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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Estudios de Algunos Factores que Afectan el Establecimiento de un Método Espectrofotométrico

Alumno: León Valverde Mario Santiago

Grupo: 4IM1

Sección: 2

Maestro: Hernández Derramadero Fernando

Objetivos:   

Seleccionar tubos comunes de laboratorio pasa ser utilizados como celdas para el espectrofotómetro. Manejar algunos parámetros que intervienen en el establecimiento de un método espectrofotométrico. Establecer condiciones óptimas para la aplicación del método.

Resultados: 1) Selección de tubos para ser utilizados como cubetas: A) Selección de tubos que tengan superficies ópticamente equivalentes (Prueba con H2O Destilada). B) Selección de tubos con diámetro interno equivalente (Prueba con solución de NiSO4 al 4%). Tabla 1. Selección de tubos comunes para usarlos como celdas Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

% T400(H2O) 95 98 95 97 96 95 96 97 97 96 96 97 97 97 98

Tubo No. 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

%T400(H2O) 95 97 95 96 96 96 96 96 97 98

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T400(NiSO4) 100 27 27 27 28 27 28 28 27 27 28 27 28 28 27

2) Factores que afectan el diseño de un método espectrofotométrico: Tabla 2. Curva de calibración de Fe3+ por el método del NH4SCN. Tubo No.

Fe3+ (µg/mL)

A480

1 2 3 4 5 6 7

0.1162 0.3487 0.6975 1.1625 1.7437 2.3250 2.9062

0.0315 0.0555 0.1249 0.2146 0.3010 0.3467 0.4559

A ajustada por regresión lineal 0.0268 0.0629 0.1172 0.1894 0.2798 0.3702 0.4606

8 9 10 11 12 13

3.4875 4.0687 4.6500 5.8125 8.1375 12.787

0.5376 0.6382 0.7212 0.8860 1.3010 2.000

0.5509 0.6413 0.7317 0.9124 1.2739 1.9969

2.5 y = 0.1555x + 0.0087 R² = 0.9991

A480

2 1.5 1 0.5 0 0

2

4

6

8

10

12

14

Concentración deFe3+ (µg/mL) A480

Linear (A480)

Grafica 1. Curva de calibración de Fe3+ por el método del NH4SCN. Límite de detección de un método analítico 𝑦 = 𝑦𝐵 + 3𝑆𝐵

𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥

∴ 𝑎 = 𝑦𝐵 𝑏𝑥 = 3𝑆𝐵

y = 0.1555x + 0.0087 𝑆𝐵 = 𝑆𝑦/𝑥 2 ∑𝑖(𝑦 − 𝑦̂) 𝑖 𝑆𝑦/𝑥 = √ (𝑛 − 2)

0.0035 𝑆𝑦/𝑥 = √ = 0.0178 (13 − 2) 𝑥 = 𝐿𝐷𝐷(𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝐷𝑒𝑡𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛) 𝑳𝑫𝑫 =

∴ 𝐿𝐷𝐷 = 3𝑆/𝑏

3(0.0178) 𝝁𝒈 = 𝟎. 𝟑𝟒𝟑𝟒 0.1555 𝒎𝑳

Tabla 3. Datos para la aplicar el método de Ringbom en la determinación del Fe3+ por el método del NH4SCN. Tubo No.

Fe3+ (µg/mL)

Log [Fe3+]

A480

%T

Absortancia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0.1162 0.3487 0.6975 1.1625 1.7437 2.3250 2.9062 3.4875 4.0687 4.6500 5.8125 8.1375 12.787

-0.9346 -0.4574 -0.1564 0.0653 0.2414 0.3664 0.4633 0.5425 0.6094 0.6674 0.7643 0.9104 1.1067

0.026 0.062 0.117 0.189 0.279 0.370 0.460 0.550 0.641 0.731 0.912 1.273 1.996

93 88 75 61 50 45 23 29 23 19 13 5 1

7 12 25 39 50 55 65 71 77 81 87 95 99

120 100

1.1067, 99

Absortancia

80 60 40 20 0

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

%T 75 61 50 45 23 29 23 19 13 5

Absortancia 25 39 50 55 65 71 77 81 87 95

Log [Fe3+] Absortancia

Grafica 2. Grafica de Ringbom. Tabla 3.1. Límites de %Ep mínimo. Tubo No. 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fe3+ (µg/mL) 0.6975 1.1625 1.7437 2.3250 2.9062 3.4875 4.0687 4.6500 5.8125 8.1375

Log [Fe3+] -0.1564 0.0653 0.2414 0.3664 0.4633 0.5425 0.6094 0.6674 0.7643 0.9104

A480 0.117 0.189 0.279 0.370 0.460 0.550 0.641 0.731 0.912 1.273

120 100

y = 67.706x + 34.208 R² = 0.9942

Axis Title

80 60

Absortancia Linear (Absortancia)

40

20 0 -0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Axis Title

Grafica 2.2. Línea recta de la gráfica de Ringbom. Determinación del porcentaje de error fotométrico %𝐸𝑝 = %𝐸𝑝 =

230.3 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

230.3 = 3.4% 67.706

Tabla 4. Estabilidad del color respecto al tiempo. Tiempo (min) 0 30 60 90 120

A480 0.519 0.497 0.476 0.454 0.445

0.53 0.52 0.51

A480

0.5 0.49

0.48 0.47 0.46 0.45 0.44 0

20

40

60

80

100

120

140

Tiempo (min)

Grafica 3. Estabilidad del color respecto al tiempo. Tabla 5. Efecto de la concentración del cromógeno. SCN- (µg/mL) 290 870 2900 5800 8700 11600 14500

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7

Fe3+ (µg/mL) 4.185 4.185 4.185 4.185 4.185 4.185 4.185

SCN- / Fe3+ 69.2951 207.8853 692.9510 1385.9020 2078.8531 2771.8041 3464.7551

A480 0.267 0.403 0.552 0.657 0.712 0.744 0.769

0.9 0.8 0.7

A480

0.6 0.5

0.4

A480

0.3 0.2 0.1 0 0

1000

2000

SCN- /

3000

4000

Fe3+

Grafica 4. Efecto de la concentración del cromógeno.

Tabla 6. Efecto del pH Tubo No. 1 2 3 4 5

pH 0 1 2 7 8

A480 0.855 0.915 0.916 0.028 0.022

1 0.9 0.8 0.7

A480

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Grafica 5. Efecto del pH

Tabla 7. Efecto de algunos aniones en la reacción de SCN- - Fe3 Anión Fluoruro Oxalato Tartrato Fosfato

A480 inicial 0.886 0.886 0.892 0.877

A480 final 0.086 0.170 0.876 0.710

1 0.9 0.8

Axis Title

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Fluoruro

Oxalato

Tartrato

Fosfato

Axis Title A480 inicial

A480 final

Grafica 6. Efecto de Aniones. Tabla 8. Condiciones óptimas para la determinación de Fe3+ con NH4SCN Parámetro pH Tiempo Concentración de SCNLímites de Concentración con %Ep mínimo %Ep calculado. Aniones que interfieren (en orden creciente) Límite de detección del método (LDD)

Valor óptimo 2 0 min Saturada 0.6975 - 8.1375 µg/mL Fe3+ 3.4% Tartrato, Fosfato, Oxalato, Fluoruro 0.3434 µg/mL Fe3+.

Discusión: En base a los datos obtenidos de los diferentes factores analizados, podemos observarlos de manera concentrada en la tabla 8. El pH optimo para llevar a cabo este método es 2 debido a que, en este valor de pH se encuentra el mayor valor de Absorbancia esto se observa en la gráfica 5, esto promueve que se obtenga el menor porcentaje de error fotométrico, lo cual es conveniente para el establecimiento del método el pH también está ligado a la carga neta del analito, debido a que el ion férrico puede cambiar de carga y convertirse en el ion ferroso, con un pH acido nos aseguramos que solo se encuentre el ion férrico. Al observar la grafica 3. Nos podemos dar cuenta que el valor de absorbancia va disminuyendo con el paso del tiempo lo que nos indica que para realizar las lecturas de una muestra se debe realizar de manera inmediata, debido a que es un complejo inestable, con el paso del tiempo nos exponemos a encontrar lecturas erróneas. Debido a que nuestro analito es el ion férrico, este es el reactivo limitante de la reacción, para tener la certeza de que se va a cuantificar, se debe agregar el ion SCN- en exceso, esto se puede visualizar en la grafica 4, para altas concentraciones del SCN- la lectura de

absorbancia es mejor, por lo que se deduce que al aumentar la concentración en exceso la lectura será más confiable. Los límites de concentración con el menor porcentaje de error fotométrico son aquellos valores de concentración para los cuales toman una tendencia lineal en la gráfica de Ringbom, en base a los resultados de regresión lineal se observa la tendencia de una línea recta como se observa en la grafica 2.2. se concluye que el intervalo de concentración con el menor porcentaje de error fotométrico va de los 0.6975 a los 8.1375 µ/mL de Fe3+. La prueba anterior nos fue de utilidad para determinar el porcentaje de error fotométrico, de acuerdo con las ecuaciones presentadas al dividir 230.3 entre la pendiente de la línea recta se obtiene el porcentaje de error fotométrico, el cual fue del 3.4% para este método. En la prueba realizada con los distintos aniones se observo que la interferencia de la lectura se debía al grado de electronegatividad del anión, pues todos atraen al ion férrico que es el analito que queremos cuantificar sin embargo no lo hacen todos con la misma fuerza, el ion tartrato es el que tiene la menor interferencia, pues es el menos electronegativo, de ahí hasta el Fluoruro, pues se sabe que el Flúor es el elemento más electronegativo de todos por lo que es el mayor competidor del ion SCN- en este análisis. El límite de detección del método se refiere a la cantidad mínima de analito para la cual se puede aplicar le método, de acuerdo con las ecuaciones mostradas se determino que la cantidad mínima detectable es de 0.3434 µg/mL Fe3+. Conclusiones: 1) Las condiciones óptimas para llevar a cabo el método son:     

pH de 2. Lecturas inmediatas. Utilizar una solución de NH4SCN saturada. Trabajar con muestras que contengan entre 0.6975 y 8.1375 µg/mL de Fe3+. Evitar el contacto de Aniones que provoquen interferencias en las lecturas de las muestras, especialmente el Fluoruro.

2) La cantidad mínima detectable por el método es de 0.3434 µg/mL Fe3+. 3) El porcentaje de error fotométrico es del 3.4% Bibliografía:  

Ayres. G. H. 1970. Análisis Químico Cuantitativo. 2ª Edición. Editorial Harla S.A. México D.F., pp. 459-514. Miller, J.L. and J.N. Miller. 1993. Estadística para Química Analítica. 2ª Edición. AddisonWesley Iberoamericana, pp. 86 – 121.