Pembahasan Proseur Restriksi.docx

Restriksi plasmid adalah suatu proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu yang sesuai dengan yang diinginkan menggunakan enzim restriksi yang berkerja untuk pemotongan fragmen DNA situs yang spesifik. Terdapat dua proses rekombinan DNA yaitu enzim yang memiliki peran pada isolasi DNA dan menyiapkan DNA rekombinan, molekul pada DNA rekombinan tidak bisa dibuat tanpa dua jenis enzim, yang pertama adalah enzim restriksi endonuclease yang berperan memotong DNA di situs spesifik yang kedua DNA ligase yang memiliki peran sebagai pelekat dua molekul yang berada di dalam tabung reaksi. Restriksi endonukleuse dnegan cara “sugar-phosphat backbone”, restriksi endonuklase mengenal urutan pasang basa dan bersifat palindron, palindrom adalah urusan basa yang sama do baca 5’ – 3’. Terdapat dua cara pemotongan yaitu ujung rata dan ujung kohesif, ujung rata menghasilkan saat dua utas molekis dipotong dengan posisi yang sama , ujung kohesif menghasilkan pada setiap molekul DNA dipotong dnegan posisis yang tidak sama sehingga satu utas menggantung di beberapa nukleotida. Enzim restriksi merupakan enzim yang digunakan untuk memotong DNA pada situs spesifik yang disebut dengan restriction site. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi fragmen DNA atau urutan nukleotida yang umumnya terdiri dari 4 sampai 8 base pair yang merupakan pasangan basa palindrom dan akan memotong DNA pada posisi diantara atau diluar sekuen yang dikenali enzim restriksi tersebut. Dalam pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA didasarkan pada ukuran fragmen, blunt-ended atau sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap metilasi dan kompatibel terhadap kondisi reaksi. Dalam pemetaan DNA plasmid disiapakan terlebih dahulu komponenkomponen yang diperlukan. Bahan yang diperlukan dalam pemetaan DNA meliputi Plasmid tipe pUC dan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan pada pemetaan plasmid yaitu enzim restriksi BamH1 dan enzim restriksi Nde 1. BamHI merupakan enzim restriksi yang berasal dari Bacillus amyloliquefaciens dengan sisi pemotongan ujung lancip (sticky-ended fragment) G GATCC. Para Praktikum ini, enzim restriksi yang digunakan yaitu BamHI dan HindIII. Sisi restriksi dari enzim BamHI yaitu memotong pada sekuen GGATCC

yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G dan BamHI yang merupakan golongan enzim 6-cutters akan memotong DNA sekitar 300 bagian. Enzim BamHI dapat menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan formasi 5′–PO4–dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends(BamHI) dan bentuk simetris atau blunt ends (SmaI). Sedangkan sisi restriksi dari HindIII yaitu 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah). Enzim ini akan selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs pengenalannya yaitu enam pasang basa. Enzim ini berasal dari Haemophilus influenzae. Setela dilakukan pemotongan, untuk melihat hasil pemotongan dilakukan elektroforesis. Jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis gel yang menggunakan fase diam yaitu gel agarosa dalam melakukan pemisahan molekulmolekulnya. Dasar penggunaan jenis elektroforesis gel agarosa ini karena molekul DNA yang akan dipisahkan berukuran kecil yang memungkinkan dapat melewari pori-pori dari kerapatan gel agorosa yang dibuat. Dan pada umumnya untuk melakukan elektroforesis DNA digunakan metode elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan suatu polisakarida yang diperoleh dari alga merah. Gel agarosa ini dapat dipakai untuk pemisahan DNA yang berukuran lebih dari 100 bp, sedangkan untuk pemisahan DNA yang memiliki ukuran lebih pendek digunakan gel poliakrilamid. Konsentrasi agarosa yang digunakan dalam elektroforesis dapat sangat mempengaruhi mobilitas dari fragmen DNA dikarenakan semakin besar konsentrasi agarosa yang dipakai maka semakin kecil pori-pori dari gel tersebut. Perangkat yang digunakan elektroforesis gel agarosa ini terdiri dari power supply sebagai sumber listrik, cetakan gel, tangki elektroforesis, elektroda dan sisir yang dipakai untuk pembuatan lubang tempat peletakan DNA. Pembuatan lubang ini dilakukan dengan meletakkan sisir di gel agarosa yang belum memadat. Pemisahan dari fragmen DNA ini didasarkan pada elektromobilitas yang berguna sebagai metode analitik maupun metode preparatif. Molekul DNA yang bermuatan negatif akan bergerak menuju anode (elektrode yang bermuatan positif) karena adanya gugus fosfat. Fragmen dari DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama

akan mempunyai elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak perpindahan yang sama. Sedangkan untuk fase gerak yang digunakan dalam percobaan ini adalah buffer Tris-acetate EDTA (TAE).