Manual_experimentaciã³n_corregido (2).docx

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA

Manual de Laboratorio de Experimentación Bioquímica-Biológica

ACADEMIA DE QUÍMICA

Clave: 932 Pre-requisito: N/A

ÍNDICE 1. Microscopio y moléculas orgánicas 2. Material Genético 3. Membrana Celular: Transporte Celular y potencial de membrana 4. Organelos celulares y Demostración de Fosfatasa Ácida 5. División Celular: Mitosis y Meiosis 6. Identificación de aminoácidos 7. Propiedades de las proteínas 8. Cuantificación de proteínas 9. Electroforesis de proteínas SDS-Page 10. Catálisis Enzimática 11. Identificación de carbohidratos 12. Identificación de lípidos 13. Extracción y Separación de Lípidos totales de Tejidos Animales

Estructura del Microscopio Práctica No. 1 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

En la actualidad, se dispone de la tecnología para descifrar los principios básicos que rigen la estructura y la actividad de la célula. Por lo general, las células son muy pequeñas para observar a simple vista. Se les visualizó hasta el siglo XVII, cuando se inventó el microscopio. A partir de ese momento y durante cientos de años, todo lo que se supo sobre las células se descubrió con este instrumento. Con el empleo de un microscopio simple, Robert Hooke examinó un trozo de corcho y en 1665 informó que el corcho estaba compuesto por un conjunto de cámaras diminutas, que denominó “células”. -Tipos de microscopios: a) Microscopio óptico: utiliza la luz visible para iluminar las muestras. Permite aumentar las imágenes de las células hasta 1000 veces y resolver detalles de tan solo 0.2 m b) Microscopio electrónico: emplean haces de electrones en lugar de haces de luz como fuente lumínica, lo que amplía mucho la capacidad para observar detalles sutiles de las células. c) Microscopio de fluorescencia: es similar a un microscopio óptico, excepto que la luz atraviesa dos sistemas de filtros y utiliza colorantes fluorescentes para teñir las células. El primero filtra la luz antes de que alcance el espécimen y sólo deja pasar longitudes de onda que excitan al colorante usado. El segundo bloquea esta luz y sólo deja pasar las longitudes de onda emitidas por el colorante fluorescente.

d) Microscopio confocal: es un tipo especializado de microscopio de fluorescencia que construye una imagen por barrido del espécimen con un haz láser. Las células vivas están compuestas por un número limitado de elementos, cuatro de los cuales (CHON) componen el 96.5% de su masa. Los organismos vivos contienen un conjunto característico y restringido de pequeñas moléculas compuestas basadas en el carbono que son esencialmente iguales en todas las especies vivas. Las categorías principales son los azúcares, los ácidos grasos, los aminoácidos y los nucleótidos. Los azúcares son una fuente primaria de energía química para las células y se pueden incorporar a polisacáridos que almacenan energía (almidón, glucógeno). Los ácidos grasos también son importantes como reserva de energía, pero su función primordial es la formación de las membranas celulares. La gran mayoría de la masa seca de una célula está formada por macromoléculas, que son polímeros de azúcares, aminoácidos o de nucleótidos. Los polímeros formados por aminoácidos constituyen las proteínas, los de los azúcares, son los carbohidratos. Los nucleótidos desempeñan una función central en la transferencia de energía y son subunidades que componen el RNA y el DNA. Los nucleótidos están formados por un grupo fosfato, una pentosa y una base nitrogenada que puede ser purina o pirimidina. II. a) b) c) d) e) f) g) h) i) III.

Conocimientos previos ¿Para qué sirve un microscopio? ¿Tipos de microscopios? Esquema del microscopio óptico indicando sus partes ¿Para qué es utilizado el aceite de inmersión? ¿Qué es una base nitrogenada? (ejemplo y estructura de 3). ¿Qué son los aminoácidos? (ejemplo y estructura de 3). ¿Qué son los carbohidratos? (ejemplo y estructura de 3). ¿Qué son los lípidos? (ejemplo y estructura de 3). Investigar cómo se utiliza el microscopio. Objetivo

Aprender a utilizar el microscopio, sus partes y obtener conocimiento de moléculas orgánicas. IV.

Metodología

1) Material y Equipo - Microscopio será proporcionado por el maestro.

-

Porta y cubre objetos. Muestras para observar bajo el microscopio (sangre, papa, flores).

1) Reactivos y Soluciones Ninguno 2) Requerimientos de Seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. 3) Disposición de residuos Ninguno 4) Técnica Se darán un ejemplo de moléculas orgánicas (carbohidrato, aminoácido, lípido), se realizara la representación de la estructura con ayuda de modelos moleculares y se dará la toda la información acerca de la molécula en cuestión. Se indican cada una de las partes que componen el microscopio y se explica su función, después se observan cada una de las muestras elegidas. 5) 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Procedimiento Se escogen muestras para observar bajo el microscopio (sangre, papa, flores) y se cortan en pequeños pedazos. Se ponen las pequeñas muestras en portaobjetos limpios. Se añade una gota de agua o solución a la muestra. Se cubren los portaobjetos con cubreobjetos. Se ponen en el microscopio y con ayuda de los conocimientos previos, se enfoca la muestra y se analiza. 7. Observar las muestras a diferentes resoluciones para comparar. V.

Resultados

a. Cálculos VI. VII. VIII. IX.

Discusión de resultados Conclusiones Anexos Bibliografía

Extracción de DNA e Identificación por Electroforesis Práctica No. 2 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

El ácido desoxirribonucleico (DNA) es el centro de almacenamiento o biblioteca celular que contiene toda la información requerida para construir las células y los tejidos del organismo. El DNA y el RNA se componen de sólo cuatro nucleótidos diferentes, todos con una estructura común: un grupo fosfato unido por un enlace fosfodiéster a una pentosa (una molécula de azúcar de 5 carbonos) que a su vez se une a una base orgánica. En el RNA la pentosa es ribosa y en el DNA desoxirribosa. Los nucleótidos de DNA y RNA difieren además en una de sus bases nitrogenadas, las bases adenina, guanina, citosina y timina se encuentran en el DNA y el uracilo sólo en el RNA. El DNA consta de dos hebras de polinucleótidos asociadas que se enlazan entre sí en el espacio, para formar una estructura que se suele describir como doble hélice. Las dos hebras tienen orientación antiparalela ósea que sus direcciones 5` y 3` son opuestas. La estructura de la doble hélice fue propuesta por James Watson y Francis Crick en 1953, la estructura proveyó las primeras pistas de cómo una molécula de DNA codificaría las instrucciones para la elaboración de proteínas, lo cual marcó el comienzo de la era de la biología moderna. Electroforesis La electroforesis es una técnica que ayuda en el estudio del movimiento de las biomoléculas con una carga neta a través de un campo eléctrico. Su migración depende de la forma, tamaño carga y composición química. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. II.

Conocimientos previos

a) Estructura del DNA b) Carga del DNA c) Función del DNA

d) ¿Qué es la electroforesis y su fundamento? e) Tipos de electroforesis f) Cuál es la función de cada uno de los reactivos utilizados en la práctica: etanol, agarosa, bromuro de etidio, buffer de carga, buffer de corrida TAE, detergente, enzimas o jugo de papaya o ablandador de carne? III.

Objetivo general

Extraer el DNA de células vegetales e identificarlo por electroforesis en gel de agarosa. IV.

Metodología

1) Material y equipo. Material -

2 vasos de precipitado de 250ml 2 vasos de precipitado de 500ml 1 cuchillo 1 mortero con pistilo 1 termómetro de 0-100°C 1 embudo Papel filtro de cafetera o tela porosa 5 Palillos de madera largos 5 tubos ensayo 10x 100

Equipo (lo provee el profesor): -

Lámpara de luz ultravioleta Cámara de electroforesis Fuente de poder

2) Reactivos y soluciones. - ¼ cebolla, 1 fresa, ¼ jitomate, 1/3 plátano (traer por equipo 3 opciones de cualquiera de las anteriores ) - SDS (dodecil sulfato de sodio) - Agua destilada - NaCl (1.5g por equipo) - Enzimas proteasas: 3 ml de jugo de papaya (fresco) o 0.5g de ablandador de carne. - Alcohol etílico (15 ml por equipo) - Agarosa (0.4 g por cada dos equipos)

-

-

400 ml de buffer TAE 1X (por equipo). Para preparar 1L de TAE 1X se necesitan: 4.84g de Tris-base, 1.14 ml de ácido acético y 0.37 g de EDTA. Disolver todo en 1L de agua destilada y refrigerar. Buffer de carga para DNA Azul de bromofenol-Xylene Cyanol (250 ul por cámara). Para preparar 1 ml del buffer: mezclar 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de Xylene-Cyanol, 0.3 ml de glicerol y aforar a 1 ml con agua destilada. Bromuro de etidio (provisto por el profesor)

El bromuro de etidio es un compuesto CANCERÍGENO, MANEJAR CON GUANTES. 3) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. 4) Disposición de residuos Colocar en los recipientes correspondientes. 5) Procedimiento. 1. Se corta la cebolla, fresa, etc., en trozos pequeños para poder triturar con facilidad. Se agregan 15 ml de agua destilada, disolver. 2. Moler las muestras, obtener el jugo y ponerlo en un vaso de precipitado de 150 ml. 3. Agregar 2.5 ml de detergente y se mezcla. 4. Filtrar la solución en un tubo de ensayo con tela porosa (magitel, etc.) o filtro para cafetera (No Watman). 5. Se pesan en la balanza 0.5g de NaCl (POR CADA MUESTRA). Mezclar la solución de sales con la muestra en el mortero. 6. Agregar 0.1 g de las enzimas (ablandador de carne) y disolver. 7. Esperar 5 min y agregar cuidadosamente por las paredes del tubo 3ml de alcohol (etanol) previamente enfriado. Se formarán 2 fases (cuidar de no mezclarlas). 8. Con un palillo de madera o vidrio largo hacer movimientos rotatorios lentos justo entre las dos fases. 9. Sacar con el mismo palillo las hebras blancas (DNA) que se forman y, colocarlas en un microtubo. PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA Y ELECTROFORESIS DEL DNA Preparación de agarosa al 1% en TAE 1X: 0.4g de agarosa disolverla en 40 ml de TAE 1X calentando a 60°C para disolver, una vez disuelta dejarla enfriar hasta

50°C y agregar el bromuro de etidio (profesor). Verter la solución en un molde, colocar el peine y dejar reposar durante 25 min para su solidificación (no mover). El gel de agarosa se coloca en la cámara de electroforesis, se llena la cámara con solución TAE 1X hasta cubrir el gel. Cargar las muestras en los pozos junto con el buffer de carga (azul), tapar la cámara y correr el gel 30 min a 120V (explicación del profesor). Observar el gel en la luz UV.

V. VI. VII. VIII. IX.

Resultados. Discusión. Conclusiones. Anexos Bibliografía

Membrana Celular: Transporte Celular y Potencial de Membrana. Práctica No. 3 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

El Potencial de Membrana se genera cuando los iones en una solución pasan del interior de la membrana hasta exterior. La teoría que mayor aceptación ha tenido para explicar el establecimiento del potencial de membrana es la teoría de la electrodifusión de Nernst-Planck. Esta teoría descansa en los principios de la termodinámica clásica, al comprender como se establece el Vm con la participación de un solo ion (potencial de membrana) permite tener una idea clara del mecanismo básico por el cual se establece el potencial de reposo en condiciones fisiológicas. Distribución iónica asimétrica. Una observación que permite aplicar la teoría de Nerst-Planck a la fisiología es el hecho de que en las células en donde se ha medido la concentración intra y extracelular se presenta una distribución asimétrica de los iones de ambos lados de la membrana. Para los casos citados tenemos que: [k+]e>[k+]i>[Na]e>[Na]i>[cl]e>[cl-]i. Esta asimetría sugiere la presencia de uno o varios mecanismos que le permiten a la célula mantener su medio interno. Se han descrito mecanismos que permiten explicar la distribución asimétrica de los iones entre los líquido intra y extracelular. Equilibrio Donnan. Para comprender el equilibrio Donnan debe tenerse en consideración: principio de electroneutralidad y permeabilidad selectiva de la membrana. Este equilibrio se produce entre los iones que pueden atravesar la membrana y los capaces de hacerlo. Las composiciones en el equilibrio se ven determinadas tanto por las concentraciones de los iones como por sus capacidades. La regla de Donnan establece que sucede: [k+]1 [cl-]1=[k+]2 [cl-]2

Las bombas metabólicas. Se le añade NaCl en el líquido extracelular. Sin embargo, la célula no es impermeable al Na+ y por lo tanto [NA+]e tiende a ser igual a la [Na+]i esto se evita con las bombas metabólicas donde se cambia Na+ por k+ manteniendo la presión osmótica. La ecuación de Nernst-Planck A partir de esta distribución asimétrica es posible aplicar la teoría iónica o de la electrodifusión de Nernst a la célula. La solución de la ecuación establece la diferencia de potencial que habrá en una interface en presencia de un solo electrolito. Potencial de membrana Las células animales mantienen una diferencia de potencial a través de la membrana plasmática que ronda los 90mV, siendo el interior electronegativo con respecto al exterior. Lo que intenta responder este pequeño texto es a que se debe esa diferencia de potencial. La electroneutralidad La existencia de una diferencia de potencial es ante todo una indicación de la existencia de una separación de cargas. De alguna manera las membranas biológicas contribuyen a que se mantenga un exceso relativo de cargas negativas en el interior celular con respecto al medio extracelular. Sin embargo, es un hecho empírico muchas veces elevado a nivel de principio, el que cualquier porción macroscópica de una solución es electroneutra. La contradicción aparente se despeja cuando se considera lo que se entiende por “macroscópica” en la frase precedente. El entorno inmediato de las membranas biológicas puede ser lo suficientemente pequeño para ser considerado no macroscópico, y sin embargo soportar una diferencia de potencial medible con instrumentos usuales. Potencial de Nernst: Es la relación que hay entre el potencial de difusión y la diferencia de concentración de unión. Nivel de potencial a través de la membrana, que se opone exactamente a la difusión neta de un ion específico a través de la membrana

Transporte celular El transporte celular es uno de los fenómenos hablando a escala celular más importante, gracias a éste, las células pueden intercambiar sustancias con su medio

o bien, con otras células mismas. Gracias a esto, algunos organismos como los unicelulares pueden respirar y excretar distintas sustancias. El transporte se puede dar de dos maneras: Pasivo y Activo Pasivo: El proceso es muy similar al de la difusión, definida como la distribución de moléculas en un medio, pasando a una zona de alta concentración a una de baja concentración. No requiere gasto energético, y otro fenómeno que lo representaría es la osmosis. Activo: va en contra de gradiente y requiere gasto de energía. Difusión simple. Es el paso de pequeñas moléculas a favor del gradiente; puede realizarse a través de la bicapa lipídica o a través de canales proteínicos. Difusión simple a través de la bicapa, entran moléculas lipídicas como fármacos liposolubles. Y sustancias apolares como oxígeno y el nitrógeno atmosférico. Algunas moléculas polares de muy pequeño tamaño. Difusión simple a través de canales. Se realiza mediante las denominadas proteínas de canal. Así entran iones como el Na+, K+, Ca2+, Cl-. Las proteínas de canal son proteínas con un orificio o canal interno, cuya apertura está regulada

La principal diferencia entre estos transportes es que el pasivo va hacia el gradiente y el activo va en contra del gradiente. Gracias a que todos los organismos por medio de osmosis mantienen agua, hay dos términos que definen la retención de agua dependiendo de si la célula es animal o vegetal. En las células vegetales: Turgencia Presión ejercida por los fluidos y contenido celular sobre paredes de una célula, al momento de absorber agua, la célula se hincha y se hace más rígida, esto aumenta la presión de la membrana celular y hace que ésta se tense dando una cierta firmeza gracias a la dilatación de las células. En este caso, la pared celular protege a que con toda la presión ejercida no explote. Es el fenómeno que mantiene vivas y firmes a las plantas. El proceso equivalente a una célula animal se llama lisis, en el cuál las células al retener tanta agua, explotan por no tener una pared celular que las proteja.

Plasmólisis Es el fenómeno contrario a la turgencia, en éste, las células pierden agua lo que hace que éstas se contraigan y causa la separación del protoplasto y la pared celular. Esto pasa cuando la célula es sumergida en solución hipertónica, el agua pasa al entorno y se contrae causando que la membrana plasmática se separe de la pared celular. Esto sucede mucho en las plantas cuando hay mucho sol que les está dando directo, las plantas empiezan a transpirar desprendiendo toda el agua contenida en ellas, y empiezan a perder agua. En éste fenómeno la presión de turgencia es nula ya que no hay presión ejercida sobre las paredes celulares y por eso no hay firmeza. El fenómeno equivalente en una célula animal, recibe el nombre de Crenación. . II. a) b) c) d) e) f)

III.

Conocimientos previos ¿A qué se le llama turgencia? ¿Qué es la crenación? ¿Diferencia entre la lisis y la turgencia? ¿En qué consiste la osmosis? Menciona los tipos de transporte celular y explícalos Que es potencial de membrana?

Objetivo General Observar el efecto de diferentes concentraciones de sales en el potencial de membrana y sobre la morfología de células animales.

IV. •

• •

Objetivos Apreciar el fenómeno de potencial de membrana transmembranal para comprender los efectos que tiene esta con varias soluciones de diferente concentración. Diferenciar entre el proceso de difusión y osmosis por medio de la observación de ambos fenómenos. Observar y diferenciar los efectos de soluciones hipotónica, hipertónica e isotónica en células animales.

V.

Metodología

1) Material y equipo. - Voltímetro - 2 Pinzas caimán-caimán - 2 pinzas banana-caimán - 5 tubos de ensayo - Cubreobjetos - Portaobjetos - Muestras de sangre - 1 cascarón de huevo: (retirar la yema y clara en casa para su consumo, enjuagar con agua común y con mucho cuidado para evitar romper la membrana interna). - Microscopio - 2 electrodos de plata (2 cm c/u, conseguirlos fuera de la facultad con los que venden joyería de plata) - 7 vasos de precipitados 100ml - Pipetas - Aforados 100ml - Aforados 5ml - 1 pila AA 2) Reactivos y soluciones. -

3ml de Soluciones al 1.2%, 0.9% y 0.6% de NaCl (soluciones hipertónica, isotónica e hipotónica). Los 3 ml alcanzan para todos los equipos, es decir, los 3 ml son para todo el grupo.

-

100 ml de KCl 400mM. Esta cantidad es por equipo. Calcular lo que se necesita preparar para todo el grupo. (2.982 g de KCl por equipo).

-

30 ml (por equipo) de cada una de las siguientes soluciones de KCl: 100mM (.22g por equipo), 50mM (0.11g por equipo), 20mM (0.044g), 10mM (0.022g por equipo), 5mM(0.011 g por equipo), 2.5mM (0.0055 por equipo), 1mM (0.0022 g por equipo). Los 30 ml son por equipo, calcular lo que se necesita para todo el grupo.

3) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes.

4) Disposición de residuos. Desechar el NaCl al recipiente de sales. 5) Procedimiento. PARTE A. TRANSPORTE CELULAR EN CÉLULAS ANIMALES 1. Limpiar el dedo de un compañero y con una lanceta estéril pincharlo para sacar muestra de sangre. 2. Tomar unas gotas con una pipeta Pasteur y distribuir en tres tubos de ensayo diferentes con soluciones previamente preparadas con 3 mL de 0.6 %, 0.9% y 1.2% de NaCl. 3. Dejar reposar un aproximado de 2 minutos y colocar una gota de la solución en el portaobjetos para cada una de las concentraciones. 4. Observar las muestras al microscopio comparando el tamaño y forma de eritrocitos en cada solución. PARTE B. POTENCIAL DE MEMBRANA 1. Preparar cada una de las siguientes soluciones de KCl: a) Solución para líquido intracelular: 400mM b) Soluciones para líquido intracelular: 100mM, 50mM, 20mM, 10mM, 5mM, 2.5mM, 1Mm Preparación de la membrana celular El huevo cuenta con una parte apical estrecha y una basal más ancha. En el interior del huevo en su parte basal, se encuentra una cámara de aire que separa a las membranas y se procede de la siguiente manera: 1.- Vaciar el contenido del huevo rompiendo su parte apical. 2.-Lavar la parte interior del cascarón cuidadosamente 3.-Exponer la región externa de la membrana basal resquebrajando la región central de la parte basal del cascaron retirándolo con sumo cuidado.

Simulación de las condiciones electrolíticas

1. Llenar vaso de precipitado con solución 1mM y ésta solución se irá cambiando por las demás soluciones extracelulares 2.5 mM, 5mM, 10mM, 20mM 50mM y 100mM 2. Llenar el cascarón con la solución 400mM 3. Colocar el cascarón sobre la solución Medición del potencial transmembranal con electrodos polarizables 4. A partir de la ecuación de Nernst-planck se calcula el valor teórico de potencial transmebranal que se espera registrar: Ek=58log (k+)/(k+) = 58log(20/400)=-75.46mV (Este es el valor teórico del potencial) 5. Colocamos el voltímetro la escala más adecuada para medir con la mayor precisión un valor de orden -75mV. 6. Conectar las puntas del voltímetro a los alambres de plata. 7. Introducir los dos electrodos de plata dentro del líquido extracelular teniendo cuidado de que no se toquen entre sí. 8. Comparase el voltaje hasta que la diferencia de potencial medida de los dos electrodos sea cero. 9. Introduzca el electrodo común del voltímetro en el líquido intracelular dejando el positivo en el líquido extracelular. 10. Repita 3 veces los pasos, observe y registre lo que sucede con el valor de mV en función del tiempo. 11. Calcular la media y la desviación estándar de los datos obtenidos. 12. Tabule y anexar el valor esperado de acuerdo a la ecuación de Nernst como el valor obtenido experimentalmente. 13. Grafique concentración contra potencial para ver el comportamiento del potencial. VI.

Resultados.

a. Cálculos VII. VIII. IX. X.

Discusión. Conclusiones. Anexos Bibliografía

Organelos Celulares y Demostración de Fosfatasa ácida Práctica No. 4 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Organelos Existen dos tipos de células: las eucariotas y las procariotas. Las primeras son las que componen a todos los organismos pluricelulares, tanto las células animales como las vegetales son eucariotas. Las segundas son aquellas que son autosuficientes en la naturaleza, tales como bacterias y arqueas. Ambos tipos de células tienen una estructura similar que les permite cumplir con sus funciones; esta estructura tiene tres componentes principales: La membrana, el citoplasma y el núcleo (sólo en células eucariontes) estos son conocidos como organelos celulares. Desde el punto de vista de su procedencia, las células también se pueden clasificar en célula animal y célula vegetal, pero ojo, estos dos tipos de células son siempre eucariotas. Las células animales no tienen una pared celular (en el exterior de la célula), son heterótrofas porque son incapaces de sintetizar su propio alimento, incorporando los nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos, ya que no poseen cloroplastos con clorofila para la fotosíntesis. Además presentan Lisosomas funcionales para la digestión intra y extracelular (endocitosis y exocitosis). La célula vegetal tiene una pared celular de celulosa, que hace que tenga rigidez. Además estas células tienen los cloroplastos, con clorofila, que son los que gracias a ellos realizan la fotosíntesis y por eso son autótrofos (son capaces de realizar su propio alimento). El cloroplasto es el plasto más importante. Los plástidos son organelos que efectúan diversas funciones, como la síntesis de sustancias y el almacenamiento de alimentos y pigmentos, sólo existen en las células de las plantas y algas. Los plástidos se clasifican en leucoplastos (almacenan almidón o en ocasiones proteínas o aceites); cromoplastos (contienen pigmentos y se asocian con el

anaranjado y amarillo de flores, frutos y hojas otoñales), y cloroplastos (contienen clorofila). Los cloroplastos son los lugares donde se realiza la fotosíntesis, las células de las hojas de las plantas verdes. Tienen formas diferentes y, al igual que las mitocondrias, se dividen por alargamiento y constricción media. Contienen un pigmento llamado clorofila, cuya función es la fotosíntesis: pueden encontrarse en ellos otros pigmentos, como la xantofila, que es amarilla, y el caroteno, que es naranja. Fosfatasa ácida El lisosoma es una vesícula membranosa que contiene enzimas hidrolíticas que permiten la digestión intracelular de macromoléculas. Son orgánulos esféricos u ovalados que se localizan en el citosol, de tamaño relativamente grande, los lisosomas son formados por el retículo endoplasmático rugoso (RER) y luego empaquetados por el complejo de Golgi. En un principio se pensó que los lisosomas serían iguales en todas las células, pero se descubrió que tanto sus dimensiones como su contenido son muy variables. Se encuentran en todas las células animales. No se ha demostrado su existencia en vegetales.

La mayoría de los lisosomas contienen ENZIMAS HIDROLASAS ÁCIDAS. Hasta ahora se han identificado unos 40 tipos distintos de enzimas hidrolíticas, que degradan proteínas (proteasas), ésteres de sulfato (sulfatasas), lípidos (lipasas y fosfolipasas) o fosfatos de moléculas orgánicas (fosfatasas). No todas están presentes en todos los lisosomas. La más común es la FOSFATASA ÁCIDA. El pH es de 5 en el interior del lisosoma. Para mantener este pH, los lisosomas poseen en su membrana una proteína transmembranal que bombea protones hacia el interior del lisosoma. El pH 5 es el óptimo para la actuación de las enzimas. La enzima fosfatasa ácida ubicada en los lisosomas, hidroliza al substrato Bglicerofosfato. El fosfato liberado se precipita como fosfato de plomo mediante la presencia de plomo en el medio-reacción. Este debe prepararse anticipadamente a)

Para permitir que el plomo precipite el fosfato libre que puede hallarse en las muestras comerciales de glicerofosfato libre que puede hallarse en las muestras comerciales de glicerofosfato y b) Para que el plomo se equilibre con el glicerofosfato. No puede utilizar el calcio para esta captura (como en el método de gomori de fosfatasa alcalina) debido a que el fosfato de calcio es soluble a pH en el que la fosfatasa acida actúa en forma óptica. Dado que el fosfato de plomo es incoloro o blanco, se tiene que trans forman en sulfuro de plomo que tiene fuerte coloración (café o negro cuando se encuentra concentrado). Al observarse que los tejidos han sido tratados en un pH acido para producir fosfato de plomo, es probable que el cambio de pH distorsione mucho las células, se debe sugerir entonces en sulfuro de amonio a un nivel muy alcalino de pH, para transformar el precipitado en sulfuro de plomo. De aquí que el H2O-H2s del aparato de kipp, o una solución de sulfato de sodio, se utiliza para este propósito. En un principio se pensó que los lisosomas serían iguales en todas las células, pero se descubrió que tanto sus dimensiones como su contenido son muy variables. Se encuentran en todas las células animales. No se ha demostrado su existencia en vegetales. Entre sus enzimas, la más importante es la fosfatasa ácida. En el caso de los lisosomas se encuentran en la vacuola. Su polimorfismo resulta ahora comprensible, puesto que actúan como vacuolas digestivas y esto proporciona contenidos heterogéneos. Una característica común entre ellos es que contienen ENZIMAS HIDROLASAS ÁCIDAS. Hasta ahora se han identificado unos 40 tipos distintos de enzimas hidrolíticas, que degradan proteínas (proteasas), ésteres de sulfato (sulfatasas), lípidos (lipasas y fosfolipasas) o fosfatos de moléculas orgánicas (fosfatasas). No todas están presentes en todos los lisosomas. La más común es la FOSFATASA ÁCIDA. El pH es de 5 en el interior del lisosoma. Para mantener este pH, los lisosomas poseen en su membrana una proteína transmembrana que bombea protones hacia el interior del lisosoma. El pH 5 es el óptimo para la actuación de las enzimas. Composición química de la membrana de los lisosomas: La hemimembrana interna de la membrana de los lisosomas está intensamente glucosilada, lo que ayuda a proteger la membrana de los enzimas que contiene. La membrana contiene proteínas de transporte que permiten que los productos finales de la digestión (como azúcares y nucleótidos) sean transportados cara el citosol donde van a ser utilizados por la célula o secretados al exterior. La membrana también contiene una bomba de hidrógeno impulsada por ATP que bombea

hidrogeniones cara el interior del lisosoma, lo que hace que se mantenga el pH ácido en su interior, pH ácido necesario para la actuación de las hidrolasas ácidas. Formación de las enzimas lisosómicas y transporte al lisosoma Los enzimas lisosómicos se forman en el RE donde se les va a añadir una manosa. Del RE pasan por transporte vesicular a la cara cis del complejo de Golgi, y aquí, a la manosa se le une un grupo fosfato. Avanzan por tansporte vesicular o tubular por los diferentes sáculos del dictiosoma, y en la cara trans se van a unir la un receptor situado en las membranas de estos sáculos de la cara trans. Estos receptores reconocen la manosa-6-fosfato. De la cara trans del C.G. se escinden vesículas recubiertas de clatrina. Posteriormente el recubrimento de clatrina se pierde y por un transporte dependiente de receptores que van a reconocer los lisosomas, estas vesículas se van a fusionar con los lisosomas. Debido al pH ácido del interior del lisosoma, los enzimas se disocian del receptor. Posteriormente se libera el grupo fosfato que estaba unido a la manosa y ya tenemos los enzimas maduros. A su vez, ve a haber un proceso de reciclaje de los receptores, mediante vesículas que se separan del lisosoma y se fusionan con los sáculos de la cara trans del C.G. Funciones de los lisosomas Degradan los diferentes tipos de sustratos. Dependiendo de su origen, los materiales siguen diferentes rutas incluso los lisosomas. El fluido extracelular y las macromoléculas son captadas por pequeñas vesículas (pinocitosis). Estas pequeñas vesículas, al fusionarse, forman endosomas tardíos. Estos endosomas tardíos se fusionan con los lisosomas primarios y se forman los lisosomas secundarios donde se produce la degradación del contenido de los endosomas. Las partículas extracelulares son captadas por fagocitosis formándose fagosomas que se van a fusionar con los lisosomas primarios dando lugar a fagolisosomas donde se produce la degradación de las partículas fagocitadas. Otra ruta es la de utilizar partes viejas de la célula, así se pueden ver lisosomas digiriendo mitocondrias u otros orgánulos.

II. III.

Conocimientos previos

a) ¿Cuál es la clasificación de los plastos y define la función de cada uno de ellos? b) Explicación de la reacción del medio de reacción con el tejido. c) Fotosíntesis Investigar los siguientes términos: - Membrana plasmática - Citoesqueleto - Retículo endoplasmático Rugoso, RER - Ribosomas - Retículo endoplásmico Liso, REL - Aparato de Golgi - Lisosomas - Peroxisomas - Mitocondrias - Centríolo - Pared celular - Vacuolas 15. Menciona 6 organelos celulares y describe su función 16. Qué tipo de enzimas se encuentran en los lisosomas 17. Cuál es el fundamento del medio de reacción utilizado en la práctica? 18. IV.

Objetivo

Observar y conocer la función de los plastos y lisosomas en células vegetales y animales. Así como conocer el manejo de animales de laboratorio. V.

Metodologia

. Material y equipo. -

Cajas Petri Porta objetos Cubre objetos Microscopio Vegetales: jitomate, zanahoria, papa, nabo (si se consigue) y algas elodea (se consigue en acuarios). Traes de cada uno de los vegetales una pequeña porción o 1 pieza para todo el grupo.

-

Microespátula

6) Reactivos y soluciones. - Cloroformo 7) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes 8) Procedimiento para organelos: 1. Hacer varias rebanadas de los vegetales lo más delgadas posible. 2. Pasar los cortes a una caja petri conteniendo agua de la llave durante 2 min. 3. Montar los cortes más delgados a un portaobjetos. 4. Observar al microscopio. Procedimiento para fosfatasa ácida: 1. Matar el ratón rápidamente, primero se duerme con cloroformo y posteriormente se desnuca, obtener los testículos y tomar una muestra lo más delgada posible, colocarla en un portaobjetos. 2. Haga reaccionar las secciones colocadas en el portaobjetos a una temperatura de 37°C en el medio-reacción, colocándolos en una caja de Petri, dúrate una hora aproximadamente. 3. Al finalizar el tiempo de incubación, lavar con agua destilada para remover todo el plomo que se observe como ion libre. Cubrir durante 1 min con agua destilada que ha sido saturada con H2S o bien por una solución de sulfuro de sodio al 2% en ácido acético 0.1N. Medio-reacción. 4. Agregue 0.53g nitrato de plomo y 40ml de una solución al 3% de Bglicerofosfato de sodio a 400ml de una solución de acetato de sodio 0.05M: Amortiguador de ácido acético a un pH=5. Déjese al menos de un día para otro (preparación desde un día anterior) a una temperatura de 37°C, durante cuyo tiempo, puede formarse un precipitado o floculación. Enfríe y luego filtre, use de inmediato. NOTA: No se necesitan preparar los 400ml de acetato de sodio, ésta cantidad se ajusta dependiendo del número de equipos en el grupo (se utilizan aprox. 5ml por equipo). También se ajustará las cantidades de nitrato de plomo y de la solución al 3% de B-glicerofosfato dependiendo de

cuantos ml de solución de acetato de sodio 0.05M se necesiten. Se utilizarán 7 ml por equipo. VI. VII. VIII. IX. X.

Resultados. Discusion. Conclusiones Anexos Bibliografia

División Celular: Mitosis y Meiosis Práctica No. 5 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

El crecimiento y desarrollo de los organismos vivos depende del crecimiento y multiplicación de sus células, cuando una célula se divide la información genética contenida en su ADN debe duplicarse de manera precisa y luego las copias se transmiten a cada célula hija. En las células eucariotas el ADN está organizado en más de un cromosoma, siendo el proceso de división celular más complejo. El ciclo celular de las células eucariontes se divide en 4 fases. Fase G1, Fase S, Fase G2 y Fase M. Las primeras 3 Fases son parte de un período denominado Interfase durante el cual la célula aumenta de tamaño, el DNA de los cromosomas se replica y se duplica el centrosoma.

La fase M consiste en la división nuclear, o mitosis, y la división citoplasmática, o citocinesis. La mitosis se compone por las siguientes fases: la Profase, la Metafase, la Anafase y la Telofase; en cada una de estas fases se realizan procesos que participan en la división de la célula. Con la mitosis se obtienen células hijas con la misma cantidad de cromosomas que la célula madre.

La citocinesis consiste en división del citoplasma en dos, dando lugar a la formación de dos células hijas. La Meiosis es un proceso de división de las células germinales (sexuales), en el cual solo se transmite a cada célula nueva un cromosoma de cada una de las parejas de la célula original. Por esta razón cada gameto contiene la mitad del número de cromosomas que tiene el resto de las células del cuerpo. Este proceso se lleva a cabo en dos divisiones nucleares y citoplasmáticas, llamadas meiosis I y meiosis II. Ambas comprenden profase, metafase, anafase y telofase. II. III.

Conocimientos previos 14. Investigar: Ciclo celular y sus etapas Mitosis Meiosis Diferencia entre mitosis y meiosis Objetivo

Observar las diferentes fases del ciclo celular en células eucariontes, principalmente la etapa de división celular; observar las diferencias entre la Mitosis y la Meiosis. IV.

Metodologia

1) Material y equipo. - Microscopio - Porta y cubreobjetos - Vaso o recipiente (para sumergir la base del bulbo de la cebolla en agua) - 1 vaso de p.p. de 125mL - Plato caliente - Navaja o pinzas de disección - Bulbo de cebolla fresca de 5-7cm de diámetro - Flor de tradescantia 2) Reactivos y soluciones - Colorante de acetorcamín 3) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. 4) Procedimiento. PARTE A. MITOSIS

1. Quitar raíces y fibras secas de la base bulbo de cebolla sumergir solo la base del bulbo de la cebolla en un recipiente con agua. Las raíces crecerán en 2 o 3 días (hacerlo con anticipación). 2. Cortar 3 mm de la parte inferior de la punta de la raíz, ponerla en un vidrio de reloj y agregarle gotas de colorante de acetocarmín hasta cubrirla. 3. Dejar reposando 10 minutos. 4. Calentar el vidrio de reloj de 3 a 5 minutos (el líquido no debe hervir). No dejar secar, agregar colorante si es necesario. 5. Hacer cortes más delgados de la raíz teñida y disgregar sobre el portaobjetos, cubrir la preparación con un cubreobjetos presionar firmemente para convertir el material del portaobjetos en una capa delgada. 6. Examinar en el microscopio y localizar algunas células en cada etapa de la mitosis. PARTE B. MEIOSIS 1. Recibir del profesor una muestra de Tradescantia. 2. Extraer de las anteras la mayor cantidad de granos de polen posibles, colocarlos sobre un portaobjetos agregar una gota de acetocarmín y cubrir con cubreobjetos. 3. Pasar el portaobjetos sobre la llama del mechero, dejar enfriar. 4. Presionar firmemente para convertir el material del portaobjetos en una capa delgada. 5. Observar la muestra en el microscopio, trate de localizar algunas células en cada etapa de la meiosis. V. VI. VII. VIII.

Resultados Discusión Anexos Bibliografía

Práctica No. 6 FACTORES DE DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Las proteínas se encuentran en diferentes concentraciones dentro de los organismos, para conocer cómo determinarla es necesario conocer algunas propiedades de las mismas. La desnaturalización proteica es cuando se realiza cualquier modificación de su conformación a niveles de la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria que no vaya acompañada por la ruptura de los enlaces peptídicos implicados en la estructura primaria. Por lo que se generan cambios a las propiedades químicas, físicas y biológicas. Puede ocurrir por acción térmica, fuerzas mecánicas, agentes químicos, etc. Durante este proceso las moléculas plegadas y enrolladas de las proteínas, se desdoblan, por lo que se da la coagulación o agregación de las moléculas, formando un gel. La sensibilidad de las proteínas a la desnaturalización térmica, depende de factores como su naturaleza, concentración, actividad del agua, pH, fuerza iónica, etc. II.

Conocimientos previos

a. ¿Qué sustancias se utilizan para la desnaturalización proteica? b. ¿Qué es absorbancia? III.

Objetivo

Identificar el efecto de la concentración, la mezcla con otras substancias, el pH en la temperatura de desnaturalización de las proteínas contenidas en la clara del huevo.

Metodologia 1) Material y equipo Termómetro -

Tiras de pH

-

Vasos de precipitado Tubos de ensayo Pipetas Mechero o plato caliente Gradilla para tubos de ensayo

2) Reactivos y soluciones - Clara y yema de huevo - Agua destilada - Sacarosa - ácido cítrico al 40% - NaOH 2N 3) Requerimientos de seguridad - Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. - Manejo cuidadoso del material a utilizar. 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto 5) Procedimiento PARTE A. DETERMINACIÓN DE LAS TEMPERATURAS DE DESNATURALIZACIÓN (COAGULACIÓN) DE LAS PROTEÍNAS DEL HUEVO. 1. Separar la clara del huevo en dos vasos pequeños de precipitado. Poner una pequeña cantidad de clara de huevo en un tubo de ensayo y calentar el tubo suavemente dentro de un vaso de precipitado con agua (baño maría, con la precaución de no llevar a ebullición). 2. Sujetar un termómetro dentro del tubo de ensayo. Anotar la temperatura en la cual la albúmina de huevo se pone opaca, es decir coagula (aprox. A los 60°C). 3. Repetir lo anterior utilizando yema de huevo y encontrar la temperatura de coagulación para esta proteína. El cambio se reconoce más difícilmente (aprox. a los 65-70°C). PARTE B. EFECTO DE DISTINTOS FACTORES SOBRE LA TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL HUEVO. A)Efecto de la concentración de proteína (dilución).

1. Diluir con agua destilada las muestras de clara y de yema de huevo (2:1, huevo-agua) y agregar 3 ml de cada una de las diluciones en un tubo cada una. 2. Mezclar muy suavemente. 3. Repetir la prueba anterior y registrar las temperaturas de coagulación. B)Efecto de la adición de azúcares (sacarosa): 1.Añadir 1.5 ml de una solución de sacarosa al 50% (p/v) a 5 ml de albúmina de huevo y mezclar suavemente. 2. Determinar la temperatura de desnaturalización. C)Efecto de la adición de ácidos y bases (influencia de pH). 1. Medir el pH de la clara de huevo y anotar su temperatura de coagulación. 2. Añadir a 3 ml de la clara de huevo, unas gotas de ácido (3 gotas de ácido cítrico al 40%) hasta pH=4.8 (pI) y a otro 3 ml de clara de huevo agregar gotas NaOH 2N hasta conseguir una muestra alcalina. 3. Repetir las pruebas y anotar las temperaturas de coagulación. Valores extremos de pH pueden causar coagulación. Por lo que el ensayo no se debe realizar bajo esas condiciones. En el punto isoeléctrico una proteína es menos soluble, por lo que coagulara más rápidamente. 4. El punto isoeléctrico para la albúmina de huevo es de un pH de 4.8 con los valores de pH más cercanos a 4.8 la temperatura de coagulación será más baja. IV.

Resultados

Tabla I: Determinación de las temperaturas de desnaturalización de las proteínas del huevo con distintos factores. Factores Temperatura de Temperatura de desnaturalización de la desnaturalización de la clara (°C) yema (°C) Muestra sin factor Dilución 2:1 con agua Sacarosa pH Ácido cítrico NaOH pH de la muestra Ácido cítrico NaOH

Muestra sin factor

V. VI. VII. VIII.

Discusión Conclusiones Anexos Bibliografía

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Y PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA Existen distintos métodos para determinar las concentraciones de las proteínas. Dentro de ellos se encuentran los siguientes métodos: 1. Biuret: Se crea un complejo en el que se colorea con cobre el enlace peptídico. 2. Lowry: Se crea un complejo y un derivado de la tirosina que contribuye con la absorbancia total. 3. Bradford: Se emplea un colorante hidrofóbico que en presencia de ácido fosfórico; tiene un color café y al entrar en contacto con el entorno hidrofóbico del interior de la proteína, origina un color azul que puede ser medido. Para calcular las concentraciones de las proteínas totales es necesario realizar una curva de calibración, empleando un patrón. Ensayo de proteína Bio-Rad El ensayo de proteína bio- rad, basado sobre el método de Bradford (1976), es un simple y exacto procedimiento para determinar la concentración de proteína solubilizada involucra la adición de un colorante ácido (el reactivo empleado contiene colorante azul de coomassie G2509, ácido fosfórico y metanol) a una solución de proteína, y después media a 595 nm con un espectrofotómetro. La Comparación con una curva estándar da una relativa medida de la concentración de proteína. El ensayo de proteína bio-rad es un método que se basa en el cambio de color de un colorante, dependiendo de las diferentes concentraciones de proteína. La absorbancia máxima para una solución ácida de azul brillante de coomassie va desde 465 nm hasta 595 nm cuando se une a proteínas. El colorante azul de coomassie se une principalmente a residuos aminoácidos básicos y aromáticos, especialmente a arginina. Spector (1978) encontró que el coeficiente de extinción de una solución del complejo colorante-albúmina era constante en un rango de diez veces la concentración. Sin embargo, se debe aplicar la ley de Beer para obtener una cuantificación apropiada de la proteína. Objetivo: Conocer el fundamento y realizar la cuantificación de la proteína total contenida en una muestra biológica por el método de Bradford. CONOCIMIENTOS PREVIOS ¿Cuál es el fundamento de los métodos de cuantificación de proteínas mencionados anteriormente?

¡Qué otros métodos o técnicas conoces?

PARTE C. MÉTODO DE BRADFORD

1. Preparar de 3 a 5 disoluciones de una proteína standard que sea representativa de la solución de proteína que va a ser examinada. El rango lineal del ensayo para BSA es de 1.2 a 10 ≤g/ml. Mientras que con IgG el rango lineal es de 1.2 a 25 ≤g/ml 2. Medir 800≤L de cada estándar y colocar la muestra en una celda 3. y seco. Las soluciones de proteínas se realizan comúnmente en duplicados o triplicados 4. Poner 200≤L de colorante a cada celda. 5. Incubar a temperatura ambiente por lo menos 5 minutos. La absorción se incrementara con el tiempo, las muestras deben incubarse a temperatura ambiente por no más de 1 hora 6. Medir absorción a 595nm 7. Preparación de la solución stock para la curva: 3. Solución 0.1 ≤g/ml: 104.2≤g/ml (150≤g) de la solución comercial de BSA(1.44mg/ml) 1395.8≤l de H2ODD

Celda 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentración BSA (μg/μL) 1 5 10 15 20

Vol. BSA (0.1 μg/μL)

H2O (μL)

Reactivo de Bradford (μL)

10 50 100 150 200 2 5

800 790 750 700 650 600 798 795

200 200 200 200 200 200 200 200

8. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 595 nm. Calcular la regresión lineal o graficar para extrapolar las muestras no conocidas sobre la curva. IX.

Resultados

a. Cuantificación de proteína Muestra Concentración (μg / μL)

Absorbancia

1 2 3 4 5

𝑥=

𝑦−𝑏 𝑚

4. Calcular la concentración de la muestra problema  y = mx + b

m = Pendiente; b = ordenada al origen ; y = Absorbancia Muestra

Concentración Absorbancia

Problema

(μg / μL)

Identificación de Aminoácidos Práctica No. 7 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Un aminoácido es una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Los aminoácidos se pueden clasificar según diversos criterios. Limitándonos a grupos representativos: o o o o

Aminoácidos con un anillo fenólico: Fenil-analina y tirosina Aminoácidos que contienen azufre: Cistina, Cisteína, Metionina. Aminoácidos con un grupo guanídico: Arginina. Aminoácidos derivados del indol: Triptófano.

II.

Conocimientos previos

a) ¿Cuáles son los métodos que existen para la identificación de aminoácidos? III.

Objetivo

Identificar aminoácidos estructurales. IV.

mediante

Metodología

1) Material y equipo - Termómetro - Vasos de precipitado - Tubos de ensayo - Pipetas - Mechero o plato caliente

reacciones

específicas

de

sus

grupos

2) Reactivos y soluciones - Clara y yema de huevo - Agua destilada - Ninhidrina - Reactivo de Millon - HNO3 concentrado - NaOH 40% - Ácido acético concentrado - Ácido sulfanílico - Nitrito de sodio 0.5% - Pedir 0.5g de 2 aminoácidos de distintos grupos: metionina, triptofano, tirosina, arginina, fenilalanina, cisteína. 3) Requerimientos de seguridad - Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. - Manejo cuidadoso del material a utilizar. - Reglamento general del laboratorio. 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto 5) Procedimiento Diluir 1 volumen de clara con 9 volúmenes de agua destilada (1:10) (preparar lo que se vaya a necesitar en la práctica; sacar cálculos). Dejar una porción de clara sin diluir (revisar práctica para sacar la cantidad a utilizar). PARTE A. REACCIÓN CON NINHIDRINA 1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro tubo 1mL de clara diluida y en otro 1mL de la muestra problema (el profesor la entregará). 2. Añadir 1 mL de ninhidrina a cada tubo. 3. Calentar suavemente a baño maría y observar cambio de color. Color azul o rojizo-violeta indica presencia de aminoácidos. PARTE B. REACCIÓN DE MILLON 1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara SIN diluir y 1mL de la muestra problema.

2. Añadir 1 mL de reactivo de Millon a cada tubo. 3. Colocar en baño maría y caliente hasta observar un cambio de color. Si el color de la muestra problema da igual al de la clara de huevo indica presencia del aminoácido fenólico (melón-café). PARTE C. REACCIÓN XANTOPROTÉICA 1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara diluida y en otro tubo 1mL de la muestra problema. 2. Añadir 1mL de HNO3 concentrado a cada tubo lentamente y agitando. 3. Calentar hasta que hierva suavemente y anotar el color. 4. Dejar enfriar. 5. Agregar gota a gota NaOH 40% hasta alcalinizar y anotar color. Si el color de la muestra problema da igual al de la clara de huevo indica que contiene tirosina o bien, una proteína que contiene este aminoácido (rojo ladrillo). PARTE D. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO 1. Colocar en 1 tubo de ensayo 2 mL de agua, en otro 2mL de clara SIN diluir y en otro tubo 2mL de la muestra problema. 2. Añadir 5 gotas de NaOH 40% a cada tubo. 3. Hervir a baño maría durante dos minutos y agitando. 4. Agregar 5 gotas de disolución de acetato de plomo. 5. Anotar color del precipitado. Si el color de la muestra problema da igual al de la clara de huevo indica que contiene azufre. Da un color café obscuro. 6. PARTE E. REACCIÓN DE SAKAGUCHI 1. Colocar en 1 tubo 2.5 mL de agua, 2.5 mL de clara diluida y 2.5 mL de la muestra problema. 2. Añadir 1mL de NaOH al 40% a cada tubo. Mezclar. 3. Dejar reposar en baño de hielo a 2- 4 °C o en refrigerador por 15 minutos. 4. Añadir 2.5mL de alfa-naftol 0.15% y 10 gotas de reactivo de Sakaguchi. Mezclar. 5. Reposar 30 minutos. Anotar el color producido. El color de la muestra problema igual al de clara de huevo indica que contiene arginina u otro aminoácido guanídico (naranja).

PARTE F. REACCIÓN CON ÁCIDO GLIOXÍLICO 1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara diluida y en otro 1mL de la muestra problema. 2. Añadir 2mL de ácido acético concentrado (contiene impurezas de ac. Glioxílico) y mezclar. 3. Añadir a cada tubo 1.5 mL de H2SO4 concentrado muy cuidadosamente y por las paredes (tubo inclinado). 4. Observar la formación de un anillo de color en la superficie de separación de las 2 fases. La formación de un anillo (violeta-naranja) significa que la muestra problema contiene triptófano. PARTE G. REACCIÓN DE EHRLICH 1. Colocar en cada tubo de ensayo 1mL de ácido sulfanílico y 1mL de nitrito de sodio al 0.5% (preparar 3 tubos). 2. Dejar reposar durante 15 minutos. 3. A un tubo agregar 1 ml de agua, en otro agregar clara diluida y en otro la muestra problema. 4. Alcalinizar cada tubo con gotas de hidróxido de amonio 10%. 5. Anotar color producido. El color de la muestra problema igual al de la clara de huevo indica que contiene histidina o tirosina (o ambas)(rojonaranja). V. VI. VII. VIII. IX.

Resultados Discusión Conclusiones Anexos Bibliografía

Millon-fenólicos Xantoporteca- tirosina Acetato de plomo-azufrados Sakaguchi- arginina Ac glioxilico- triptofano Ehrlich- Histidina o tirosina

Electroforesis SDS Page Práctica No. 8 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pHs, temperatura y fuerza iónica. Existen diferentes tipos en función del tipo de separación empleado: electroforesis de zona (separación en función de la carga), isoelectroenfoque y separación por tamaño en tamiz molecular (también aplicable a ácidos nucleicos). Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las

proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina). Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (-) o cátodo (+) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración. Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque). También se suelen utilizar acoplados a zimogramas si deseamos determinar el pI de una enzima o en electroforesis bidimensional como primera dimension. Separación por tamaño: permite separar proteínas y ácidos nucleicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo (no es necesario hacer eso con los ácidos nucleicos, ya que tienen carga negativa); la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes. II.

Conocimientos previos

a) Fundamento de la Electroforesis en poliacrilamida PAGE b) Aplicaciones de la electroforesis PAGE III. • • •

Objetivo Obtener el conocimiento teórico y práctico de la técnica de electroforesis de proteínas (SDS-PAGE). Realizar la preparación de geles para electroforesis. Realizar una cuantifica de proteínas por el método de Bradford para saber la cantidad a utilizar en la electroforesis.

IV.

Metodología

1) Material y Equipo - Equipo para electroforesis 2) Reactivos y Soluciones - Solución A Acrilamida (30% acrilamida, T, 2.67% C) - Solución B Amortiguador para el gel inferior separador (1.5 M Tris-HCl pH 8.8) - Solución C Amortiguador de gel superior o concentrador (o.5 M Tris-HCl pH 6.8) - Solución D SDS 10% - Solución F Amortiguador de electrodo (de corrida) 5X pH8.3 - Solución E amortiguador de la muestra (Tris-HCl 0.05 M 10% SDS pH 6.8) - PSA persulfato de amonio 10% - Solución para teñir geles (azul brillante de coomassie R-250 0.1%) - Metanol 40% - Ácido acético 10% - Etanol 3) Requerimientos de Seguridad - Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. - Manejo cuidadoso del material a utilizar. - Reglamento general del laboratorio. 4) Disposición de Residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto.

5) Procedimiento  Preparación de soluciones o -

Solución A: Acrilamida (30% T, 2.67% C) (30 % acrilamida; 0.8 % de bis-acrilamida) 30 g de acrilamida 0.8 g de N’N’-bis-metilen-acrilamida Cuanto baste para 100 ml de DDH2O

-

Mezclar con agitador magnético, filtrar con papel Whatman No. 1 y conservar a 4ºC. Nota: muy tóxico, usar guantes.

-

5. Solución B: Amortiguador para el gel inferior o separador (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8) 18.17 g de Tris-base Mezclar con 50 ml de DDH2O en el agitador magnético, agregar HCl 1N hasta que el pH sea de 8.8, ajustar a 100 ml y conservar a 4ºC.

-

6. Solución C: amortiguador del gel superior o concentrador (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8) 6.06 g de Tris-base Mezclar con 50 ml DDH2O en agitador magnético, agregar HCl 1N hasta que el pH sea de 6.8, ajustar a 100 ml y conservar a 4ºC.

-

-

-

7. Solución D: SDS 10% 5g de SDS (pesar en el vaso) Ajustar a 50 ml y consevar a 4ºC 8. Solución F: Amortiguador del electrodo (de corrida) 5X, pH 8.3 Tris-base 7.55g Glicina 36 g SDS 2.5 g Ajustar a 500 ml, mezclar y guardar a 4ºC. No ajustar pH. 9. Solución E: Amortiguador de la muestra (Tris-HCl, 0.5 M 10%, SDS pH 6.8) H2O 4.0 ml C 1 ml D 1.6 ml Glicerol 0.8 ml Azul de bromofenol 0.2 ml (0.5%) 2-β mercaptoetanol 0.4 (reductoras) (agregar en el momento). Para condiciones no reductoras, se ponen 4.4 ml de H2O. 10. PSA: Persulfato de amonio 10% 100 mg de persulfato de amonio en 1 ml de H2O.

-

Se prepara en el momento. Solo pesarlo, hidratar hasta el momento de usarse.

-

11. Solución para teñir geles: Azul brillante de Coomasie R-250 0.1 % Metanol 40% Ácido acético 10%

-

12. Solución para secar geles: Etanol 35% Glicerol 2%

PARTE A. PREPARACIÓN DE LOS GELES 1. Lavar los vidrios con agua y jabón con las yemas de los dedos y secar con aire. Limpiar los vidrios con solución amoniacal al 10% o con alcohol con gasa con el objeto de quitar la grasa, ya que esta no permite polimerizar la acrilamida. 2. Atemperar soluciones metiendo los frascos en un baño de agua. 3. Colocar el ensamblador en la cuneta de la torre con las pestañas hacia arriba, tornillos hacia atrás; empujar con la placa de plástico los separadores hasta que se encuentren en los extremos del ensamblado totalmente verticales. Con el acrílico transparente presionar el ensamblado y apretar los tornillos superiores. Verificar la alineación y apretar tornillos inferiores. 4. Acomodar los ensambles en la torre. Presionar el acrílico del ensamble sobre el hule hasta que se inserte el ensamble en la pestaña de la torre (45º empuje hacia abajo y atrás). 5. Pesar el persulfato de amonio (la solución debe ser preparada fresca cada vez). Hidratar 0.0100g en 100 microlitros aproximadamente (10%). Preparar la solución del gel separador según la concentración requerida (ver tabla: para 10 ml suficiente para 2 geles de 5x9 cm de un mm de grosor), sin el SDS ni los catalizadores para desgasificar durante 5 minutos. Una vez desgasificado, añadir los catalizadores.

Gel resolvedor 7.5 10% 12% 12.5 % 15% Gel concentrador (4%) Para vidrios de 1 % mm H2O (ml) 4.85 4.35 3.35 3.2 2.35 H2O (ml) 3.05 Solución B (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Solución C (ml) 1.25 Solución A (ml) 2.5 3.0 4.0 4.15 5.0 Solución A (ml) 0.65 Desgasificar 5 minutos (quitar burbujas) Solución D 100 100 100 100 100 Solución D 50 (microlitros) (microlitros) TEMED 5 5 5 5 5 TEMED 5 ó10 (microlitros) (microlitros) PSA 10% 50 50 50 50 50 PSA 10% 25 (microlitros) (microlitros)

6. Llenar el espacio de entre los vidrios hasta una altura de 2 cm antes del extremo del vidrio pequeño. Con una jeringa Hamilton, cubrir con agua la interfase para evitar la formación de meniscos (también puede utilizarse alcohol isopropílico). 7. Esperar a que se complete la gelificación, aproximadamente, 30 minutos. 8. Secar el agua introduciendo un pedazo de papel filtro. 9. Preparar la solución del gel concentrador (4%) con las mismas indicaciones para desgasificar. Aplicar la solución sobre el gel separador ya formado casi hasta el borde. Introducir el peine según el grueso de los separadores utilizados, así como la cantidad de pozos requerida. Aplicar más solución hasta cubrir los bordes. PARTE B. ELECTROFORESIS 1. Preparar las muestras para analizar en volúmenes totales adecuados al tipo de peine utilizado (volumen del pocito). Para peines de 15 pozos y 1 mm de grosor, trabajar con volúmenes máximos de 10 microlitros (se agregarán otros 10 con amortiguador de la muestra, que contiene glicerol para que por efecto de la densidad se evite al máximo la difusión hacia el buffer de corrida). 2. Hervir las muestras 5 minutos. 3. Montar la cámara con los geles asegurándose de que el hule selle bien y no se presenten fugas. Quitar el gel no polimerizado con pedacitos de papel filtro. Se pueden lavar primero los pozos y después secar con el papel. Poner parte del amortiguador de corrida en el tanque y colocar la cámara en su interior. Llenar el centro de la cámara con amortiguador. Tapar el tanque con los electrodos y conectarlos a la fuente de poder. Encender la

fuente de poder con un voltaje constante: 100 v primeros 20 minutos hasta que el frente llega al gel separador (marca a 2 cm en el vidrio pequeño) y 150 v después de 1 hora hasta el final del gel. 4. Desconectar la fuente y sacar la cámara; despegar los vidrios con los separadores haciendo palanca. Despegar el gel y dejarlo caer en la caja con colorante. Teñir durante 2 horas (o el tiempo necesario para que el colorante difunda por todo el gel) y desteñir con ácido acético/metanol hasta que el fondo se aprecie claro. Si no se desea teñir el gel, puede prepararse para una transferencia.

13. Resultado de electroforesis V. VI. VII. VIII.

Discusión Conclusiones Anexos Bibliografía

Catálisis Enzimática Práctica No. 9 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Las enzimas son proteínas que se encargan de catalizar reacciones biológicas específicas, actuando por reducción de energía de activación de las mismas reacciones. Dentro de las enzimas de clase 1 se encuentra la enzima llamada catalasa, su función se considera muy importante ya que cataliza la descomposición de agua oxigenada, reduciendo su toxicidad. Esta enzima, como otras, es alterable por la presencia de activadores o de inhibidores y por los factores que afectan la estructura y conformación proteica, como son principalmente el pH, la temperatura y la concentración. Los tejidos que no tienen adecuada cantidad activa de la catalasa, son muy sensibles a la acción nociva del agua oxigenada y otros peróxidos. Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces α-1,4 glucosídicos de las moléculas de almidón y glucógeno. Dentro de las amilasas existen dos grupos: α y β amilasas. Las α-amilasas hidrolizan al azar los enlaces internos glucosídicos α-1,4 de carbohidratos que contienen más de 3 unidades de glucosa, dando almidón soluble, eritrodextrinas, acrodextrinas, maltotriosa, finalizando en maltosa y glucosa. Las β-amilasas hidrolizan los enlaces α-1,4 glicosídicos de polisacáridos, eliminando maltosa a partir del extremo no reductor de la cadena (exoamilasa), suspendiendo la hidrólisis cuando llega al punto de ramificación α-1,6. II. a) b) c) d) e) f)

Conocimientos Previos ¿Cómo se clasifican las enzimas? ¿Qué efecto produce el cianuro sobre la catalasa? ¿Qué son las amilasas? ¿Qué es la α-amilasa y cuál es su función? ¿Qué es la β-amilasa y cuál es su función? ¿En qué consiste la hidrolisis de almidón?

III.

Objetivo

Comprobar la presencia de catalasa mediante la reacción con peróxido de hidrógeno, observar su actividad ante ciertos inhibidores y medir cuantitativamente su actividad específica; así como la presencia de amilasa con sacáridos. IV.

Metodología

1) Material y Equipo - 15 Tubos de ensaye de los más pequeños - 1 gradilla - 3 pipetas de 1 ml - 3 pipetas de 5 ml - Baño María - Matraz 50 mL - Vasos de precipitado de 100 mL - Pipetas pasteur o goteros (uno para cada tubo) 2) Reactivos y soluciones. - Almidón al 1% en agua o en regulador de fosfatos 0.02 M - Solución de yodo (lugol) - Amilasa salival (ptialina): esta la proveerá el alumno en el momento de la práctica. Se obtendrá de la saliva. Se necesita fresca. - Cloruro de sodio al 5% - Amortiguador de fosfato 0.02 M de pH 7 - H2O2 0.05M en amortiguador de fosfato 0.02M de pH 7 - Agua destilada - KCN 5x10-4 - Catalasa: el estudiante la proveerá en el momento de la práctica. Se obtendrá de la sangre. - KMnO4 0.05M - H2SO4 6N 3) Requerimientos de seguridad Bata, lentes, guantes y reglamento general. 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto. 5) Procedimiento.  Preparación de Reactivos - Lugol: Pesar 1 g de KI y 500 mg de yodo y disolverlos en 100 mL de agua destilada.

-

Regulador de fosfatos 0.02 M pH 6.9: Pesar 7.12 g de Na2HPO4•12H2O y aforar a 1000mL con agua destilada. Pesar 2.72 g de KH2PO4 y aforar a 1000 mL con agua destilada. Mezclar en proporción 6:4. Ajustar el pH si es necesario. Ajustar las cantidades de los reactivos para el volumen que se utilizará en la práctica.

PARTE A. AMILASA  Preparación de la amilasa: 4. 5. Pruebas: 1. Se prepara una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de acuerdo a la tabla, utilizando 5 diluciones diferentes de enzima. 2. Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1 minuto después de adicionada, haga la prueba de gota del contenido de cada tubo con solución diluida de yodo (lugol). Transcurridos 10 minutos, haga las determinaciones cada 2 minutos, que las lecturas se parezcan al tubo testigo.(ANTES DE AGREGAR LA ENZIMA RESUSPENDA LA SOLUCIÓN DE ALMIDÓN, YA QUE ÉSTE SE ASIENTA EN EL VASO DE PRECIPITADO). 3. Se anota el tiempo inicial y final de la digestión en cada tubo.  Preparación de los tubos: No. De tubo 1 2 3 4 5 6 Almidón 1% (mL) 0 1 1 1 1 1 Agua destilada 1 0 0 0 0 0 (mL) Pre-incubación 5 minutos en baño maría a 37 °C 1:10 1:5 1:10 1:20 1:40 1:50 Enzima (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 NaCl 5% 1 gota a cada tubo y agitar Incubación 37°C en baño maría Lectura (min) Color 0 2 4 6 8 10 PARTE B. CATALASA

Testigo 0 1 0

 Preparación de la Catalasa: 1. Se utiliza como fuente de enzimas una disolución de sangre fresca de 1:1000. Se ponen 10 mL de agua destilada fría en un matraz de 50 mL rodeado de hielo picado. Se recoge una muestra de sangre fresca capilar del dedo, del orden de 10 lambda (10 µL), mediante la punción de una lanceta estéril. 2. Se deja caer la sangre en el agua fría. Se toma agua con la pipeta varias veces para asegurar que toda la sangre pasó al agua. Se agita el matraz durante un minuto para tener una mezcla homogénea. La sangre diluida se mantiene a temperatura baja todo el tiempo para evitar una inactivación de calor. 3. Los reactivos se preparan a partir de la tabla 4. Se preparan los tubos de ensayo de 18 x 150. Todos los reactivos deben encontrarse a temperatura de hielo fundente, y la reacción se lleva a cabo a 0 °C. Después de añadir cada componente, se mezcla el contenido de los tubos por movimientos de rotación. 5. El tubo 1 es un blanco de reactivo y representa la cantidad total de H 2O2 añadida en cada tubo. En este tubo se añaden 2 mL de H2SO4 6 N antes de añadir la enzima; el ácido debe añadirse a ese tubo antes de iniciar las reacciones en los demás tubos. Se calcula la cantidad de KMnO4 0.005M que se necesita para que reaccione con 2 mL de H2O2 0.05. Si el tubo 1 no da un valor vecino calculado, se descompuso la solución en peróxido y debe prepararse otra nueva. 6. En los tubos 2 a 5, la reacción se detiene 5 minutos exactamente después de empezar, por adición de 2 mL de H2SO4. Después de terminar la reacción en el momento indicado, la mezcla de enzima inactivada se pasa a un vaso de 50 mL. 7. El H2O2 que no fue descompuesto por la catalasa permanece estable en la solución ácida durante media hora aproximadamente. Durante este periodo se termina la titulación del peróxido con KMnO4 0.005 M. La primera gota de permanganato en exceso respecto a la cantidad necesaria para la oxidación del peróxido vuelve rosa la solución. Número de tubo Amortiguador de fosfatos 0.02 M (mL)

H2O2 0 .05 M en amortiguador de fosfato 0.02 M (mL) Agua (mL) KCN 5x10-4 M (mL) Catalasa (mL)

1 10 2

2 10 2

3 10 2

4 10 2

5 10 2

1.0 0 0.5

1.0 0 0.5

1.0 0 0

0.5 0.5 0.5

0 1.0 0.5

Catalasa calentada (mL)

V.

0

0

0.5

0

0

Resultados

PARTE A. a. b. Indique el tiempo necesario para que la reacción sea completa en cada tubo. c. Calcule las unidades de amilasa en cada tubo, definiendo una unidad de amilasa como “Número de milímetros de solución de almidón 1% que pueden ser hidrolizados en 30 minutos, por 1 mL de extracto puro, condiciones de pH y temperatura a la que haya trabajado”. d. Explique brevemente, ¿Cómo demostraría que la reacción fue completa? PARTE B. a. Completa la siguiente tabla: Número de tubo 1 2 3 4 5 mL de KMnO4 0.005 M utilizados H2O2 restante H2O2 descompuesto Actividad específica b. Cálculo de la actividad: La actividad de la catalasa puede expresarse como µmoles de H2O2 descompuestos por efecto de la enzima en 5 minutos a 0 °C por mL de sangre. Para empezar, puesto que se utilizó una solución 0.05 M de H2O2 al iniciar el experimento, existían en este momento 100 µmoles de H2O2 en cada tubo. Para los cálculos, el testigo de tiempo 0 es el número de µmoles de H2O2 encontrados en el tubo 1; si se produjo alguna reacción enzimática, se encontrará una cantidad de H2O2 inferior a los 100 µmoles existentes al principio. La estequiometría de la descomposición del H2O2 por el permanganato indica que por cada 2 moles de MnO4- que se añaden se descomponen 5 moles de H2O2. El factor es 2.5. Para calcular los µmoles restantes de H2O2 deben multiplicarse por 2.5 los µmoles de MnO4- que se añadieron. Restando la cantidad de H2O2 que no fue atacado de la cantidad de H2O2 existente al principio (tubo 1) se pueden conocer los µmoles de H2O2 descompuestos. Como se trabajó con una disolución de sangre de 1:1000, y el ensayo se realizó con una muestra de 0.5 mL, los µmoles de H2O2 descompuestos por la catalasa deben multiplicarse por 2000 para obtener la actividad específica de catalasa correspondiente a la definición antes mencionada. Se calculan las inhibiciones por 100 en los tubos 3 a 5, y se señalan en el reporte.

VI. VII. VIII. IX.

Discusión Conclusiones Anexos Bibliografía

Estructura y Funcionamiento de los Carbohidratos Práctica No. 10 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes en la naturaleza. Se conforman por monosacáridos (unidades básicas), oligosacáridos (oligómeros) y polisacáridos. Pueden representarse con la formula estequiométrica simple (CH2O)n. Sin embargo, esta fórmula es una simplificación excesiva, ya que muchos carbohidratos están modificados y algunos contienen grupos amino, sulfato y fosfato. Los carbohidratos desempeñan gran variedad de funciones en los organismos vivos. De hecho el principal ciclo energético de la biosfera (fotosíntesis y oxidación metabólica) depende en gran parte del metabolismo de los carbohidratos como el glucógeno y el almidón. La glucosa es el carbohidrato más importante. La mayor cantidad del carbohidrato dietético pasa al torrente sanguíneo en forma de glucosa o es convertida en el hígado y, a partir de ella, pueden formarse los demás carbohidratos en el cuerpo. Es también el combustible principal de los mamíferos (excepto los rumiantes) y un combustible universal para el feto. Los polímeros insolubles de glúcidos actúan como elementos estructurales y de protección en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos conjuntivos como lubricantes de articulaciones óseas o como adhesivos celulares. Los polímeros complejos de glúcidos, unidos covalentemente a proteínas o lípidos, actúan como señales que determinan la localización intracelular o el destino metabólico de estos glucoconjugados.

II. a) b) c) d) e) f) g) h) III.

Conocimientos previos ¿Cómo se define y cuál es la estructura de los carbohidratos? Clasificación de los carbohidratos. ¿En qué consiste el método de Molish? ¿En qué consiste el método de Tollens? ¿En qué consiste el método de Seliwanoff? ¿En qué consiste el método de Fehling? ¿En qué consiste el método de solubilidad y reacción de yodo? Objetivos

Comprender e identificar enlaces glucosídicos así como las reacciones que pueden llevarse en los carbohidratos dependiendo de su conformación. IV.

Metodologia

1) Material y equipo - Tubos de ensaye - Gradillas - Perilla - Baño maría - Termómetro - Pipetas 1ml - Pipetas 2 ml - Gotero 2) Reactivos y soluciones - Glucosa al 1% - Sacarosa al 1% - Furfural al 1% - Arabinosa al 1% - Almidón al 1% - Maltosa al 1 % - Lugol - Reactivo de Molish al 1% - Reactivo de Fehling, sol. A y B - Reactivo de Tollens - Ácido sulfúrico concentrado - Reactivo de Seliwanoff

3) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto. 5) Procedimiento  Preparación de soluciones y reactivos - Glucosa al 1%: Disolver 1g de glucosa en 100mL de agua destilada. Refrigerar. - Sacarosa al 1%: Disolver 1g de sacarosa en 100mL de agua destilada. Refrigerar. - Fructosa al 1%: Disolver 1g de fructosa en 100mL de agua destilada. Refrigerar. - Arabinosa al 1%: Disolver 1g de arabinosa en 100mL de agua destilada. Refrigerar. - Furfural al 0.01%: Tomar 0.01mL (10 microlitros) de furfural y disolver en 100 mL de agua destilada. - Solución de almidón al 1%: Pesar 1g de almidón y disolver en 100mL de agua caliente. - Maltosa al 1%: Pesar 1g de maltosa y disolver en 100mL de agua destilada. - Lugol: Pesar 1g de yodo metálico, 2g de KI (2 partes de KI por una de yodo). Mézclese en un mortero y agregue agua destilada poco a poco hasta disolución total. Aforar a 300mL con agua destilada y conservar en un frasco ámbar. - Reactivo de Molish: Disolver 5g de α-naftol en 100mL de alcohol de 96°. - Reactivo de Fehling: Solución A. Disolver 34.65g de sulfato de cobre en 300mL de agua destilada. Aforar a 500mL con agua y conservar en frasco con tapón de hule. - Solución B. Disolver 125g de KOH y 173g de tartrato de sodio y potasio. Aforar con agua destilada a 500mL. - Reactivo de Tollens: Mezclar 10mL de HCl concentrado con 2mL de floroglucina al 2% y aforar con agua destilada hasta 18mL. - Reactivo de Seliwanoff: Disolver 0.05g de resorcinol en 100mL de HCl - diluido 1:3.  Pruebas de identificación PARTE A. REACCIÓN DE MOLISH

14. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla 1) coloque 1mL de la solución a probar y 2 gotas del reactivo de Molish 15. Mezclar bien y dejar resbalar por la pared 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, de tal manera que se forme una capa bajo la solución del carbohidrato. En la interfase aparecerá un anillo de color violeta rojizo lo cual indica la presencia de carbohidratos. PARTE B. REACCIÓN DE TOLLENS 1. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla 1) colocar 1mL del reactivo de Tollens y 0.5 mL de la solución a probar, mezclar y calentar a baño maría 1 h. La aparición de un color rojo cereza en 2 o 3 minutos indicará positivo para pentosas. Solo con el furfural la reacción positiva da color verde. La pentosa con HCl se convierte en furfural y da coloración roja. PARTE C. REACCIÓN DE SELIWANOFF 1. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla 1) colocar 1mL de la solución a probar y adicionar 0.5mL del reactivo, calentar a baño maría 1 min, anotar en resultado y continuar calentando observando el cambio de color a intervalos de un minuto durante 15 minutos. Las pruebas dan positivo para dos tipos de carbohidratos cuando se obtiene un color rojo intenso o cuando dan la prueba muy débil y ocurre lentamente. Precipitado rojo indica prueba positiva para cetosas. PARTE D. REACCIÓN DE FEHLING 1. Testigo: mezclar 0.5 de Fehling A y 0.5 del B, añadir 2mL de agua destilada y calentar a ebullición en baño maría para determinar si la solución por sí misma produce un precipitado rojo parduzco de óxido cuproso. Repetir en la misma forma la prueba pero usando 1mL de cada una de las soluciones marcadas con * en la tabla 1 y 1mL de reactivo de Fehling A y 1ml del B, calentar a baño maría y hacer lectura en intervalos de un minuto durante 5 minutos. La prueba positiva color rojo cuproso indica la presencia de azúcar reductor. PARTE E. SOLUBILIDAD Y REACCIÓN DEL YODO Solubilidad:

1. Ensayar la solubilidad en agua fría y caliente tomando 50mg de almidón y disolviendo en 2 o 3mL de agua destilada. 2. Repetir esta prueba con sacarosa, glucosa y fructuosa. Reacción del yodo: 1. Tomar 1mL de la solución de almidón y adicionar una gota de lugol, observar el color producido caliente en baño maría al tacto (37°C). 2. Repetir la prueba con cada una de las soluciones anotando resultados e interpretación. V.

Resultados

a. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación en carbohidratos. Mollish Tollens Seliwanoff Fehling Solubilidad Yodo (carboh) (pentosas) (cetosas) (Azúcar Frío (polisacarid) Reduct) Caliente Blanco H2O * * * * * * * Glucosa * * * * * * * (aldohexosa) Arabinosa * * * * Maltosa * * * * * Sacarosa * * * * * * Fructosa * * * * * * Furfural * * * Almidón * * * * * * Interpretación

CÁLCULOS: La cantidad indicada a continuación para preparar cada uno de los reactivos está considerada para un solo equipo, por lo tanto las cantidades mostradas se tienen que multiplicar por el número total de equipos, y deben considerar un equipo extra por lo del pipeteo.

Se necesitan 5 ml de cada uno de los carbohidratos. Pedir 0.05g de cada uno. Preparar 200 ul de lugol, 1ml de reactivo de Mollish, 8 ml de reactivo de Tollens, 4 ml de reactivo de Selliwanof, 9 ml de reactivo de Felling A y 9 ml del B; 100 mg de

cada uno de los carbohidratos indicados en la tabla para la prueba de solubilidad; 3 ml de furfural al 0.1% VI. VII. VIII. IX.

Discusion Conclusion Anexos Bibliografía

Extracción y separación de lípidos totales de tejidos animales Práctica No. 11 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Los lípidos son moléculas orgánicas que presentan funciones de reserva de energía, estructura celular, biocatalizadores y como medio de transporte. Los lípidos se pueden dividir en saponificables, estos en simples (acilgliceridos y céridos) y en complejos (fosfolípidos y glucolípidos), y en insaponificables (terpenos, esteroides, prostaglandinas). Los lípidos son insolubles en agua y menos densos que ella. Se disuelven bien en disolventes no polares, tales como el éter sulfúrico, sulfuro de carbono, benceno, cloroformo y en los derivados líquidos del petróleo. Se encuentran lípidos tanto en vegetales como en los animales. Muchos vegetales acumulan considerables cantidades de lípidos en los frutos y semillas. Los animales tienen grasa en las diferentes partes de su cuerpo, especialmente entre la piel y los músculos, en la medula de los huesos y alrededor de las vísceras. Hay lípidos solidos denominados grasas, y líquidos denominados aceites. El término grasa se emplea para aquellas mezclas que son sólidas o semisólidas a temperatura ambiente, en tanto que el término aceite a mezclas que son liquidas a temperatura ambiente. La fosfatidiletanolamina (PE) o cefalina es un fosfolípido presente en las membranas celulares, uno de los más abundantes en los tejidos humanos. Está compuesta por un glicerol esterificado en los hidroxilos 1 y 2 por dos ácidos grasos, y en el hidroxilo 3 con un grupo fosfato que, a su vez, se esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol. La fosfatidiletanolamina posee mayoritariamente ácido palmítico, ácido esteárico u ácido oleico en posición 1 y un ácido graso poliinsaturado de cadena larga, como el ácido araquidónico, e

posición 2. Es, junto con la fosfatidilcolina, uno de los fosfolípidos más frecuentes en la bicapa lipídica de las membranas celulares. La fosfatidilcolina o polienilfosfatidilcolina (tambié n llamada lecitina) es un fosfolípido que, junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis. Es el componente más abundante de la fracción fosfatídica que puede extraerse tanto de yema de huevo, como de granos de soja. La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares. Además es un componente de mayor relevancia en la lecitina, y en algunos contextos, los términos se usan como sinónimos. Sin embargo, el extracto de lecitina está constituido por una mezcla de fosfatidilcolina y otros compuestos. En esta práctica se asume que el extracto obtenido por extracción soxhlet corresponde al contenido graso de la muestra. Se determina su masa, una vez libre de disolvente, por pesada (método gravimétrico). Muchas veces, la extracción soxhlet se usa como primer paso de una purificación o separación. La extracción de muestras solidas con disolventes, generalmente conocida como extracción solido- liquido o lixiviación, es un método muy utilizado en la separación de analitos de muestras sólidas. II.

Conocimientos Previos

a) ¿Qué son los lípidos? b) Clasificación de los lípidos. c) ¿Qué es la lecitina (fosfatidilcolina colina)? Dibujar la estructura. d) ¿Qué es la cefalina? Dibujar la estructura e) Funciones de lípidos y ejemplos f) ¿En qué consiste la condición patológica conocida como “hígado graso”? g) ¿Cuáles son las causas más frecuentes del “hígado graso”? III. •

Objetivo Realizar la identificación y cuantificación de lípidos en los tejidos animales.

•

IV.

Determinación del contenido graso de una muestra de leche en polvo mediante extracción solido- liquido (extracción Soxhlet). Metodología

1) Material y equipo - 2 Vaso de precipitado de 50 mL - Embudo de vidrio - Tubos de ensaye - Mortero - Termómetro - Plato caliente - Varilla de vidrio - Papel filtro - Equipo de extracción de Soxhlet (MICROKIT) - Bomba recirculadora - Mangueras - Pipetas 2) Reactivos y Soluciones - ¼ Yema de huevo (alcanza para 4 equipos) - Éter de petróleo - Alcohol - Acetona - Hígado animal (1g) - Éter etílico - Sulfato sódico anhidro (2g) - Muestra de leche en polvo a analizar (comprar leche nido u otra marca no descremada, bolsa pequeña para todos los equipos) 3) Requerimientos de Seguridad Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes. 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto. 5) Procedimiento PARTE A. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE LECITINA Y CEFALINA DE HUEVO

1. Separe 1/4 yema de huevo en un vaso de precipitados o en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. 2. Agregue 10 mL de éter etílico 3. a la yema y agite con una varilla de vidrio para homogenizar bien. 4. Agregue lentamente y sin dejar de agitar 10mL de acetona. Se observara que la acetona provoca la precipitación de los fosfolípidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos. 5. Dejar en reposo unos minutos y filtrar. 6. El precipitado que contiene lecitina y cefalina (en el papel filtro) se lava con 5 mL de alcohol bien frio, recibiendo el filtrado en un tubo limpio y seco. 7. La lecitina es más soluble en el alcohol frío por lo tanto queda en el filtrado. En el papel filtro únicamente queda cefalina. Para obtener la lecitina, evapore el alcohol lentamente en el plato caliente. 8. Deje secar los dos precipitados y péselos (pesar en un inicio el papel filtro y el vaso). PARTE B. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS TOTALES DEL HÍGADO 1. Pese 1gr de hígado animal y anote este peso. 2. Corte el tejido en fragmentos pequeños y póngalos en un mortero, con dos veces su peso de sulfato de sodio anhidro. 3. Muela la mezcla en el mortero hasta obtener una pasta homogénea. 4. Agregue 5mL de alcohol y continúe homogenizando. Transfiera la papilla a un matraz Erlenmeyer ayudándose con una porción más de alcohol de 5mL de modo que quede limpio el mortero. 5. Coloque el matraz en un baño de agua a 70°C y manténgalo en agitación a esa temperatura durante 10 min. 6. Deje enfriar y agregue 10mL de éter etílico para completar la extracción; agite bien y deje reposar hasta que se asiente por completo. 7. Decante el sobrenadante y agregue al residuo otra porción de 10mL de mezcla de alcohol- éter en proporción 3:1; que se calienta a 70°C y se decanta de la misma forma. 8. Evapore el éter de las decantaciones reunidos, colocando el matraz en el baño caliente, hasta que ya no se desprendan disolventes. PARTE C. EXTRACCIÓN DE GRASA POR EL MÉTODO SOXHLET 1. Pesar 1gr de la leche en polvo. Hacer con el papel filtro un paquete de tal forma que la muestra quede segura. Colocar el paquete en la cámara de extracción.

2. Pesar el balón vacío, en el cual posteriormente se depositara la grasa, anote el peso. Fije el balón a la parte inferior del Soxhlet en forma segura, con la finalidad de evitar la fuga del éter etílico. 3. Por la parte superior del Soxhlet vierta el éter etílico o de petróleo hasta que por diferencia de presión baje a través del cuello de Soxhlet al balón, luego añada éter etílico hasta cubrir el paquete. Fije bien el Soxhlet a la parte inferior del refrigerante. 4. Empezar la extracción, extraer por 60 min. 5. Transcurrido el tiempo desmontar el aparato y secar el solvente que quedo en el matraz y pesar para sacar por diferencia el peso de los lípidos. 6. Evite que la grasa depositada en el balón se queme. V.

Resultados

16. Cálculos El porcentaje en grasa G (%) se calcula según la siguiente expresión: 𝐺(%) = VI. VII. VIII. IX.

𝑥 𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑥100 1𝑔

Discusión de resultados Conclusiones Anexos Bibliografía

Pruebas Cualitativas para la Identificación de Lípidos Práctica No. 12 I.

Realizó: Revisó: Autorizó: Fecha de Realización: Fecha de Entrega: Introducción

Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos, de naturaleza antipática, es decir que contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte de los lípidos abundantes en la naturaleza (triacilgliceroles), están formados por ácidos grasos de cadenas hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los lípidos llevan a cabo múltiples funciones en el organismo, como: almacenamiento de energía, de transporte, cumplir funciones hormonales, actuar como vitaminas, formar parte de las membranas celulares confiriéndoles la propiedad de permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte activo como la bomba de Na+/K+. A diferencia de los carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos, no forman polímeros, son más bien moléculas pequeñas que presentan una fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Algunas de las propiedades de los lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados, desprendimiento de vapores, formación de jabones, entre otros. II. a) b) c) d) e)

Conocimientos previos Estructuras de los lípidos. ¿En qué consiste la reacción de saponificación? ¿Qué es la acroleína y en qué consiste la prueba para acroleína? ¿En qué consiste la prueba de Liberman-Buchard? ¿En qué consiste la prueba del yodo?

III.

Objetivos

Identificar las características de los componentes grasos en aceites vegetales comunes. IV.

Metodología

1) Material y Equipo - Tubos de ensaye - Gradilla - Pipetas graduadas de 10ml o de 5ml - Pinzas para tubos de ensaye - Vaso de precipitado para baño María - Vaso de precipitados para calentar agua destilada - Varilla de agitación - Gotero - Cápsula de porcelana - Mechero bunsen - Tripié - Tela de asbesto - Plato caliente 2) Reactivos y soluciones - Éter - Cloroformo - KHSO4 - H2SO4 - KOH - Glicerina - Aceites vegetales distintos por equipo. - Reactivo de Hübl - Anhídrido acético - Yodo - Cloruro de mercurio - Alcohol etílico al 95% ACEITES Oliva, soya, girasol, canola, coco, almendras, ricino, mantequilla. Traer suficiente para todas las pruebas y para todos los equipos.

3) Requerimientos de seguridad Equipo de seguridad completo (bata de algodón, lentes de seguridad, zapato cerrado y guantes). 4) Disposición de residuos Desechar cada reactivo en el recipiente correcto. 5) Procedimiento Las pruebas de solubilidad, yodo y acroleína se realizarán con todos los aceites que se hayan llevado. PARTE A.PRUEBA DE SOLUBILIDAD 1. Colocar en un tubo de ensayo para cada prueba 1mL de aceite y 1mL a cada uno de los reactivos a probar (agua, cloroformo y éter).Observar la solubilidad en cada caso. PARTE B. PRUEBA DE YODO (dobles enlaces-desaparece color) 1. A los tubos usados para la prueba de solubilidad con éter, agregar 1 gota del reactivo de Hübl, mezclar y esperar 5 min para observar cambios en la coloración. 6. Nota: Para preparar el reactivo de Hübl disolver 2.5g de yodo y 3g de cloruro de mercurio (HgCl2) en 100mL de etanol al 95%. Ajustar la cantidad a preparar a lo que realmente se necesite en la práctica. PARTE C. PRUEBA DE ACROLEÍNA (glicerina) Colocar 1ml de aceite en un tubo de ensayo para cada muestra, agregar 0.5 g de KHSO4 y calentar fuertemente. Observar desprendimiento de vapores blancos e irritantes y olor desagradable (prueba positiva).

PARTE D. PRUEBA DE LIEBERMAN (colesterol-verde) 17. Colocar en un tubo de ensayo para cada muestra 0.5mL de aceite 18. Añadir 1mL de anhídrido acético y agitar. 19. Después agregar 1mL de ácido sulfúrico, agitar suavemente y observar la coloración.

PARTE E. SAPONIFICACIÓN Realizar la saponificación con uno solo de los aceites. 1. Colocar en una capsula de porcelana 6mL de aceite y calentar >80°C. 2. Calentar >80°C en un tubo de ensayo 1.5mL de KOH al 85% y 1mL de glicerol posteriormente adicionarlos a la cápsula de porcelana. Dejar calentando 2 min y dejar enfriar. 3. Al producto obtenido colocar en un tubo de ensayo y agregar 2mL de agua, observe sus propiedades espumantes y compare con el resto del grupo. V.

Resultados.

a. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación de lípidos. Muestra Agua Solubilidad Éter cloroformo P. acroleína P. Lieberman P. yodo P. Saponificación

VI.

Discusión

VII.

Conclusión Anexos Bibliografía

VIII. IX.