penggabungannya dengan senyawa besi membentuk FeS sesuai reaksi: Fe+S=FeS Hasil percobaan menunjukkan bahwa baik B. subtilis dan P. vulgaris tidak membentuk sulfida sehingga tidak menunjukkan warna hitam. Hasil ini tidak sesuai literatur yang menunjukkan bahwa genus Bacillus memproduksi H2S. Ketidaksesuaian ini diduga disebabkan oleh kesalahan pada proses inkubasi atau inokulasi [15]. Tabel 4. Hasil Pengamatan Hidrolisis Gelatin NO

Gambar

Nama Biakan

Hasil Pengujian

Kontrol

(-)

1

E. coli 1 dan 2

2

S. aureus 1 dan 2

3

(+)

(-)

Ket : (+) gelatin terhidrolisis (-) tidak terhidrolisis Kemampuan bakteri untuk memproduksi gelatinase diuji pada uji gelatin. Proses hidrolisisnya sendiri melalui dua reaksi sekuential yakni degradasi gelatin menjadi polipeptida dan konversi polipeptida menjadi asam amino. Hasil positif adalah liquification parsial maupun total pada tabung yang telah memadat [16]. Hasil percobaan adalah E. coli menunjukkan hidrolisis gelatin (terjadinya liquification) sementara S. aureus menunjukkan tidak adanya hidrolisis gelatin. Hal ini bertolak belakang dengan literatur yang menyatakan bahwa E. coli adalah bakteri yang tidak akan melakukan liquification dan S. aureus adalah bakteri dengan enzim gelatinase. Hasil yang tidak sesuai ini diduga karena inkubasi yang kurang sempurna [17]. 4. KESIMPULAN Pengujian sifat biokimia merupakan rangkaian pengujian yang menentukan sifat fisik atau kimiawi mikrobia terhadap komponen kimia di sekitarnya. Setiap perlakuan memiliki hasil yang berbeda-beda pada mikroorganisme tergantung pada mampu atau tidaknya bakteri tersebut memecah bahan yang menjadi perlakuannya dan dari hal tersebut terlihat bahwa bakteri memiliki fungsi tertentu dalam reaksi berupa penguraian atau pemecahan bahan kimia yang mana hal tersebut mengakibatkan bakteri memiliki pembagian kelompok sesuai dengan kemampuan dalam reaksinya terhadap bahan biokimia. DAFTAR PUSTAKA [1]

Fasman, G. D. 2018. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. CRC, London.

[2]

Tymoczko, J. L. 2013. Biochemistry: A Short Course. Macmillan Education, New York.

[3]

Amyes, S. G. B. 2013. Bacteria: a Very Short Introduction. Oxford University Press, Oxford.

[4]

Vergunst, A. C. 2014. Host-Bacteria Interactions: Methods and Protocols 1st Edition. Humana Press, New York

[5]

Rae, P., M. Crane, R. Pattenden. 2017. Clinical Biochemistry. John Wiley & Sons, New Jersey.

[6]

Rodríguez, E., Á. Peirotén, J.M. Landete, M. Medina, & J.L. Arqués. 2015. Gut catalase-positive bacteria cross-protect adjacent bifidobacteria from oxidative stress. Microbes and environments 30(3): 270-272.

[7]

Wang, Y., A.B. Hougaard, W. Paulander, L.H. Skibsted, H. Ingmer & M.L. Andersen. 2015. Catalase expression is modulated by vancomycin and ciprofloxacin and influences free radical formation in bacterial cultures of Staphylococcus aureus. Applied and environmental microbiology 81(18): 6393–6398.

[8]

Ghosh, P. K., S. K. Sen, & T. K. Maiti. 2015. Production and metabolism of IAA by Enterobacter spp.(Gammaproteobacteria) isolated from root nodules of a legume Abrus precatorius L. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 4(3): 296-303.

[9]

Menegassi, A., R. D. S. e Silva, C. R. Carlini, A. Mithöfer, & A. B. BeckerRitt. 2018. Analysis of Herbivore Stress-and PhytohormoneMediated Urease Expression in Soybean (Glycine max). Journal of Plant Growth Regulation, 37(2): 419-425.

[10] Tindall, B. J.; Sutton, G.; Garrity, G. M. (2017). "Enterobacter aerogenes Hormaeche and Edwards 1960 (Approved Lists 1980) and Klebsiella mobilis Bascomb et al. 1971 (Approved Lists 1980) share the same nomenclatural type (ATCC 13048) on the Approved Lists and are homotypic synonyms, with consequences for the name Klebsiella mobilis Bascomb et al. 1971 (Approved Lists 1980)". International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 67(2): 502–504. [11] Sopheap, E., Y. Inatsu, H. Thavrak, & B. Borarin. 2016. Isolation, Characterization and Bio-control Activities of Bacillus subtilis from in Fermented Soybean in Cambodia. In Proceedings of the AFSA Conference 2016 on Food Safety and Food Security, Bhubaneswar, India, 15-17 September, 2016: 6-15. Asian Food Safety and Security Association (AFSA). [12] Chauhan, A., Sadaf, D., Koul, S., Mir, K., Sharma, N., & Singh, R. (2015). Drug’s resistant activity of Proteus vulgaris isolated from gut of Mystus seenghala of northern Punjab region. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7(12), 284-288. [13] Lamb, A. C., R. A. Federico-Perez, & Z. L. Xue. 2015. Product in indole detection by Ehrlich’s reagent. Analytical biochemistry 484: 21-23. [14] Nursyam, H., A. A. Prihanto, N. I. Warasari, M. Saadah, R. E. Masrifa, N. A. Nabila, & I. J. Siddiq. 2018. The isolation and identification of endophytic bacteria from mangrove (Sonneratia alba) that produces

gelatinase. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science 137(1): 1–4 [15] Ali, A. E., M. J. Msarah, & A. M. Sahilah. 2017. Environment contaminant of Bacillus cereus isolated from ready to eat meat curry collected at various locations in Malaysia. International Food Research Journal, 24(6): 2640-2644. [16] Kaira, S. S., & C. Pai. 2017. Study of uropathogenic Escherichia coli with special reference to its virulence factors. International Journal Of Community Medicine And Public Health, 5(1): 177-181. [17] Moore, G., G. Knight, A. Blann. 2016. Haematology. Oxford University Press, Oxford.