Sofía Garzón Lilibeth Palacios Karen Rengifo Angela Sierra Felipe Garzón Juan Celeita

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Departamento de Biología Fisiología Animal

PRESENTADO POR:

Sofía Garzón Lilibeth Palacios Karen Rengifo Angela Sierra Felipe Garzón Juan Celeita

INTRODUCCIÓN Cx35 Glutamato

Club ending: modelo para el estudio de mecanismos básicos eléctricos y químicos

Tomado de Faber & Pereda, (2011)

ENDOCANABINOIDES: mensajero difusible, retrógrado y lipídico. Regulan la fuerza de la sinapsis

Estimula la supresión de la transmisión sináptica por mecanismos presinápticos

Tomado y modifcado de Pereda et al., (2003; 2004)

INTRODUCCIÓN

Hipótesis La activación de CB1R por endocanabinoides genera la depresión de la transmisión sináptica

Montaje experimental

Figura 1 Respuesta de la EPSP después de la aplicación de un baño WIN

Baño de WIN

Ambos componentes de la sinapsis se ven potenciados por la activación de los receptores cannabinoides

Pre- tratamiento con una combinación de antagonistas AM + SR. adición de WIN

Aplicación de AM + SR, comprobar que no tenían efecto

¿La aplicación local de WIN en las inmediaciones de la dendrita en las celulas M puede provocar potenciación de la respuesta sináptica?

Breve activation local del agonista CB1R, es SuficienteMontaje para desencadenar un potenciación mixta Figura 2 experimental

Se aumenta la respuesta sináptica local con WIN

Con la aplicación local se potencia la sinapsis mixta

Este se aplica localmente extracelular, cercano a los Club Endings

Breve activation local del agonista CB1R, es Suficiente para desencadenar un potenciación mixta Figura 2 Inmunohistoquimica

CB1Rs: (ROJO) Marcador de receptor endoccannabinoide

Los CBR’s no se encuentran en la célula-M pero están cerca a los Club Endings

Cx35: (VERDE) Marcador de los Gap junctions

¿La potenciación generada por la aplicación de WIN es mediada por la liberación de dopamina en las varicosidades cercanas?

La dopamina podría en la La dopamina interviene intervenir en la potenciación potenciación de la de transmisión la transmisión sináptica sináptica provocada por WIN en las Club endings

Figura 3

Hay cercanía entre las varicosidades y las Club Endings

Misma vía

Vía distinta

SCH-23390 es un Antagonista de D1/5

PKI es un inhibidor de PKA

La liberación de los endocanabinoides debe estar en las proximidades de las club endings

Figura 4

4

Los mGlurR están asociados la liberación de endocannabinoides

Polyclonal anti-mGluR1

Receptores metabotrópicosde glutamato mGluR1 se encuentran en Club endings y extra-sinápticamente

Figura 4 Agonista de mGluR

Liberación de Endocannabinoides Requiere la activación de mGluR y de despolarización para que se de la potenciación

Despolarización

¿Los patrones de estimulación del VIII nervio posterior podría desencadenar una potenciación a largo plazo de la respuesta sináptica ?

Actividad repetitiva de 100 Hz promueve la liberación de endocannabinoides

100 Hz Durante 1s×5

THL Inhibidor de DGL

Liberación de endocannabinoides se da en la dendrita lateral resultado de la actividad de Club Endings

Respuesta Elétrica es 4-5 > que la glutamatergica

Antagonistas AM y SR de CBR1

SCH antagonista de D1/5

¿Es posible que la liberación de dopamina se incremente como resultado de la supresión de la liberación de GABA desde terminales inhibidores cercanos?

Des-Inhibición de la sinapsis de GABA

Figura 6

Bicuculina Antagonista de GABA

No hay cambios signifcativos en la amplitud de los componentes del EPSP mixto

Determinación de la colocalización de CB1Rs y varicosidades dopaminergicas en la dendrita lateral de la célula M

Figura 7 Inmunomarcaje doble con Anti-CB1-CT y TH (Anti-Tyrosina Hydroxylasa)

Se encontró sobrelapamiento

La distribución obsevarda sugiere que se podría promover la liberación de dopamina al activarse CB1R

¿Cx35 puede estar siendo fosforilada en las club endings por la activación de

PKA?

Western blots (Polyclonal anti-Cx35/p110)

Figura 8

Digestión alcalina de fosfatasa Perdida de marcaje

AntiCx35/36 AntiCx35/P110

La PKA fosforila las conexinas (Cx35) marcadas en los Club Endings

CONCLUSIONES

Modelo de potenciación mediada por endocanabinoides

GRACIAAAS

Receptores de Endocanabinoides

Receptores de Tipo I, acoplados a proteina G Localizados en sistema nervioso central y periferico

Gap Junctions Conexinas

Inmunohistoquímica

Técnica mediante la cual se detecta la presencia de un péptido o protéina en una célula o tejido, utilizando un anticuerpo (monoclonal ó policlonal, IgG ó IgM) específco contra él. Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral.

Inmunoreactividad

Michael J. Bevan Nature Reviews Immunology  4, 595-602 (2004)

Western blot Método para identifcar proteínas 1. las proteínas son separadas mediante electroforesis en geles que tiene en cuenta propiedades como peso molecular, estructura, hidrofobicidad 2. posteriormente se transferen a una membrana, mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel. Una vez completada esta operación la proteínas de interés son reveladas por el agregado de un anticuerpo específco, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por la actividad enzimática o fluorescencia

Electrofsiología

Estílulo tetánico: estimolación del octavo nervio con 6 pulsos a 500Hz aplicado cada 2 segundos durante 4 minutos Despolarizaciones dendriticas: 5 pulsos de 90nA cada uno duró 5 s aplicados cada 4 s por el electrodo de registro, se espera que esta corriente lleve el potencial de membrana a 0mV

Canales ionotrópicos de Glutamato

Cascada de señalización cAMP

ANTECEDENTES