Pembuatan_media_pertumbuhan_mikroba_dan.pdf

PEMBUATAN MEDIAN PERTUMBUHAN MIKROBA DAN PEMINDAHAN SECARA ASEPTIK

LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOKIMIA

Oleh : DARA PRATAMA NIM. 1310411068

JURUSAN S1 KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ANDALAS PADANG 2017

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kita tahu bahwa semua makhluk hidup membutuhkan nutrient untuk pertumbuhan dan reproduksinya. Nutrien merupakan bahan baku yang digunakan untuk membangun komponen-komponen seluler baru dan untuk menghasilkan energy yang cdibutuhkan dalam proses kehidupan sel. Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung

semua

unsur

hara

yang

diperlukan

untuk

pertumbuhan

dan

perkembangan mikroba kemudian susunan makanannya, tekanan osmosis, derajar, keasaman (pH), temperature, sterilisasi. Perlu kita ketahui pembuatan media didasarkan pada fungsi, komposisi media, dan konsistensinya sehingga dalam kultur atau media yang dibuat dapat menumbuhkan mikroba dengan baik dan sesuai dengan baik dan sesuai dengan yang diharapkan. Yang melatar belakangi praktikum pembuatan media adalah agar praktikan dapat menambah pengetahuan mengenai cara pembuatan medium pertumbuhan mikroba. 1.2 Tujuan - Mengetahui fungsi dari masing-masing medium - Mengetahui cara pembuatan medium NA (nutrient agar ) - Mengetahui cara pembuatan medium PDA (potato dextrose agar) 1.3 Manfaat 1. Dapat mengetahui metode-metode pada pengujian antimikroba. 2. Dapat mengetahui potensi antibiotik yang digunakan untuk membunuh mikroorganisme.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Media pertumbuhan mikroba Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo,1996). Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat antara lain : -

Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba

-

Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan

-

Harus mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba

-

Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang diinginkan dapat tumbuh baik (Sutedjo,1996).

2.2 Macam-macam media Media dapat digolongkan berdasarkan atas susunan kimianya, sifat wujudnya dan fungsinya. a. Penggolongan media berdasarkan susunan kimia : -

Media anorganik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik

-

Media organik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik

-

Media sintetik (media buatan). Yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan suatu mikroba

-

Media non sintetik. Yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba (Sutedjo,1996).

b. Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya -

Media cair yaitu media yang berbentuk cair

-

Media padat. Yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan organik alamiah, misalnya yang dibuat dari kentang, wortel, dan lain-lain, atau dapat juga berupa bahan anorganik misalnya silica gel

-

Media padat yang dapat dicairkan, (semi solid), yaitu yang apabila dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya media agar (Sutedjo,1996).

c. Penggolongan media berdasarkan fungsinya -

Media diperkaya. Yaitu media yang ditambahi zat-zat tertentu misalnya serum darah ekstrak tanaman dan lain sebagainya, sehinggan dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang bersifat heterotrof.

-

Media selektif. Yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah pertumbuhan

mikroba

lain

(bersifat

selektif).

Misalnya

media

yang

mengandung Kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri gram negative. -

Media diferensial. Yaitu media yang ditambahi zat kimia (bahan) tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya. Misalnya media daerah agar dapat digunakan untuk membedakan bakteri homolitik (pemecah darah) dan bakteri non hemolitik.

-

Media penguji. Yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin. Vitamin asam-asam amino, antibiotika dan lain sebagainya.

-

Media untuk perhitungan jumlah mikroba. Yaitu media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan.

-

Media khusus. Yaitu media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu (Sutedjo,1996).

2.3 Cara pembuatan media Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai berikut : -

Mencampur bahan-bahan : bahan-bahan yang dilarutkan dalam air suling. Kemudian dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogeny.

-

Menyaring : beberapa jenis media kadang-kadang perlu disaring, dan sebagai penyaringan dapat digunakan kertas saring, kapas atau kain. Untuk media agar atau gelatin penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.

-

Menentukan dan mengatur pH : penentuan pH media dapat dilakukan dengan menggunakan kertas pH, pH meter atau dengan komparator blok. Pengaturan pH media dapat dilakukan dengan penambahan asam atau basa (organik atau anorganik).

-

Memasukkan media ke dalam tempat tertentu : sebelum disterilakan, media dimasukkan ke dalam tabung reaksi, Erlenmeyer atau wadah lain yang bersih, kemudian dibungkus kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah sewaktu disterilkan.

-

Sterilisasi : pada umumnya sterilisasi media dilakukan dengan uap panas di dalam autoclave, pada suhu 121◦ C selama 15-30 menit (Sutedjo,1996).

2.4 Media biak dan persyaratan bagi pertumbuhan. - Media biak a. Media biak kompleks Untuk banyak mikroorganisme bertuntutan tinggi belum dikenal benar bahanbahan makanan yang diperlukan. Orang membiakkannya dalam larutan biak yang mengandung ekstrak ragi, otolisat ragi, pepton, atau ekstak daging. Untuk beberapa kelompok organisme lazim juga digunakan : rempah-rempah, dekok rumput kering, sari buah prem, sari buah wortel, santan dan untuk cendawan kupofil juga sari perasan tahi kuda. Mengingat biaya, larutan-larutan baik tidak dibentuk dari senyawa-senyawa murni tetapi lebih disukai untuk menggunakan zat-zat kompleks, seperti air didih, melaso, air rendaman jagung atau ekstrak kedelei, yang sebagai produk sisa tersedia dengan harga murah. Media bak seperti ini disebut media bak kompleks. (Schlegel, 1994). b. Media biak padat Untuk membuat bak padat pada larutan bak cair di tambahkan bahan pemadat yang member konsistensi seperti selai pada larutan air. Hanya untuk keperluan tertentu masih digunakan gelatin, karena sudah mencair pada suhu 26-30 oC dan banyak mikroorganisme mampu mencairkan gelatin. - Persyaratan bagi pertumbuhan a. Kadar ion hydrogen. Diantara semua ion, ion H+ dan OH- adalah ion-ion yang paling mobil ; oleh sebab itu perubahan kadar yang kecil saja sudah menimbulkan pengaruh yang besar. (Schlagel, 1994). b. Karbondioksida, larun bak yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme yang ototrof yang memfikasi CO2 biasanya ditambahi Na- bikarbonat dan

diinkubasi dibawah atmosfir yang mengandung CO2 dalam wadah tertutup (Schlagel, 1994). c. Kadar air dan tekanan osmotik. Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang luas dari segi tuntutan keperluan akan kadar air (Schlagel, 1994). d. Suhu. Memilih tuntutan mengenai suhu inkubasi miroorganisme berbeda-beda prilakunya. e. Aerasi untuk semua mikroorganisme aerob obligat, oksigen merupakan akseptor electron yang sangat penting. Biak anaerob. Untuk menumbuhkan jenis bakteri yang anaerob kuat penyingkiran O2 udara merupakan persyaratan yang amat perlu (Schlegel, 1994) - Zat hara yang ditambahkan ke dalam media. Pada umumnya bakteri tidak dapat langsung menggunakan N 2 bebas dari udara, sehingga keperluannya diberikan dalam bentuk garam. Nitrogen diperlukan sebagai bahan dasar untuk protein, asam nukleat dan vitamin. Dalam media bahan yang mengandung N ini berupa : -

NH4Cl –N inorganik

-

NaNO3

-

Pepton –N organik

a. Karbon : Sebagai sumber karbon digunakan bernagai gula, pati, glikogen. Gula yang dipakai berupa 5C,6C, atau disakarida (laktosa, sukrosa, dan maltose). Untuk dapat menggunakan sumber karbon ini bakteri dapat menguraikannua menjadi molekul yang lebih kecil yang kemudian digunakan untuk bahan dasar protein, polisakarida, lipida dan asam nukleat. b. Vitamin dan Faktor pertumbuhan : Berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah thiamine, riboflavin, asam nikotinat, asam pantotenas biotin. Vitamin ini berfungsi sebagai koenzim atau bagian lain dari bahan dasar sel (Hastowo,1992).

2.5 Metoda Uji Aktivitas Anti-Mikroba Uji aktivitas anti-mikroba ini diukur respons pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Tujuan assay antimikroba ( termasuk antibiotik dan substansi antimikroba non-antibiotik, misalnya fenol, bisfenol, aldehid), adalah untuk

menentukan potensi dan kontrolkualitas selama prosesproduksi senyawa antimikroba dipabrik, untuk farmakokinetik obat pada hewan atau manusia dan untuk memonetor dan mengontrol kemoterapi obat. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efesien. (Krisno, 2011) 1. Metoda Dilusi Cara ini digunakan untuk menentukan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) dari antimikroba. Prinsip dari metoda dilusi ini adalah membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diunkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM. 2. Metode Difusi a. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba permukaan media agar. b. Metode

E-test

digunakan

untuk mengestimasi

MIC (minimum inhibitory

concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghabat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar. c. Ditch-plate technique Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba. d. Cup-plate technique

Metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji. e. Gradient-plate technique Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dihitung diatasnya.

BAB III METODE KERJA 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum kedua ini melakukan percobaan tentang media pertumbuhan mikroba yang dilaksanakan pada hari Senin, pada tanggal 18 Oktober 2015 pukul 07.30-11.00

WIB. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas Padang. 3.2 Alat dan Bahan A. Alat No

Alat

Fungsi

1

Autoclave

Untuk memanaskan pada suhu tertentu

2

Petridish

Sebagai wadah medium

3

Tabung reaksi

Sebagai wadah cair dan padat

4

Kapas & kasa steril

Sebagai penutup tabung reaksi

5

Aluminium Foil

Sebagai pembungkus

6

Magnetik stirrer

Seabagai alat pengaduk

7

Jarum ose

Sebagai alat metode gores

8

Kaca arloji

Sebagai wadah saat penimbangan

9

Lampu spiritus

Sebagai pemanas (penjaga steril)

10

Erlenmeyer 250 mL

Sebagai wadah media

11

Erlenmeyer 100 mL

Sebagai wadah media

12

Spatula

Sebagai alat untuk mengambil

13

Hot plate

Sebagai pemanas

14

Pinset steril

Alat untuk mengambil

15

Sarung tangan

Alat pelindung

16

Pipet tetes

Untuk memipet

17

Turbidimeter/spektrofotometer Untuk mementukan kadar

18

Tabung eppendorf 2 mL

Sebagai tempat mikroba

B. Bahan No

Bahan

Fungsi

1

Aquadest

Sebagai pelarut

2

Agar

Sebagai bahan pembuat media

3

Tripton/pepton

Sebagai bahan dasar media

4

Ekstrak kahmir (Yeast)

Sebagai bahan dasar media

5

NaCl

Sebagai bahan dasar media

6

0,18 M H2SO4

Sebagai bahan standard Mcfarland

7

0,048 M BaCl2

Sebagai bahan standard Mcfarland

8

CaCl2

Pengkeruh

9

Isolat E.Coli

Mirkoba yang diinokulasi

10

Isolat Staphylococcus aureus

Mirkoba yang diinokulasi

3.3 Skema Kerja A. Pembuata Medium Pertumbuhan Padat dan Cair 1 g tripton + 0,5 g ekstrak khamir + 1 g NaCl - dimasukkan ke dalam beaker 100 mL

- di (+) aquadest 100 mL - pH diatur 7-7,5 dengan NaOH - ditutup dengan foil (30 mL) - disterilkan selama 20 menit (121℃ ) - dibagi menjadi 4 tabung reaksi - ditutup dengan kapas steril Media LB - cair - 70 mL diambil & di (+) 2 gr agar - dididihkan sampai homogen - diautoclave - didinginkan pada suhu 60℃ - dimasukkan dalam petridish - 5 mL LB padat dimasukkan masing-masing 5 mL ke dalam tabung reaksi - dituangkan 10-15 mL LB ke cawan - dibiarkan mengeras Hasil

B. Teknik Pemindahan Mikroorganisme Secara Aseptik dengan Metode Streaking

Biakan E.coli & S.aureus - diinokulasi pada agar miring & cawan - diambil 1 tabung biakan & 1 medium - jarum ose dipijarkan sampai merah

- kedua tabung dipanaskan - diambil biakan dengan jarum ose secara garis lurus saat dingin - diperlakukan hal yang sama pada tabung lain & cawan - cawan ditutup - diinkubasi dalam entkas Hasil

C. Inokulasi Mikroba pada Media Cair Tabung dengan biakan mikroba - di (+) 1 mL aquadest steril - dikerik dengan jarum ose - dipindahkan ke dalam tabung media LB cair - diinkubasi pada suhu 37℃ selama 12-24 jam - kekeruhan diukur sesuai standard Mcfarland - disimpan dalam eppendorf 2 mL - dimasukkan 0,5 mL kultur cair - di(+) 0,5 mL gliserol 50% - disimpan pada suhu 20℃ Hasil

4.2 Pembahasan Percobaan kali ini adalah mengenai pembuatan medium pertumbuhan mikroba dan pemindahan secara aseptik. Pada percobaan ini akan dipelajari bagaimana cara membuat medium pertumbuhan mikroba, mempelajari melakukan inokulasi mikroba serta mempelajari teknik memindahkan mikroba secara aseptik. Media yang akan dibuat yaitu cair dan padat. Pada percobaan ini, medium pertumbuhan yang dibuat adalah Luria-Bertani (LB) yang digunakan untuk membiakkan kultur murni bakteri. Medium LB dibuat dengan komposisi yang berbeda. Media LB yang dibuat ada dua yaitu LB cair dan LB padat. Pada percobaan ini, digunakan pepton, ekstrak khamir dan NaCl yang digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media LB cair. Masing-masing bahan dasar memiliki fungsi sendiri untuk pertumbuhan mikroba yang akan diuji. Pepton berfungsi sebagai sumber protein, ekstrak khamir berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan NaCl sebagai sumber garam mineral dan ion-ionnya diperlukan untuk pertumbuhan bakteri. Ketiga bahan ini nanti akan diperlukan oleh mikroba untuk nutrisinya. Adapun sebagai sumber untuk pembuatan media padat, didapat dari 70 mL dari LB cair yang telah dibuat. Selain itu dalam pembuatan media padat digunakan agar yang berfungsi sebagai pemadatnya. Agar yang digunakan sebanyak 1 gram. Semua peralatan serta media yang telah dipindahkan dalam erlenmeyer harus di autoclave. Hal ini bertujuan untuk mensterilkan alat dan bahan yang akan digunakan sehingga kemungkinan terjadinya kontaminasi kecil. Pada saat autoclave, suhu yang digunakan yaitu 121oC dengan tekanan yaitu 1 atm, hal ini karna pada suhu dan tekanan tersebut kemungkinan mikroba hilang cukup besar. Pada percobaan ini juga melakukan inokulasi. Inokulasi dilakukan menggunakan jarum ose. Jarum ose berfungsi untuk mengambil biakan mikroba yang digunakan. Dalam percobaan ini, kerja dilakukan secara aseptis. Hal ini bertujuan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi dengan mikroba yang digunakan. Kerja aseptis dari percobaan ini dapat dilihat contohnya yaitu saat sterilisasi seperti membakar ujung tabung reaksi, membakar ujung jarum ose, melakukan autoclave pada alat sebelum praktikum, menggunakan masker, menggunakan sarung tangan, melakukan inokulasi pada tempat yang steril (entkas), serta mencuci tangan dengan alkohol.

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Media yang dibuat yaitu Luria-Bertani (LB) dalam bentuk cair dan padat. 2. Inokulasi dilakukan dengan metode goreasan (streaking). 3. Sebagai LB padat digunakan agar untuk pemadatnya. 5.2 Saran Agar percobaan selanjutnya lebih baik lagi, sebaiknya : 1. Memahami materi pembuatan media pertumbuhan mikroba dan inokulasi mikroba 2. Tepat dalam menakar jumlah agar yang digunakan 3. Tetap menjaga kesterilan saat proses percobaan berlangsung.

DAFTAR PUSTAKA Palczar M.J., and E.C.S Cha. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Mc Graw-Hill Book Company, Universitas Indonesia Pres. 1986. McFarland J., The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspension used for calculating the opsonic index and for vaccine J.Amer.Assoc. 14: 1176, (1907) Wilson K, J Walker. Principles and Techniques of Practical Biochemistry 5th edition. Cambridge : Cambridge University Press. 2000.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil No

Gambar

Keterangan

1

Medium LB cair

2

Medium LB padat dalam cawan petri setelah inokulasi