Pembuatan Insulin Rey.docx

2.2 Pembuatan Insulin dengan Teknik DNA Rekombinan 2.2.1 Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan atau sering juga disebut rekayasa genetika merupakan teknologi yang memanfaatkan proses replikasi, transkripsi dan translasi untuk memanipulasi, mengisolasi dan mengekspresikan suatu gen dalam organisme yang berbeda. Biasanya gen dari organisme yang lebih tinggi diekspresikan pada organisme yang lebih rendah. Teknologi ini juga memberikan kesempatan yang tidak terbatas untuk menciptakan kombinasi baru dari gen yang tidak ada pada kondisi normal. Melalui rekayasa genetika, akan dihasilkan kombinasi baru dari materi genetik melalui penyisipan molekul asam nukleat kedalam suatu sistem DNA vektor (plasmid bakteri, virus dan lain-lain) dan kemudian memasukkan vektor ini kedalam suatu inang sehingga akan dihasilkan suatu produk gen dalam jumlah banyak Gen mungkin bisa diibaratkan seperti software biologi yang diprogram untuk menjalankan pertumbuhan, perkembangan dan fungsi organisme. Dengan merubah software dengan cara yang tepat dan terkontrol, akan memungkinkan untuk menghasilkan perubahan yang diinginkan dalam organisme (Gaffar, 2007). DNA dapat di isolasi dari sel tanaman, binatang atau mikroorganisme, dan dapat dipotong dengan enzim tertentu. Fragmen DNA ini kemudian dapat di gabung dengan fragmen DNA lain (DNA vektor) dan kemudian dimasukkan ke sel inang, sehingga menjadi bagian dari komplemen genetik sel inang. Sel inang kemudian dapat diperbanyak dalam skala besar untuk membentuk sifat genetik yang baru dan kemampuan kimia yang tidak dapat dicapai dengan cara konvensional (Gaffar, 2007). Oleh karena itu, teknologi DNA rekombinan ini secara umum terdiri atas 4 teknik yaitu teknik mengisolasi DNA, teknik memotong DNA teknik menggabung

atau menyambung DNA teknik memasukkan DNA ke dalam sel hidup. Teknologi DNA rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan (Tjahjoleksono, 2003). Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA (Tjahjoleksono, 2003). 2.2.2 Pembuatan Insulin dengan Teknik DNA Rekombinan Salah satu aplikasi dari teknik DNA rekombinan adalah pembuatan insulin. Sebelumnya, pembuatan insulin dilakukan dengan mengisolasi langsung insulin dari hewan seperti sapi dan babi. Teknik ini awalnya dipilih karena urutan asam amino pada insulin manusia memiliki kemiripan dengan insulin sapi atau babi. Akan tetapi. Teknik ini memiliki kelemahan seperti adanya potensi alergi, insulin yang dihasilkan sedikit dan cemaran mikroba yang berasal dari hewan asalnya. Oleh karena itu teknik DNA rekombinan lebih diminati. Secara umum sistem produksi yang diadaptasi untuk pembuatan protein rekombinan (protein yang diproduksi oleh sel yang DNA-nya telah dimodifikasi dengan rekombinasi genetik) adalah suatu proses yang berdasarkan pada (Gaffar, 2007): 1. Penggunaan vektor ekspresi (yang berfungsi sebagai pembawa gen pengkode protein yang diinginkan dan bertanggung jawab untuk replikasi, transkripsi dan translasinya.

2. Penggunaan sel inang yang melaksanakan instruksi yang disediakan oleh gen tersebut untuk mensintesis gen yang diinginkan 3. Produksi massa protein yang diinginkan dengan menggunakan suatu inducer yang berfungsi untuk menginduksi produksi protein tersebut. 4. Pemisahan dan ekstraksi protein dari kulturnya dilanjutkan dengan purifikasinya. Untuk mendapatkan produk dari gen yang di kloning maka gen tersebut harus di insersikan ke suatu vektor ekspresi. Vektor ekspresi merupakan vektor hasil rekayasa genetika, dimana penyisipan DNA asing dilakukan diantara suatu promotor dan terminator transkripsi. Sehingga bila suatu gen di insersikan ke vektor ekspresi, maka gen tersebut akan ditranskripsi menjadi mRNA dan selanjutnya di translasi menjadi protein. Selain itu produksi protein rekombinan biasanya dapat di induksi dengan menggunakan suatu inducer tertentu. Protein rekombinan dihasilkan untuk tujuan medis, seperti insulin, interferon atau untuk industri. Enzim-enzim yang digunakan untuk industri pada umumnya merupakan enzim rekombinan. Sebagai contoh akan dibahas produksi insulin rekombinan di E. Coli (Gaffar, 2007). Terapi insulin dilakukan terhadap orang yang menderita penyakit diabetes melitus yang dicirikan terdapatnya sejumlah glukosa di dalam urin. Hal ini disebabkan oleh kurang atau tidak adanya hormon insulin yang berfungsi untuk mengaktifkan enzim yang memasukkan glukosa ke dalam glikogen. Terdapat dua tipe diabetes, yaitu insulin-dependent yang disebabkan oleh tidak adanya hormon insulin dan non-insulin dependent yang disebabkan oleh defisiensi reseptor insulin. Diabetes insulin dependent umumnya sudah muncul sejak bayi. Satu-satunya cara pengobatannya adalah dengan terapi insulin yang dilakukan secara terus-menerus (Gaffar, 2007).

Insulin adalah hormon dari jenis protein yang tersusun dari 51 asam amino. Struktur insulin manusia terdiri dari dua rantai polipeptida yang dihubungkan oleh ikatan disulfida, yaitu polipeptida alfa dan beta. Poli-peptida alfa mengandung 21 asam amino sedang polipeptida beta mengandung 30 asam amino. Apabila urutan asam amino suatu polipeptida diketahui maka dengan menggunakan kode genetik dapat pula diketahui urutan nukleotida gena (DNA) yang mengkodenya. Mengingat bahwa protein insulin cukup pendek maka gen yang kode insulin dapat disintesis secara kimiawi. Insulin berfungsi untuk mengontrol kadar gula dalam darah. Bila kadar gula dalam darah tinggi maka insulin akan membantu mengubah gula darah menjadi glikogen yang biasanya akan disimpan di otot sehingga kadar gula dalam darah normal (Ambarawati dan Susianawati, 2006). Terdapat 3 faktor utama dalam teknik DNA rekombinan ini yaitu: 1. Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisipkan, biasanya berupa plasmid, yaitu lingkaran kecil AND yang terdapat pada bakteri. Plasmid diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing. 2. Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh bakteri akan mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang dicopy sehingga terjadi cloning gen. Bakteri yang sering digunakan adalah E. coli karena bakteri ini memiliki waktu generasi yang cukup pendek yaitu setiap 20 menit 1 sel E.coli membelah menjadi 2 sel. 3. Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim ini disebut enzim endonuklease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu enzim endonuklease yang dapat memotong ADN pada posisi dengan urutan basa nitrogen tertentu.

Insulin yang dibuat dengan teknik DNA rekombinan dapat dibuat dengan tahapan sebagai berikut (Ambarawati dan Susianawati, 2006): 1. Masing-masing gen polipeptida alfa dan beta disintesis secara kimiawi. 2. Gen tersebut disisipkan pada plasmid E. coli yang direkayasa supaya memiliki operon laktosa, yaitu promoter, operator, dan gen struktural 2 yang mengkode ßgalaktosidase. Di samping itu, plasmid ini juga mengandung gen yang mengkode resistensi terhadap amfisilin yang berguna sebagai marker untuk menyeleksi sel yang mengandung plasmid. 3. Masing-masing gen alfa dan beta disisipkan ke dalam plasmid yang terpisah, yaitu pada bagian kanan gen z. 4. Plasmid tersebut lalu dimasukkan ke dalam sel E. coli untuk diekspresikan. 5. Ekspresi operon laktosa akan menyebabkan terbentuknya protein galaktosidase dan protein insulin yang saling berikatan hingga membentuk protein gabungan. 6. Selanjutnya protein gabungan ini dimurnikan lalu dipotong sehingga protein insulin terpisah dengan protein ß-galaktosidase dengan menggunakan kromatografi afinitas. 7. Dengan cara ini akan diperoleh polipeptida alfa maupun polipeptida beta insulin. 8. Akhirnya polipeptida alfa diikatkan dengan polipeptida beta secara oksidasi dengan menggunakan reagen siano bromida. sehingga diperoleh insulin yang utuh dan siap untuk digunakan.

Gambar : Pembuatan hormon insulin

Pertanyaan: Bagaimana cara mengekstraksi insulin hasil rekombinan dari bakteri? Jawaban: Insulin yang dihasilkan oleh bakteri perlu melalui beberapa tahap sebelum siap digunakan. Insulin yang dihasilkan oleh bakteri berupa rantai A atau rantai B secara terpisah dan masih terikat pada B-galaktosidase. Teknik yang digunakan untuk mengekstraksi insulin ini adalah metode kormatografi afinitas. Kromatografi afinitas

adalah metode pemisahan campuran biokimia berdasarkan interaksi spesifiknya, misalnya

antara antigen dan antibodi, enzim dan substrat,

atau reseptor dan ligan.

Prinsip kerjanya adalah Fasa diam biasanya adalah suatu matriks gel, banyak digunakan adalah agarosa; suatu molekul gula linier yang diturunkan dari alga. Umumnya, titik awalnya adalah larutan gugus molekul heterogen yang tidak diketahui, seperti sel lisat, medium pertumbuhan atau serum darah. Molekul yang dikehendaki memiliki sifat yang sudah diketahui dan didefinisikan, dan dapat dieksploitasi selama proses afinitas pemurnian. Proses itu sendiri dapat digambarkan sebagai penjeratan, dengan target molekul yang akan dijerat pada fasa diam. Molekul lainnya dalam fasa gerak tidak akan terjerat karena tidak memiliki sifat ini. Fasa diam kemudian dipisahkan dari campuran, dicuci dan molekul sasaran dibebaskan dari jeratan melalui proses elusi. Setelah terpisah, insulin rantai A dan B perlu disatukan dengan ikatan silang disulfida. Hal ini dilakukan dengan proses oksidasi dengan menggunakan reagen sianogen bromida. Setelah rantai A dan B tersambung, insulin siap dikemas dan digunakan. Sumber: Gaffar, S., 2007, Buku Ajar Bioteknologi Molekul, Bandung, Universitas Padjadjaran. Tjahjoleksono, A., 2003, Teknologi DNA Rekombinan, Institut Pertanian Bogor. Ambarwati, dan Susianawati, N., 2006, Kemajuan IPTEK untuk Kemaslahatan Umat, SUHUF, 18(2): 156-165.