1 Fisiología Y Fisiopatología De Los Anticoagulantes Naturales.pdf

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

Centro Emofilia e Trombosi «A. Bianchi Bonomi», Universita degli Studi di Milano e ERCCS Ospedale Maggiore Policlinico. Via Pace, 9, 20122 Milán, Italia

1 Introducción Como sucede con otros sistemas enzirnáticos, la respuesta procoagulante está modulada por múltiples mecanismos reguladores. Así, mientras que algunos de estos mecanismos se corresponden con los sistemas generales de control de las reacciones enzimáticas (mecanismos de retroalimentación positiva y negativa, amplificación, disminución), se han investigado y descrito mecanismos reguladores complejos y específicos, entre los que se encuentran el sistema de la proteína C-proteína S, la antitrombina 111, el co-factor heparínico 11, el inhibidor de la vía del factor tisular y otros componentes de la vía fibrinolítica. Solamente se ha demostrado una íntima asociación entre las trombosis espontáneas, que se desarrollan a una edad temprana, y las alteraciones del sistema de la proteína Cproteína S y antitrombina 111; sin embargo, se han descrito casos esporádicos de deficiencia de los otros anticoagulantes indicados en enfermos con diátesis trombótica. La deficiencia de proteína C,- proteína S y antitrombina 111 no basta para desencadenar el fenómeno trombótico, como lo demuestra el hecho de que algunos sujetos con estas deficiencias se encuentran asintomáticos; sin embargo, representan un factor de riesgo de trombosis, cuya manifestación es la consecuencia final de un proceso multifactorial. En este capítulo se describe brevemente la fisiología del sistema de la proteína C-proteína S y de la antitrombina 111, subrayando de manera especial la relación entre estructura y función de los distintos componentes de los dos sistemas.

2 Antitrombina 111

2.1 Características generales La antitrombina 111 es el principal inhibidor plasmático de la trombina humana (1). Posee actividad inhibitoria frente a los factores IXa, Xa y XIa, además de la tripsina. Se trata de una glucoproteína de cadena única con un peso molecular de 58,2 kd; la glucosilación afecta fundamental-

2

E. M. Faioni

mente a los 4 residuos Asn. La mayor parte se sintetiza en el hígado (aunque también en el riñón); la proteína madura contiene 432 aminoácidos. La concentración plasmática es de 2,3 pm (125 yglml). La AT 111 forma parte de una superfamilia de proteínas conocidas como «inhibidores de las proteasas de serina» o aserpinasn (2) entre las que se encuentran la al-antitripsina, la ovoalbúmina, el angiotensinógeno, el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y el inhibidor de la proteína C activada (PAI-3). Posiblemente, estas proteínas tienen un origen evolutivo común y se piensa que derivan de una molécula ancestral de hace aproximadamente 300-600 millones de años. Los miembros de la familia de las serpinas con actividad inhibitoria poseen un mecanismo similar de inhibición en dos etapas. En la primera etapa se forma un complejo débil entre el inhibidor (que actúa como «falso» sustrato y la proteasa). Después, se establece un enlace covalente entre el sitio reactivo del inhibidor y el residuo serínico del sitio activo de la proteasa. La especificidad de la serpina depende, en parte, de los residuos situado en los lugares reactivos, que se denominan P, y P,'. Numerosas serinas contienen Arg como residuo P,, incluida la AT 111, que contiene una Ser en posición P,'. Cuando la AT 111 inhibe la trombina, se forma inicialmente un complejo de baja afinidad con una estequiometría 1:1 y una semivida prolongada de inhibición; la trombina escinde el enlace Arg-393 --Ser394 de la AT 111. Por consiguiente, se produce una modificación en la conformación del inhibidor que atrapa la enzima, estableciéndose un enlace covalente y estable (1).

SITIO REACTIVO Fig. 1. Esquema de la estructura de la antitrombina 111. Se muestran los residuos P, y P,' en las posiciones 393 y 394, respectivamente, y las probables regiones de unión a la heparina (modificado de: The Molecular Basis of Blood Diseases (1987). Eds. J. Starnatoyannopoulos, A.W. Nienhuis, P. Leder, P.W.Majerus, pág. 534, W.B. SAUNDERS Co., Filadelfia).

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

3

Existe una notable analogía en la estructura cercana al sitio reactivo de los diferentes miembros de las serpinas; se trata de una estructura prominente y móvil en el plano tridimensional (1, 2). En cambio, en las demás zonas de la molécula se aprecian diferencias considerables, que guardan relación con la función específica de las diferentes serpinas. Así, la AT 111 tiene una zona que actúa como lugar de unión a la heparina (región de unión a la heparina). De acuerdo con estudios recientes, basados en mutantes recombinantes, la región mínima esencial para la unión a la heparina se sitúa entre los residuos 90 y 160 (en esta región se encuentran residuos con carga positiva como Arg y Lys) mientras que la zona situada hacia el extremo aminoterminal (residuos 41-49) posiblemente modula la interacción, pero no puede, por sí misma, mantener el enlace (2). Estas dos regiones de la conformación tridimensional de AT 111 se encuentran adyacentes y configuran la región de unión a la heparina. En la figura 1 se muestra un esquema de AT 111, en donde se representan las principales regiones de la proteína, el sitio reactivo y la región de unión a la heparina. 2.2 Importancia de la heparina

La formación del complejo trombina-ATIII se multiplica, al menos, por un factor de 1000 en presencia de la heparina, que reduce considerablemente la semivida de inhibición (1, 2). La heparina actúa de forma catalítica y su efecto como co-factor se manifiesta también en la inhibición de los factores Xa y XIa, pero no por las proteasas del sistema de contacto. Se ha comprobado que el fragmento de heparina más pequeño con actividad de co-factor frente al factor Xa es un pentasacárido que contiene determinados grupos sulfato (3-O-glucosaminasalfato)que interaccionan con los residuos de lisina y arginina de la región de unión a la heparina de AT 111 (3). Esta interacción provoca una alteración en la conformación del sitio reactivo de la AT III que favorece la reacción inhibitoria. El fragmento más pequeño de heparina con actividad antitrombínica es un octadecasacárido; la heparina debe unirse tanto a AT 111 como a la trombina (1). La actividad anti-Xa y antitrombínica de la heparina depende de la concentración de calcio iónico y, entre otros factores, de la longitud de la cadena heparínica. Como la heparina no tiene una disponibilidad in vivo como tal molécula, al principio se dudaba si su efecto como co-factor de la AT 111, observado en condiciones in vitro, poseía realmente significado fisiológico. Las investigaciones efectuadas por distintos laboratorios (4, 5 ) han revelado que una sustancia parecida a la heparina, el sulfato de heparán, es expresada por las células endoteliales y acelera la inhibición in vivo de las proteasas de la coagulación mediada por AT 111. El sulfato de heparán también contiene un residuo 3-O-glucosaminasulfato, característico del pentasacárido heparínico responsable de la unión a AT III.

E. M.Faioni

2.3 Biología molecular A finales de los años 60 se observó una íntima asociación entre la deficiencia congénita de AT 111 y la trombosis. Prácticamente el 2-5% de los pacientes con trombosis juvenil mostraban una deficiencia de AT 111; la prevalencia del déficit en la población general es de 1:2.000 a 1:5.000, según los diferentes estudios, si bien en las investigaciones más recientes se ha observado una prevalencia mayor (6, 7). Las deficiencias pueden ser de tipo cualitativo o cuantitativo. Se han realizado numerosas tentativas de clasificación de estas deficiencias, de acuerdo con los datos fenotípicos. La clonación del cDNA y la determinación de la estructura génica y proteica de la AT 111, junto con los estudios sobre la disfunción de AT 111 en los enfermos, ha permitido que se conozca mejor la relación entre estructura y función de la proteína. Además, el conocimiento de la bases moleculares de la deficiencia de AT 111 puede modificar, al menos en parte, la clasificación, que debe basarse en los defectos genéticos observados mediante la técnica de biología molecular, en lugar de las características fenotípicas. El gen de la AT 111 se encuentra en el cromosoma 1 (q) y contiene 7 exones y 6 intrones, distribuidos entre las 19 kilobases del DNA. Se observa una cierta tendencia en el gen de la AT 111, como ocurre con otros genes, a que los intrones se sitúen entre los confines de diversos dominios estructurales de la proteína. Hasta la fecha, en los estudios de la deficiencia de AT 111 se han hallado mutaciones en el sitio reactivo y en el dominio de unión a la heparina (7, 8). Aplicando diferentes metodologías, se han descrito detalladamente las mutaciones que conducen a la sustitución de un solo arninoácido en el residuo P, del sitio reactivo, como por ejemplo Arg-393 + Cys, His, Pro o bien del residuo P,' como por ejemplo Ser-394 + Leu o incluso mutacionei puntiformes de codones altamente conservados de otras regiones del gen (7, 8). Los estudios relativos a las mutaciones del dominio de unión a la heparina que se asocian a un déficit fenotípico con una baja prevalencia de trombosis en la forma heterocigótica, son muy interesantes (7, 8). Se han descrito mutaciones del residuo Arg-47 y Pro-41 que se asocian a una menor unión a la heparina, lo que confirma la importancia de estos aminoácidos en la formación del complejo con la heparina. Recientemente se han investigado también otras dos mutaciones de residuos que se hallan en la región de unión a la heparina (9). La base molecular de las deficiencias de AT 111 se comenta con más detalles en otro capítulo de esta obra.

3 Sistema de la proteína C-proteína S El «sistema de la proteína C-proteína S», denominado así por razones de comodidad en este capítulo, es un complejo de proteínas con actividad enzimática o de co-factor que inhibe a los principales co-factores de la

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

5

vía procoagulante, VIIIa y Va, limitando la actividad coagulante del complejo activador del factor X y del complejo activador del factor 11, respectivamente. Este sistema está formado por un cimógeno, la proteína C, un co-factor soluble, la proteína S y una proteína de membrana, la trombomodulina, que posee un receptor endotelial para la trombina (10, 11). La proteína de unión a C4b, una proteína reguladora del complemento, debe considerarse parte del sistema por su interacción con la proteína S. La figura 2 ilustra de manera esquemática las interacciones entre los distintos componentes, cuyas características bioquímicas y moleculares se expondrán con mayor detalle en los siguientes párrafos.

Membrana celular

Fig. 2. Esquema del sistema de la proteína C-proteína S. La trombina (T) se une a la trombomodulina (TM), con lo que se activa la proteína C (PC); durante la activación se desprende un pequeño ptptido de la cadena pesada. La protelna C activada (APC) ejerce su efecto anticoagulante formando un complejo con el co-factor proteína S (PS). C4b-BP, representada como una estructura aracnoidea, se halla en equilibrio dinfímico con la proteína S y regula su función como co-factor. (La figura no pretende representar las proporciones ni las dimensiones reales de las distintas proteínas).

3.1 Proteína C La proteína C (PC) es una glucoproteína de 62 kd, con una concentración plasmática de 50-80 nM (3-5 pglml). Se activa fisiológicamente tras la

6

E. M. Faioni

unión de la trombina a la trombomodulina (en la superficie endotelial), en presencia de calcio. La trombina escinde el enlace Arg-169-Leu-170 de la proteína C. Una vez activada, la APC determina una proteólisis de los factores VIIIa y Va en la membrana biológica (12). La figura 3 muestra un esquema de la estructura de la proteína C. La PC se compone de 444 aminoácidos, de los cuales 42 componen la secuencia denominada pre-proleader. Esta secuencia aminoterminal se separa antes de que se segregue la molécula madura. De acuerdo con algunos estudios recientes, el péptido pre-leader está formado por 18 aminoácidos y es sumamente hidrófobo. Su función se relaciona con la secreción correcta de la PC madura. Este péptido se separa cuando se recibe una «señal dipeptidasa» durante la síntesis del polipéptido (13). El polipéptido compuesto por 24 aminoácidos contiene residuos sumamente conservados en las distintas proteínas de la coagulación: los residuos situados entre -12 y -17 son esenciales para la y-carboxilación de los primeros 9 residuos de ácido glutámico de la PC (v. más arriba). Los residuos -1 a -4 son, en cambio, muy importantes para la escisión de la secuencia pro-leader por parte de una proteasa parecida a la tripsina. La PC circula fundamentalmente como una proteína de cadena doble (la cadena ligera tiene un peso molecular de 21 kd y la pesada de 41 kd,

PÉPTIDO DE AC

SECUENCIA PRE-PROLEADER

Fig. 3. Estructura simplificada de la proteína C; se representa el dominio GLA de la cadena ligera (línea oscura), la posición del beta-hidroxi-aspartato y los dominios EGF. Se observan los tres residuos fundamentales de la tríada catalítica (sitio activo) en la cadena pesada (línea sombreada) y la posición en donde la trombina escinde el péptido de activación, activando así a la proteína C.

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

7

hallándose unidos por un puente disulfuro); durante la activación por la trombina, se despega un péptido de activación de 12 aminoácidos del extremo aminoterminal de la cadena pesada (1 1). La proteína C sufre una serie de modificaciones dentro y fuera del ribosoma hepático: a) separación de la secuencia pre-proleader, tal como se ha indicado; b) hidroxilación en posición B del ácido aspártico 71; c) carboxilación en posición y de los primeros 9 residuos de ácido glutámico de la región aminotermina1 de PC (dominio gla); d) separación proteolítica del dipkptido de conexión de las cadenas pesada y ligera; e) N-glucosilación en diferentes posiciones de la molécula (secuencia Thre/Ser y Asn). La base molecular de estas modificaciones, como las de otras proteínas de la coagulación, sólo se conoce en parte. La hidroxilación del ácido aspártico de PC y de otros factores de la coagulación se ha relacionado con una unión al calcio de alta afinidad, independiente del dominio gla, que es fundamental para la conformación correcta de la molécula durante su activación y efecto catalítico (14). En cambio, se conocen mejor las bases moleculares de la carboxilación en posición y de los residuos del ácido glutámico: se trata de una modificación ribosómica que afecta también a otras proteínas de la coagulación (factores 11, VII, IX, X, proteína C, proteína S) y de la matriz osteoide, antes de su secreción (13, 15). Desde el punto de vista funcional, estas alteraciones otorgan a la proteína la capacidad de unión al calcio iónico y, a su vez, a las membranas biológicas con carga negativa. Cuando la célula (plaqueta, endotelio, monocito) se activa, emerge en su superficie la fosfatidilserina, un fosfolípido de carga negativa. De esta manera, la reacción de la coagulación se concentra en un área limitada y en una zona catalíticamente más eficiente, por la presencia de los co-factores de la membrana en lugar de la fase fluida. Las regiones arninoterminales que contienen los residuos y-carboxilados de denominan dominios gla. La y-carboxilación ocurre en el retículo endoplásmico del hepatocito a través de una proteína de la membrana, la carboxilasa, que requiere como co-factor la vitamina K; la reacción ocurre en presencia del oxígeno molecular y del anhídrido carbónico. Durante la carboxilación se oxida la vitamina K y una de las enzimas que la transforman en su forma reducida y sensible ai anticoagulante oral warfarina. Las bases moleculares de la y-carboxilación se han investigado profundamente utilizando mutantes con direcciones conocidas (15). Las regiones proteicas de la molécula que reconocen parte de la carboxilasa hepática se encuentran en el propéptido y, en concreto, en algunos residuos altamente conservados de las diferentes proteínas. Las características de estas regiones de reconocimiento se indican en la tabla 1. El gen de la PC contiene 9 exones, mide 11 kb y está situado en el cromosoma 2 (q13-q14) (16). La proteína tiene una estructura modular con unos dominios funcionales circunscritos y codificados por un hexón. De acuerdo con algunas teorías, este tipo de organización, común a otras proteínas de la coagulación, tiene un origen evolutivo antiguo: las proteasas de la coagulación se originaron en una molécula común, una

E. M. Faioni Tabla 1. Características del sitio de reconocimiento para la gamma-carboxilación del propéptido de las proteínas dependientes de la vitamina K. (Modificado de la referencia 15). - --

Se encuentra adyacente a los residuos Glu que son los sutratos de la carboxilación Probablemente se une directamente a las carboxilasas dependientes de la vitamina K Los residuos -18, -17, -16, -15 y -10 del propéptido forman parte del sitio Antes de la secreción, se escinde el propéptido de la proteína carboxilada Este sitio es necesario para la garnma-carboxilación pero no se sabe si resulta suficiente Se halla contenido totalmente dentro del propéptido y no posee componentes del dominio gla.

proteasa elemental parecida a la tripsina, compuesta por un péptido indicador de la secreción, un péptido de activación y una región proteásica verdadera y propia (17). A lo largo de la evolución, las inserciones aieatorias, las duplicaciones génicas y los entrecruzamientos se asociaron a la inserción de módulos discretos (auténticas «miniproteínas» funcionales) en los genes de las proteasas. Estos «módulos» constituyen, por ejemplo, el dominio gla, el dominio análogo al precursor de los factores de crecimiento epidérmico (de tipo EGF), los dominios kringle y finger (estos últimos se hallan presentes en la protrombina y factores de la fibrinólisis). Este tipo de cambios ocurrieron aparentemente antes de la separación evolutiva de los mamíferos y de las aves, posiblemente al mismo tiempo en que aparecieron los primeros vertebrados. Se ha llegado incluso a proponer, de acuerdo con investigaciones genéticas, que estos «módulos» han sido vehiculados a través de virus. La deficiencia congénita de la proteína C ocurre en un 5-8% de los enfermos con trombosis juvenil y en 1:16.000 de la población general (6). Se han examinado las bases moleculares de la deficiencia de proteína C. Además de conocer mejor la relación estructura-función de la proteína C y del gen correspondiente, los estudios moleculares realizados en este caso tenían por finalidad dirimir un tema espinoso: aunque en muchos casos, se aprecia una clara asociación entre el déficit de proteína C y la trombosis, existe por lo menos un estudio (18) que revela una alta prevalencia de heterocigosis para la deficiencia de proteína C entre la población normal asintomática y con antecedentes familiares negativos (prevalencia 1:200-1:300). El estudio molecular permitiría en este caso verificar si la deficiencia es real o se relaciona con un problema de laboratorio o del análisis de los datos; asimismo, se podría establecer una relación entre los diferentes tipos de alteración molecular y la prevalencia mayor o menor de la trombosis. En la actualidad, se conocen muchos datos de esta deficiencia, tanto de tipo cuantitativo como cualitativo (16). Se han descrito mutaciones puntiformes sin sentido y de sentido erróneo así como deleciones e inserciones. Como las técnicas de biología molecular se han sofisticado considerablemente en el último tiempo, cabe prever que se caractericen muchos más defectos y que se pueda efectuar una clasificación genotípica más que fenotípica, de la deficiencia de proteína C.

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

9

3.2 Trombomodulina La trombomodulina (TM) es una proteína de la membrana sintetizada por las células endoteliales (19). Recientemente, se ha detectado también en los megacariocitos y plaquetas, glía y leucocitos polimorfonucleares aunque su significado funcional en estas células no está muy claro (20, 21). La TM muestra una analogía estructural con los receptores de LDL (22). La proteína se compone de 575 aminoácidos y tiene un peso molecular de 60,3 kd. En la región aminoterminal se observa una región hidrófoba, que supuestamente interacciona con la membrana, aunque todavía no se ha demostrado. A continuación aparecen seis módulos de tipo EGF, una región rica en residuos Thr y Ser, donde probablemente ocurre la O-glucosilación, una porción transmembranaria sumamente hidrófoba y una cola citoplásmica de 38 aminoácidos (19) (fig. 4).

DOMINIOS EGF

REGIONES

DOMINIO TRANSMEMBRANARIO

Fig. 4. Estructura de la trombomodulina: la figura muestra las regiones más importantes desde el punto de vista funcional, incluida la región mínima necesaria para activar la proteína C (IV-VI dominio EGF).

E. M. Faioni La unión de la trombina a la TM en la superficie endotelial muestra una elevada afinidad (K,
Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

11

can que la TM también regula la fibrinólisis; de hecho, la TM actúa como co-factor en la proteólisis de un activador del plasminógeno (scu-PA) inducida por la trombina (28). Considerando las alteraciones tisulares y la invasión metastásica atribuidas a scu-PA y la fibrinólisis en general, este efecto indica que la TM también interviene en los mecanismos extracoagulantes.

3.3 Proteína S La proteína S (PS) es una glucoproteína de cadena única compuesta por 635 aminoácidos, con un peso molecular de 69 kd (29). Esta proteína es sintetizada en las células endoteliales, hepatocitos, megacariocitos y células de Leydig del testículo. Posee algunos elementos nodulares en común con la proteína C y con otros factores de la coagulación, pero se diferencia porque la zona proteásica carboxi-terminal es sustituida por una región análoga a la globulina humana que fija las hormonas sexuales. Por consiguiente, la PS no es un cimógeno ni posee actividad proteolítica; únicamente actúa como co-factor unida a la APC. De hecho, se ha comprobado que la PS, que muestra la mayor afinidad por los fosfolípidos de carga negativa (Kd = mol/L) entre las proteínas dependientes de la vitamina K, aumenta la actividad proteolítica de APC, fomentando su unión a la membrana biológica. En la figura 5 se muestra la estructura proteica de la PS. Comenzando por la región aminoterminal, después del dominio gla, se observa un péptido de conexión (aa 37-46), una región sensible a la trombina, 4 módulos análogos a EGF y la SHGB. En la región sensible a la trombina se encuentran dos enlaces que pueden ser escindidos por la trombina. Después de la proteólisis, la afinidad de la PS por el calcio disminuye; cuando la concentración de calcio es menor de 2 mmol/l, la afinidad por las membranas de carga negativa también se reduce y desaparece la capacidad anticoagulante (de co-factor) (29). El residuo arginínico del anillo de la región sensible a la trombina es esencial para el correcto repliegue de la zona del dominio gla. Entre las modificaciones post-ribosómicas, la PS muestra un residuo de ácido aspártico hidroxilado en posición B (Hya) en el primer dominio EGF y tres residuos de asparagina hidroxilados en posición B (Hyn) en los tres sucesivos dominios EGF. Los módulos EGF que contienen Hyn muestran una afinidad por el calcio 1.000 veces superior a los dominios EGF de las otras proteínas. A diferencia de la PS, las demás proteínas contienen módulos EGF con Hyn, incluida la trombomodulina y los receptores de LDL. Los estudios realizados con anticuerpos monoclonales, con una especificidad diferente para la PS, han revelado que la región sensible a la trombina y el primer dominio EGF, representan la región de unión a la APC (30). El lugar de unión para C4b-BP se sitúa, en cambio, en dos regiones: los residuos 420-434 y los residuos 605-614 del anillo de la región SHBG que tiene una significación estructural y no intervienen directamente en la unión.

12

E. M. Faioni

REGIÓN DE LA HORMONA FIJADORA DE LAS HORMONAS ESTEROIDEAS

DOMINIOS EGF

REGIÓN SENSIBLE A LA TROMBINA

R E G I ~ NDE UNIÓN A APC

1

DOMINIO GLA

Fig. 5. Estructura de la proteína S: se muestran las regiones conocidas, incluido el lugar de proteólisis en el que actúa la trombina, el dominio gla, la presunta región de unión a la proteína C activada (APC), los 4 dominios EGF y la zona carboxiterminal análoga a la proteína fijadora de las hormonas esteroideas.

El gen de la PS (gen a) se encuentra en el cromosoma 5 junto a un pseudogen (gen B), que no es traducido. Posee 15 exones y 14 intrones y mide en total 80 kb. La estructura de los dominios de la PS se corresponde con la organización hexónicaJintrónica del gen y respalda la hipótesis de que el gen de PS es un producto del «ensamblaje» evolutivo, en donde los módulos que codifican las unidades funcionales/estructurales, que se encuentran también en otras proteínas de la coagulación, se intercalan sobre un gen ancestral de una proteína fijadora de las hormonas esteroideas. Los primeros 8 exones codifican la región análoga a las otras proteínas dependientes de la vitamina K, mientras que los exones IX a XV codifican la porción SHBG (31, 32). - Los déficit congénitos de la proteína S se asocian a trombosis prematuras a munudo recidivantes y familiares, que representan un 5% de todas las trombosis juveniles (6). La clasificación fenotípica de la deficiencia ha provocado numerosos problemas por la complejidad de la regulación y de la unión de la proteína S que impiden una determinación

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

13

precisa de la misma ya sea por medios inmunológicos o determinando su actividad como co-factor unido a la APC. Las técnicas moleculares son también complejas, sobre todo por la presencia del pseudogen. En consecuencia, queda todavía mucho tiempo para poder proceder a la clasificación genotípica de los dCficit de la AT 111 o de la PC. En cualquier caso, se han descrito mutaciones puntiformes y deleciones parciales en 5 de 9 familias con deficiencia heterocigótica de proteína S y en una familia con deficiencia homocigótica de proteína S (33). Las otras mutaciones descritas del gen a o B no se han asociado a trombosis.

3.4 Proteína de unión a C4b La proteína de unión a C4b (C4b-BP) tiene una estructura aracnoidea con 7 brazos largos, cada uno con 70 kd de peso molecular y un octavo brazo corto de 45 kd de peso molecular, al que se une la proteína S (29). Los brazos largos están formados por la cadena a y el corto por la cadena B (figura 6). La estructura primaria de la cadena a de la C4b-BP humana

SCR

Fig. 6. Proteína de unión a C4b: el brazo corto del inhibidor se une a la proteína S, mientras que los otros brazos lo hacen a C4b. Se muestra también SAP (v. texto), cuya zona de unión se desconoce. SCR = short consensus repeats. (Figura modificada de la ref. 29).

14

E. M. Faioni

se ha reconocido, tanto por su secuencia de aminoácidos como tras la clonación del cDNA (29). Se compone de 549 aminoácidos y contiene 8 secuencias repetidas de 69 aminoácidos, cada una, denominadas SCR (short consensus repeat). Cada cadena a contiene un lugar de unión para la forma activada de la proteína del complemento C4, es decir, C4b. Otras proteínas, entre ellas el factor XIII y las tres seletinas GMP-140, ELAM-1 y MEL-14 contienen una o varias secuencias SCR. La función de las secuencias SCR en estas proteínas se desconoce, pero se cree que constituye una región de unión a C4b en la molécula C4b-BP. El gen de C4b-BP se encuentra en el brazo largo del cromosoma 1, próximo a los genes de otras proteínas reguladoras del complemento en una región que representa un «cluster» génico denominado RCA (regulador de la activación del complemento). La cadena B se une a través de un puente disulfuro a la región central de C4b-BP. Su estructura primaria también se conoce a través de estudios de secuencia y clonación de cDNA. La cadena contiene 235 aminoácidos y tres zonas SCR en el extremo aminoterminal. El gen también se encuentra en el cluster RCA, íntimamente asociado al de la cadena a, que se piensa que es una duplicación evolutiva del anterior. La cadena B está glicosilada en varios puntos y contiene hidratos de carbono complejos. Durante la biosíntesis de C4b-BP se ensamblan 7 cadenas alfa y una cadena B para formar una molécula de C4b-BP. Los mecanismos que regulan este proceso se desconocen al igual que los factores que regulan la proporción de las cadenas a y 13. Aproximadamente el 30% de la C4bBP plasmática tiene un peso molecular ligeramente menor (C4b-BP low) que la molécula predominante (C4b-BP high). Las dos muestran la misma capacidad de unión que C4b. C4b-BP se compone de dos fracciones moleculares: aproximadamente el 50% contiene la cadena B, que se une a la proteína S y probablemente está formada por 6 y no por 7 cadenas a. El resto de C4b-BP low no contiene la cadena 13 ni se une a la proteína S. Esta fracción molecular probablemente contiene 7 cadenas a. Estos resultados sugieren que la cadena B es necesaria para la unión a la proteína S pero no para la polimerización de la cadena a durante el ensamblaje de la molécula (29). El complejo temario C4b-BP, proteína S y C4b del plasma es, en realidad, un complejo cuatemario, ya que se añade un cuarto componente, la sustancia mieloide P (SAP). Se trata de una proteína multimérica compuesta por 5 subunidades idénticas de 25 kd que se une a través de enlaces Iio covalentes (34). Es análoga a la proteína C reactiva, pero la concentración plasmática de SAP no aumenta durante las reacciones de la fase aguda. La SAP se une, en presencia del calcio, a C4b-BP con una relación estequiométrica de 1:1 con una gran afinidad. El sitio de unión a la proteína S y a SAP de C4b-BP es totalmente independiente, así como el de SAP y C4b. El complejo cuaternario se une a la membrana en presencia del calcio; el dominio gla de la proteína S es fundamental para esta interacción. Es posible que la proteína S sirva para que C4b-BP se

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

15

una a los mismos tipos de fosfolípidos que emergen a la superficie en las reacciones de la coagulación. La activación del complemento conlleva diversas reacciones inflamatorias locales, que en parte obedecen a la liberación de anafilotoxinas y a la quimiotaxis leucocitaria. Según algunos autores, la inhibición del complemento en las superficies, en donde ocurre la coagulación, puede resultar beneficiosa ya que la presencia de reacción inflamatoria en el mismo lugar de la coagulación puede provocar una pérdida del control de ésta (29). Los mecanismos que regulan el equilibrio in vivo entre la proteína S y C4b-BP se ignoran. De acuerdo con la constante de afinidad calculada en presencia del calcio, prácticamente toda la proteína S del plasma forma complejo con C4b-BP (35). Por consiguiente, es necesario que exista otro factor regulador que, en presencia de concentraciones normales de C4b-BP y de la proteína S, desplace el equilibrio de modo tal que aproximadamente un 40% de la proteína S circule en el plasma sin formar complejo y pueda actuar como co-factor de APC. Evidentemente, según indica la ley de acción de masas, cuando varía la concentración de PS o de C4b-BP, el equilibrio se restablece de modo inverso, como en el caso de la reacción inflamatoria aguda, en donde los niveles de C4b-BP se elevan con la consiguiente disminución de la proteína S libre. 4 Conclusiones Los breves conceptos de fisiología ilustrados en este capítulo permiten extraer algunas conclusiones inmediatas sobre la patogenia como por ejemplo el hecho de que la mayor parte de los anticoagulantes naturales descritos son sintetizados y procesados en el hígado. Por consiguiente, en las hepatopatias primarias o secundarias se producen alteraciones patológicas de la antitrombina 111, proteína C y proteína S. Asimismo, el daño endotelial (entendido en el sentido moderno de «perturbación») altera la expresión de los co-factores de las principales vías anticoagulantes como la trombomodulina y la proteína S. Conviene señalar también otros aspectos. Por ejemplo, la biología molecular ha adquirido en el momento actual una enorme importancia y se han efectuado grandes adelantos en el estudio de los genes y de las relaciones estructura-función de los anticoagulantes naturales. Estas técnicas conllevan una doble ventaja: por un lado, permiten conocer mejor la fisiología de estas moléculas y su interacción y, por otro, permitirán desarrollar en el futuro moléculas recombinantes can un objetivo terapéutico preciso que puede adivinarse ya con el uso de los concentrados purificados de antitrombina III y proteína C. Los datos recientes sobre la interacción íntima entre los mecanismos hemostáticos y la inflamación son muy interesantes. En este contexto, los anticoagulantes naturales desempeñan un papel de gran relieve. Se ha comprobado que las proteínas, integradas clásicamente en el sistema de complemento, modulan la vía anticoagulante y que las proteasas y citocinas

16

E. M. Faioni

leucocitarias regulan la expresión de co-factores como la trombomodulina. Estas interacciones se han demostrado no sólo durante ensayos in vitro, sino también in vivo en animales o ex vivo en la especie humana y constituyen la base de algunas hipótesis patogénicas acerca de los fenómenos trombóticos (o microtrombóticos) que se observan en patologías complejas como, por ejemplo, el shock séptico por bacterias gram-negativas o el síndrome venoclusivo hepático secundario al trasplante de médula. Estos últimos hechos, entre los que se incluye también el estudio de las interacciones entre los anticoagulantes naturales y los componentes celulares vasculares y hemáticos, se hallan en pleno desarrollo y permitirán conocer mejor la respuesta hemostática integral con las consiguientes ventajas terapéuticas.

Bibliografía 1. Lane DA, Caso R (1989) Antithrombin: structure, genomic organization, function and inherited deficiency. In: E.G.D. Tuddenham (Guest Editor), The molecular biology of coagulation, Baillikre's Clinical Haematology, vol. 2 (4), Baillikre Tindall, London 2. Huber R , Carrell RW (1989) Implications of the three-dimensional structure of a,-antitrypsin for the structure and function of serpins. Biochemistry 28:8951-54 3. Lindahl U, Backstrom G , Thunberg L, Leder IG (1980) Evidence for a 3-0-sulfated D-glucosamine residue in the antithrombin-binding sequence of heparin. Proc Natl Acad Sci USA 77:6551-55 4. Marcum JA, McKenney JB, Rosenberg RD (1984) Acceleration of thrombinantithrombin complex formation in rat hind-quarters via heparin-like molecules bound to the endothelium. J Clin Invest 74:341-350 5. Marcum JA, Atha DH, Fritze LMS. Nawroth P, Stern D , Rosenberg R D (1986) Cloned bovine aortic endothelial cells synthesize anticoagulantly active heparan sulphate proteoglycans. J Biol Chem 261:7507-17 6. Mannucci PM, Tripodi A (1987) Laboratory screening of inherited thrombotic syndromes. Thromb Haemost 57:247-51 7. Blajchman MA, Austin RC, Fernández-Rachubinski F, Sheffield WP (1992) Molecular basis of inherited human antithrombin deficiency. Blood 80:2159-71 8. Lane DA, Ireland H , Olds RJ, Thein SL, Perry DJ, Aiach M (1991) Antithrombin 111: A database of mutations. Thromb Haemost 66:657-61 9. Gandrille S, Aiach M, Lane DA, Vidaud D , Molho-Sabatier P, Caso R, de Moerloose P, Fiessinger J-N, Clauser E (1990) Important role of arginine 129 in heparin-binding site of antithrombin 111. J Biol Chem 265:18997-19901 10. Esmon CT (1992) The protein C anticoagulant pathway. Art Thromb 12:135-145 11. Walker FJ, Fay PJ (1992) Regulation of blood coagulation by the protein C system. FASEB J 6:2561-67 12. Fulcher CA, Gardiner JE, Griffin JH, Zimmerman TS (1984) Proteolytic inactivation of human factor VI11 procoagulant protein by activated protein C and its analogy with factor V. Blood 63:486-89 13. Foster DC, Rudinski MS, Schach BG, Berkner KL, Kumar AA, Hagen FS, Sprecher CA, Insley MY, Davie EW (1987) Propeptide of human protein C is necessary for y-carboxylation. Biochemistry 26:7003-11 14. Ohlin A-K, Landes G , Bourdon P, Oppenheimer C, Wydro R , Stenflo J (1988) P-Hydroxyaspartic acid in the first epidermal growth factor-like domain of protein C. J Biol Chem 263:19240-48 15. Furie B, Furie BC (1990) Molecular basis of vitamin K-dependent y-carboxylation. Blood 75:1753-62

Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales

17

16. Reitsma PH, Poort SR, Bernardi F, Gandrille S, Long GL, Sala N, Cooper DN (1993) Protein C deficiency: a database of mutations. Thromb Haemost 6937-84 17. Patthy L (1985) Evolution of the proteascs of blood coagulation and fibrinolysis by assembly from modules. Cell41:657-63 18. Miletich J , Sherman L, Broze G Jr (1987) Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med 317:991-96 19. Esmon NL (1987) Thrombomodulin. Semin Thromb Hemost 13:454-63 20. Suzuki K, Nishioka J, Hayashi T, Kosaka Y (1988) Functionally active thrombomodulin is present in human platelets. J Biochem 104:628-32 21. Conway EM, Nowakowski B, Steiner-Mosonyi M (1992) Human neutrophils synthetize thrombomodulin that does not promote thrombin-dependent protein C activation. Blood 80:1254-63 22. Jackman RW, Beeler DL, VanDeWater L, Rosenberg R D (1986) Characterization of a thrombomodulin cDNA reveals structural similarity to the low density lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA 83:8834-38 23. Jackman RW, Beeler DL, Fritze L. Soff G, Rosenberg RD (1987) Human thrombomodulin gene is intron depleted: Nucleic acid sequences of the cDNA and gene predict structure and suggest sites of regulatory control. Proc Natl Acad Sci USA 84:6425-29 24. Stearns DJ, Kurosawa S, Esmon CT (1989) . . Microthrombomodulin. J Biol Chem 264:3352-56 25. Suzuki K, Hayashi T, Nishioka J, Kosaka Y, Zushi M, Honda G, Yamamoto S (1989) A domain composed of epidermal growth factor-like structures of human thrombomodulin is essential for thrombin binding and for protein C activation. J Biol Chem 264:4872-76 26. Takano S, Kimura S, Ohdama S, Aoki N (1990) Plasma thrombomodulin in health and diseases. Blood 76:2024-29 27. van der Velden PA, Krommenhoek-Van Es T, Allaart CF, Bertina RM, Reitsma PH (1991) A frequent thrombomodulin amino acid dimorphism is not associated with thrombophilia. Thromb Haemost 65511-13 28. Molinari A, Giorgetti C, Lansen J, Vaghi F, Orsini G, Faioni EM, Mannucci PM (1992) Thrombomodulin is a cofactor for thrombin degradation of recombinant single-chain urokinase plasminogen activator «in vitro» and in a perfused rabbit heart model. Thromb Haemost 67: 226-232 29. Dahlback B (1991) Protein S and C4b-Binding Protein: Components involved in the regulation of the protein C anticoagulant system. Thromb Haemost 66:49-61 30. Dahlback B, Hildebrand B, Malm J (1990) Characterization of functionally important domains in human vitamin K-dependent protein S using monoclonal antibodies. J Biol Chem 265:8127-35 31. Ploos van Amstel HK, Reitsma PH, van der Logt CPE, Bertona RM (1990) Intronexon organization of the active human protein S gene PSa and its pseudogene PSP: duplication and silencing during primate evolution. Biochemistry 29:7853-61 32. Edenbrandt C-M, Lundwall A, Wydro R, Stenflo J (1990) Molecular analysis of the gene for vitamin K dependent protein S and its pseudogene. Cloning and partia1 gene organization. Biochemistry 29:7861-68 33. Schmidel DK, Nelson RM, Broxson EH, Comp PC, Marlar RA, Long GL (1991) A 5.3-kb deletion including exon XIII of the protein S a gene occurs in two protein S-deficient families. Blood 77:551-59 34. Schwalbe RA, Dahlback, Nelsestuen GL (1990) Independent association of serum'amyloid P component, protein S, and complement C4b with complement C4b-binding protein and subsequent association of the complex with membranes. J Biol Chem 265:21749-57 35. Dahlback B, Frohm B, Nelsestuen G: (1990) High affinity interaction between C4b-binding protein and vitamin K-dependent protein S in the presence of calcium. J Biol Chem 265:16082-87