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Clonación de DNA Introducción La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente importante) se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes. A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el plásmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta forma hacen copias del ADN que contienen. Fundamento Se base en la obtención del DNA de interés mediante enzimas de restricción específicas o endonucleasas, al existir un corte especifico se obtiene la parte del DNA que posteriormente se unirá aun plásmido mediante enzimas de tipo ligasa. La membrana de una bacteria se ve afectada cuando se genera choques térmicos o pequeñas descargas eléctricas, facilitando así la permeabilidad de la misma, dicho proceso es tomado para introducir este plásmido a una bacteria de interés (vector) que posteriormente mediante su duplicación se obtendrán muchas copias del DNA que nos interesa. Por otra parte, el contenido de un gen resistente un antibiótico en el plásmido es de suma importancia pues brindará al momento de cultivar la

bacteria y exponer al antibiótico una visión de en qué bacterias el DNA que clonamos se encuentra. ¿Cómo se realiza?

Tabla 1. Comparación de las principales metodologías de clonación molecular.

Un experimento clonación molecular tradicional se puede dividir en nueve pasos: 1) Selección del organismo huésped 2) Selección del vector de clonación 3) Preparación del vector 4) Preparación del inserto

5) Generación del ADN recombinante 6) Introducción del ADN recombinante en el organismo huésped 7) Selección de los clones de organismos que contienen los vectores 8) Selección de clones con las moléculas de ADN recombinante deseadas. 9) Expansión y aislamiento del ADN recombinante. Es importante destacar que antes de realizar un experimento de clonación, siempre se recomienda hacer una in silico. Selección del organismo huésped Como se mencionó anteriormente, los organismos hospedadores más comúnmente usados son cepas de laboratorio de E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles en el mercado, y estos han sido diseñados genéticamente para un rendimiento óptimo en ciertas aplicaciones y deben ser elegidos en consecuencia (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplos de las cepas de E. coli más comunes utilizadas para la clonación molecular.

Selección del vector de clonación: Los plásmidos de las bacterias con mucho los más comúnmente utilizados como vectores de clonación dada su simplicidad de uso y el hecho de que son apropiados para la clonación más común, ya que pueden contener hasta 20 kilo pares de bases (kb) de ADN extraño.

-Origen de replicación(ORI): este recluta la maquinaria de replicación de ADN y permite la propagación del plásmido. Existen diferentes tipos de ORI y puede afectar el número de copias de plásmidos por célula bacteriana. -Marcador seleccionable: esto permite la selección de bacterias que contienen plásmidos. Los más utilizados son genes de resistencia a fármacos como los que confieren ampicilina, kanamicina y resistencia al cloranfenicol. Además, estas dos características hay varios elementos accesorios que se encuentran en plásmidos más comunes: -Sitio de clonación múltiple(MCS): una región diseñada para contener múltiples sitios de enzimas de restricción para facilitar el procedimiento de clonación. -Promotor está impulsa la expresión del ADN clonado. ADN polimerasa II o los promotores III se utilizan respectivamente para ADNc o ARN corto no codificante. -Etiqueta de la proteína: esto se fusiona con el ADN clonado para generar proteínas quiméricas con propiedades específicas, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) para permitir un fácil seguimiento de localización de proteínas. Señal de poli-adenilación: ésta se encuentra después del ADN inclinado e induce terminación de la transcripción del ARN mensajero (ARNm) por poliadenilación. Marcador elegible secundario: esto permite para mayor selección de organismos que contienen los plásmidos con genes de resistencia a los medicamentos y se usa comúnmente para seleccionar células de mamíferos.

Finalmente existen vectores especializados que permiten la generación de virus virales recombinantes partículas que se pueden traducir tipos de células de mamíferos con el ADN clonado en alta eficiencia en la tabla 3 se muestran algunos de los plásmidos más utilizados.

Figura 1. Estructura esquemática de un plásmido bacteriano básico. Un plásmido representativo que contiene las características más comunes. Consulte el texto para obtener explicaciones detalladas de cada función.

Tabla 3. Ejemplos de plásmidos bacterianos de uso común

Preparación del vector El vector de clonación se suele preparar por dos métodos simples: Restricción de la digestión: se pueden generar extremos romos o pegajosos dependiendo de la enzima de restricción utilizada una vez digerido el vector se purifica por selección de tamaño usando electroforesis en gel de agarosa. PCR: esto genera extremos romos que pueden reproducirse aún más por las enzimas de restricción cómo se describió anteriormente. Comparado con el método anterior, amplificado el vector permite más flexibilidad (como nuevos sitios de restricción u otras secuencias deseadas) puede introducirse al final del vector utilizando cebadores modificados que contienen tales secuencias. El vector resultante tiene el potencial de contener mutaciones introducidas durante la PCR y por lo tanto deben secuenciarse. Antes de la ligadura, el vector debe ser purificado.

Si el vector preparado tiene extremos compatibles que tienen el potencial de re-ligarse si la presencia del inserto deseado, los grupos fosfato deben eliminarse de la cadena 5' para evitar que esto suceda. De hecho, la ADN ligasa requiere un fosfato. El grupo debe de estar presente en el extremo 5' de un fragmento de ADN para enlazar covalentemente dos fragmentos juntos. Los extremos del ADN generado por enzimas de restricción retienen los grupos fosfato en los extremos 5', sin embargo, se pueden eliminar in vitro utilizando enzimas como la fosfatasa alcalina. Los productos de PCR no tiene grupos fosfato en los extremos 5'. Preparación del inserto. El ADN que se va a clonar (insertar) puede provenir de múltiples fuentes: - ADN genómico. Esto puede ser purificado de cualquier organismo de interés usando protocolos apropiados. Antes de la clonación, se corta con una enzima de restricción o se corta mecánicamente para producir fragmentos con el tamaño deseado. El ADN resultante se usa para preparar bibliotecas de ADN genómico completo. - ADN complementario (cDNA). Este es un ADN de doble cadena obtenido de ARNm celular mediante transcripción inversa. Esto se puede usar para generar bibliotecas de ADNc que contienen todos los genes expresados en un determinado tipo de célula. - El plásmido DNAT ya contiene la secuencia de interés que debe transferirse a un nuevo vector. La secuencia se elimina primero de este plásmido donante utilizando enzimas de restricción apropiadas, luego se selecciona el tamaño antes de la clonación. - Producto de PCR. Esto se puede obtener utilizando cebadores apropiados de ADN genómico, ADNc o plásmido. Los sitios de restricción u otras secuencias deseadas se pueden agregar a los extremos del producto de la

PCR mediante el uso de cebadores que incluyan dichas secuencias. Los productos de PCR de extremos romos pueden usarse directamente o cortarse con enzimas de restricción. La selección del tamaño del fragmento de interés se realiza generalmente. - ADN sintético. Esto se puede crear in vitro sin utilizar ninguna plantilla de ADN preexistente y, por lo tanto, permite el mayor nivel de flexibilidad para generar una secuencia deseada. Antes de la clonación, estos fragmentos se tratan como para productos de PCR. La secuenciación del producto clonado siempre es necesaria, ya que las mutaciones a menudo se introducen durante el procedimiento de síntesis de ADN. Independientemente de su fuente, el ADN insertado debe contener extremos que sean compatibles con los del vector preparado como se describe anteriormente. Además, si se va a usar un vector desfosforilado, es esencial que el inserto esté fosforilado en cada extremo 5 '. Cuando el inserto ha sido digerido por enzimas de restricción, los extremos 5 'retienen estos grupos fosfato. Sin embargo, los productos derivados de la PCR o los fragmentos de ADN sintéticos deben fosforilarse in vitro utilizando enzimas como la polinucleótido quinasa T4 antes de la ligadura. Generación del ADN recombinante. Una vez preparados, el vector y los insertos se mezclan y la reacción de ligación del ADN dependiente de ATP se realiza utilizando enzimas como la ligasa T4 de ADN. - Competencia química. Esto se logra mediante el tratamiento previo de las células con productos químicos (a menudo cloruro de calcio) en condiciones de frío, seguido de un pulso corto de choque térmico, que en conjunto aumenta la permeabilidad de la membrana celular al ADN. Se pueden introducir plásmidos de hasta 10 kb usando este método, y dada su

simplicidad, esta es la técnica más utilizada para introducir ADN recombinante en bacterias. - Electroporación. Las células se someten a un breve choque eléctrico que genera pequeños poros en la superficie celular, lo que permite que el ADN plasmídico entre. Esta

tecnología tiene una mayor eficiencia en

comparación con la transformación química y se utiliza principalmente para introducir plásmidos muy grandes. Selección de los clones de organismos que contienen los vectores. Las bacterias se cultivan en placas de Petri semisólidas en medio de agar que contienen el agente de selección apropiado (generalmente un antibiótico). Esto permite la selección de los organismos que llevan este marcador y, por lo tanto, el plásmido deseado. Después de la incubación durante la noche, las bacterias individuales crecen en colonias visibles de varios millones de células, que se pueden aislar, expandir y analizar. Selección de clones con las moléculas de ADN recombinante deseadas Esto se puede lograr mediante tres estrategias principales: - Cribado mediante PCR. La presencia del inserto deseado se identifica al realizar una PCR directamente en una colonia bacteriana. - Detección de la digestión de restricción. El plásmido se aísla primero del clon bacteriano y luego se somete a una digestión de restricción que genera fragmentos de ADN de cierto tamaño solo si el ADN recombinante deseado está presente. - Secuencia ADN. Esto se realiza en plásmidos aislados y se usa para confirmar la presencia del inserto y su secuencia correcta.

Expansión y aislamiento del ADN recombinante. Después de la selección, el clon bacteriano correcto que lleva el ADN recombinante deseado se expande en cultivo líquido para amplificar el plásmido. El plásmido amplificado se puede extraer y purificar utilizando protocolos apropiados o kits comerciales. Diagrama de Flujo

Selección del organismo huésped

Selección del vector de clonación

Preparación del vector

Introduccción del ADN recombinante en el organismo huésped

Generación de ADN recombinante

Preparación del inserto

Selección de los clones de organismos que contienen los vectores

Selección de clones con las moléculas de ADN recombinante deseadas

Expansión y aislamiento del ADN recombinante

Bibliografía Alarcón, J. (2003). Clonación de ADN. [online] Khan Academy. Available at: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dnatechnology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning [Accessed 14 Mar. 2019]. Salvador, J. (2004). [online] La clonación: fundamentos teóricos y aplicaciones.

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