Verificación Espectrofotómetro Final.docx
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD Profesores: M en C Aura Hernández Olicón M en C Elizabeth Jiménez Gutierrez M en C Hilda Pérez Cervantes Dr. Luis R. Carreno Durón Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel Práctica: Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Grupo: 5QM2 Sección: 4 Equipo: 10 Ciclo escolar 2019 Fecha de entrega Ciudad de México, 15 de marzo de 2018
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INTRODUCCIÓN
En la actualidad las determinaciones analíticas en química clínica se realizan utilizando instrumentos y equipos relativamente complejos en el laboratorio clínico, por ello para asegurar la confiabilidad de los datos es necesario conocer tanto como sea posible las características, potencialidades, limitaciones y particularidades de los instrumentos analíticos, debido a que dependen entre otros aspectos tanto del uso adecuado como del buen funcionamiento de los equipos fotométricos. Un espectrofotómetro es un instrumento que se utiliza para medir la luz que transmite una solución en una celda. Sirve para determinar la concentración de una sustancia absorbente de luz en una celda, basándose en la ley de Lambert-Beer. La adecuada obtención de resultados obtenidos por dichas mediciones empleando métodos fotométricos, requiere-en primer lugarverificar que el instrumento de medición está funcionando correctamente. La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros UV-VIS es indispensable en el control de calidad. Para llevar acabo este tipo de comprobaciones es común el empleo de substancias estándar, cuyas propiedades espectrales han sido estudias cuidadosamente. Posteriormente, se evalúa el funcionamiento del instrumento en función de los resultados obtenidos del análisis de estos estándares. La calibración, la sensibilidad y la linealidad, son tres características que permiten verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros. Las dos primeras se verifican mediante la determinación del espectro de absorción de una solución de cloruro de cobalto (CoCl2) (absorbancia máxima de 0.5 a 510 nm) y la última a través de la medición de la absorbancia de soluciones de diferentes concentraciones conocidas de dicromato de potasio (K2Cr2O7) o de permanganato de potasio (KMnO4). OBJETIVO Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros, utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio e interpretar los resultados de acuerdo a la ley de Lamber-Beer. FUNDAMENTO Cuando la luz de una apropiada longitud de onda atraviesa una cubeta conteniendo una solución colorida, parte de la luz es absorbida por la solución, el resto es transmitida a través de la muestra hasta el detector. La luz que llega al detector se conoce como transmitancia. Cada solución colorida tiene un espectro de absorción característico que se establece a partir de la medición de la absorbancia a diferentes longitudes de onda. La longitud de onda a la cual se analiza una sustancia es generalmente, aquella a la cual se obtiene la máxima absorbancia. Por
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS lo regular se selecciona aquella que dé la mayor sensibilidad y que más se aproxime a la ley de Beer.
RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 20 DE MARZO DEL 2018 Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Resultados y observaciones Espectrofotómetro: Thermo scientific Genesis 20 Marca: Thermo scientific Codificación de usuario: 11 Unidades: nm Condiciones físicas del instrumento: buenas condiciones. Tipo de celda utilizada: volumen semireducido Solución utilizada: CoCl2 2.2% Vol. Seleccionado: ¾ de la celda Ajuste de instrumento con: HCl 1% Intervalo de λ: 450-500 nm Tabla 1. Verificación de la calibración y sensibilidad λ (nm) 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
λ mínima seleccionada: 450 nm Verificación de la linealidad Solución utilizada: K2Cr2O7 Ajuste del espectrofotómetro: Agua destilada
A 0.216 0.290 0.342 0.388 0.431 0.477 0.509 0.496 0.438 0.342 0.249
λ máxima seleccionada: 550 nm
Longitud de onda: 500 nm
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Tabla 2. Verificación de la linealidad Conc. Conc. Absorbancia calculadas Teóricas mg/dl (500 nm) mg/dl 26.5 0.148 41.83 53 0.219 61.90 106 0.375 105.99 159 0.598 169.03 212 0.761 215.10 265 0.910 257.22 318 1.078 304.71 371 1.234 348.81 424 1.411 398.84 477 1.546 437.00 530 1.724 487.31
% de error 57.84% 16.79% -9.43x10-3 6.30 1.46 -2.93 -4.17 -5.98 -5.93 -8.38 -8.05
Solución con la que se hicieron las diluciones: K2Cr2O7 Factor de calibración utilizado: Fórmula para calcular las concentraciones de las diluciones: 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 Factor de dilución = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜 Concentración =
530 𝑚𝑔/𝑑𝐿 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
: Factor =
106 A106
106 = 282.6666 0.375 Ecuación empírica para calcular las concentraciones calculadas 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 =
Concentracion calculada = F ∗ Absorbancia [ ] = 282.6666 ∗ 0.148 = 41.83 Tomando en cuenta los valores observados se determinó mediante la siguiente ecuación el porciento de error: 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 %𝐸 = 𝑥100 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 41.83−26.5 %𝐸 = 26.5 𝑥100 =57.84%
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0.6
Absorbancia
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 440
460
480
500
520
540
560
lonitud de onda (nm)
Figura 1. Espectro de absorción del CoCl2 al 2.2% en HCl al 1%.
Figura 1.1 Espectro de absorción del CoCl2
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2 1.8
Absorbancia
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.0031x + 0.0702 R² = 0.9988
0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
Concentraciones teóricas (mg/dL)
Figura 2. Curva tipo relacionando las concentraciones teóricas del K2Cr2O7 con sus absorbancias leídas a una longitud de onda de 500 nm.
2 1.8 1.6
Absorbancia
1.4 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.0035x + 2E-05 R² = 1
0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
Concentraciones calculadas (mg/dL)
Figura 3. Curva tipo relacionando las concentraciones calculadas del K2Cr2O7 con sus absorbancias leídas a una longitud de onda de 500 nm.
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Concentraciones calculadas (mg/dL)
600 500 400 300 200 100
y = 0.8872x + 19.824 R² = 0.9988
0 0
100
200
300
400
500
600
Concentraciones teóricas (mg/dL)
Figura 4. Verificación de la linealidad.
800.00% 600.00% 400.00%
% de error
200.00% 0.00% -200.00%
0
100
200
300
400
500
600
-400.00% -600.00% -800.00% -1000.00%
Conc. calculadas mg/dl
Figura 5. Porciento de error en cada uno de los puntos.
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PRGUNTA EXTRA.
Figura 1.1 Espectro de absorción del CoCl2
DISCUSIÓN Considerando la primer experiencia sobre la verificación de la calibración y sensibilidad del espectrofotómetro con respecto a el espectro de absorción obtenido del cloruro de cobalto (CoCl2), corresponde al esperado ya que teóricamente como se observa en la figura 1.1 la absorbancia máxima de este compuesto se encuentra a los 510nm, valor de longitud de onda en la que se encontró experimentalmente la mayor absorbancia del compuesto, 8
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mediante dicho principio se puede decir que el espectrofotómetro tiene sensibilidad y está calibrado. La absorbancia registrada en esta longitud de onda (510 nm) fue de 0.509, considerando que teóricamente la absorbancia máxima es de 0.500, es posible conocer + mediante un parámetro de 0.025 de error si se encuentra en el intervalo de 0.475-0.525, −
cabe mencionar que el valor obtenido experimentalmente entra en dicho intervalo comprobando que el espectrofotómetro tiene sensibilidad. Haciendo referencia a la verificación de la linealidad de acuerdo a la curva de calibración obtenida en la relación de las concentraciones teóricas del dicromato de potasio (K2Cr2O7) con su respectiva absorción figura 2, se observa en comparación con la curva de calibración de la relación de las concentraciones calculadas figura 3 se comprueba realmente con la segunda curva que hay una linealidad dado al valor del coeficiente de correlación que es igual a 1 (r=1). Con respecto a la relación de las concentraciones teóricas y calculadas se esperaría un coeficiente de correlación de 1 para comprobar la linealidad de ambas sin embargo en la figura 4, con la relación del porciento de error y la concentraciones calculas figura 5 fue posible conocer que tanto no cumplen con la linealidad. Con respecto a los valores del % de error cabe mencionar que el primero al ser muy grande se debe a que la concentración del analito es muy pequeña y se podría confundir con el ruido del equipo. En los demás puntos donde se presenta un % de error mayor al 2.5% por arriba o por abajo del valor real, el analista es responsable de ese error que se pudo haber cometido al momento de realizar las diluciones. Es por eso que las determinaciones se deben realizar por lo menos 5 veces para tener datos más representativos y confiables que reduzcan el grado de incertidumbre. Una de las formas de poder obtener el grado de error del analista sería efectuar una prueba de verificación de linealidad por triduplicado y posteriormente sacar promedios y realizar posteriormente el análisis estadístico correspondiente. CONCLUSIONES
Es necesario realizar 5 veces la determinación para validar los datos. El equipo esta calibrado y presenta sensibilidad en un intervalo de 0.475-0.525 con una absorbancia máxima de 0.509 a 500nm. El equipo presenta linealidad.
REFERENCIAS 1. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. I. Diagnóstico del funcionamiento de espectrofotómetros. 1991: 1719. 2. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. III. Estudio del efecto de la calibración sobre la calidad analítica. 1991: 19-24.
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3. Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2a, Barcelona, 1998. 4. MSc. Yamilé Heredia-DíazI, MSc. Roberto Machado-GarcíaI, Lic. Marllelyn Mendoza-SuárezII, Lic. Deylis Jardines-CalaIII, MSc. AlbisVázquez-DomínguezIV. Desproteinización de muestras de suero y plasma para el estudio analítico de carbamazepinan. Rev Cub Quim vol.28 no.3 Santiago de Cuba dic. 2016
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SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD Profesores: M en C Aura Hernández Olicón M en C Elizabeth Jiménez Gutierrez M en C Hilda Pérez Cervantes Dr. Luis R. Carreno Durón Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel Práctica: Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Grupo: 5QM2 Sección: 4 Equipo: 10 Ciclo escolar 2019 Fecha de entrega Ciudad de México, 15 de marzo de 2018
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INTRODUCCIÓN
En la actualidad las determinaciones analíticas en química clínica se realizan utilizando instrumentos y equipos relativamente complejos en el laboratorio clínico, por ello para asegurar la confiabilidad de los datos es necesario conocer tanto como sea posible las características, potencialidades, limitaciones y particularidades de los instrumentos analíticos, debido a que dependen entre otros aspectos tanto del uso adecuado como del buen funcionamiento de los equipos fotométricos. Un espectrofotómetro es un instrumento que se utiliza para medir la luz que transmite una solución en una celda. Sirve para determinar la concentración de una sustancia absorbente de luz en una celda, basándose en la ley de Lambert-Beer. La adecuada obtención de resultados obtenidos por dichas mediciones empleando métodos fotométricos, requiere-en primer lugarverificar que el instrumento de medición está funcionando correctamente. La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros UV-VIS es indispensable en el control de calidad. Para llevar acabo este tipo de comprobaciones es común el empleo de substancias estándar, cuyas propiedades espectrales han sido estudias cuidadosamente. Posteriormente, se evalúa el funcionamiento del instrumento en función de los resultados obtenidos del análisis de estos estándares. La calibración, la sensibilidad y la linealidad, son tres características que permiten verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros. Las dos primeras se verifican mediante la determinación del espectro de absorción de una solución de cloruro de cobalto (CoCl2) (absorbancia máxima de 0.5 a 510 nm) y la última a través de la medición de la absorbancia de soluciones de diferentes concentraciones conocidas de dicromato de potasio (K2Cr2O7) o de permanganato de potasio (KMnO4). OBJETIVO Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros, utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio e interpretar los resultados de acuerdo a la ley de Lamber-Beer. FUNDAMENTO Cuando la luz de una apropiada longitud de onda atraviesa una cubeta conteniendo una solución colorida, parte de la luz es absorbida por la solución, el resto es transmitida a través de la muestra hasta el detector. La luz que llega al detector se conoce como transmitancia. Cada solución colorida tiene un espectro de absorción característico que se establece a partir de la medición de la absorbancia a diferentes longitudes de onda. La longitud de onda a la cual se analiza una sustancia es generalmente, aquella a la cual se obtiene la máxima absorbancia. Por
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS lo regular se selecciona aquella que dé la mayor sensibilidad y que más se aproxime a la ley de Beer.
RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 20 DE MARZO DEL 2018 Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Resultados y observaciones Espectrofotómetro: Thermo scientific Genesis 20 Marca: Thermo scientific Codificación de usuario: 11 Unidades: nm Condiciones físicas del instrumento: buenas condiciones. Tipo de celda utilizada: volumen semireducido Solución utilizada: CoCl2 2.2% Vol. Seleccionado: ¾ de la celda Ajuste de instrumento con: HCl 1% Intervalo de λ: 450-500 nm Tabla 1. Verificación de la calibración y sensibilidad λ (nm) 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
λ mínima seleccionada: 450 nm Verificación de la linealidad Solución utilizada: K2Cr2O7 Ajuste del espectrofotómetro: Agua destilada
A 0.216 0.290 0.342 0.388 0.431 0.477 0.509 0.496 0.438 0.342 0.249
λ máxima seleccionada: 550 nm
Longitud de onda: 500 nm
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Tabla 2. Verificación de la linealidad Conc. Conc. Absorbancia calculadas Teóricas mg/dl (500 nm) mg/dl 26.5 0.148 41.83 53 0.219 61.90 106 0.375 105.99 159 0.598 169.03 212 0.761 215.10 265 0.910 257.22 318 1.078 304.71 371 1.234 348.81 424 1.411 398.84 477 1.546 437.00 530 1.724 487.31
% de error 57.84% 16.79% -9.43x10-3 6.30 1.46 -2.93 -4.17 -5.98 -5.93 -8.38 -8.05
Solución con la que se hicieron las diluciones: K2Cr2O7 Factor de calibración utilizado: Fórmula para calcular las concentraciones de las diluciones: 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 Factor de dilución = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜 Concentración =
530 𝑚𝑔/𝑑𝐿 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
: Factor =
106 A106
106 = 282.6666 0.375 Ecuación empírica para calcular las concentraciones calculadas 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 =
Concentracion calculada = F ∗ Absorbancia [ ] = 282.6666 ∗ 0.148 = 41.83 Tomando en cuenta los valores observados se determinó mediante la siguiente ecuación el porciento de error: 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 %𝐸 = 𝑥100 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 41.83−26.5 %𝐸 = 26.5 𝑥100 =57.84%
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Absorbancia
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 440
460
480
500
520
540
560
lonitud de onda (nm)
Figura 1. Espectro de absorción del CoCl2 al 2.2% en HCl al 1%.
Figura 1.1 Espectro de absorción del CoCl2
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Absorbancia
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.0031x + 0.0702 R² = 0.9988
0.4 0.2 0 0
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Concentraciones teóricas (mg/dL)
Figura 2. Curva tipo relacionando las concentraciones teóricas del K2Cr2O7 con sus absorbancias leídas a una longitud de onda de 500 nm.
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Absorbancia
1.4 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.0035x + 2E-05 R² = 1
0.4 0.2 0 0
100
200
300
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Concentraciones calculadas (mg/dL)
Figura 3. Curva tipo relacionando las concentraciones calculadas del K2Cr2O7 con sus absorbancias leídas a una longitud de onda de 500 nm.
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Concentraciones calculadas (mg/dL)
600 500 400 300 200 100
y = 0.8872x + 19.824 R² = 0.9988
0 0
100
200
300
400
500
600
Concentraciones teóricas (mg/dL)
Figura 4. Verificación de la linealidad.
800.00% 600.00% 400.00%
% de error
200.00% 0.00% -200.00%
0
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200
300
400
500
600
-400.00% -600.00% -800.00% -1000.00%
Conc. calculadas mg/dl
Figura 5. Porciento de error en cada uno de los puntos.
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Figura 1.1 Espectro de absorción del CoCl2
DISCUSIÓN Considerando la primer experiencia sobre la verificación de la calibración y sensibilidad del espectrofotómetro con respecto a el espectro de absorción obtenido del cloruro de cobalto (CoCl2), corresponde al esperado ya que teóricamente como se observa en la figura 1.1 la absorbancia máxima de este compuesto se encuentra a los 510nm, valor de longitud de onda en la que se encontró experimentalmente la mayor absorbancia del compuesto, 8
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mediante dicho principio se puede decir que el espectrofotómetro tiene sensibilidad y está calibrado. La absorbancia registrada en esta longitud de onda (510 nm) fue de 0.509, considerando que teóricamente la absorbancia máxima es de 0.500, es posible conocer + mediante un parámetro de 0.025 de error si se encuentra en el intervalo de 0.475-0.525, −
cabe mencionar que el valor obtenido experimentalmente entra en dicho intervalo comprobando que el espectrofotómetro tiene sensibilidad. Haciendo referencia a la verificación de la linealidad de acuerdo a la curva de calibración obtenida en la relación de las concentraciones teóricas del dicromato de potasio (K2Cr2O7) con su respectiva absorción figura 2, se observa en comparación con la curva de calibración de la relación de las concentraciones calculadas figura 3 se comprueba realmente con la segunda curva que hay una linealidad dado al valor del coeficiente de correlación que es igual a 1 (r=1). Con respecto a la relación de las concentraciones teóricas y calculadas se esperaría un coeficiente de correlación de 1 para comprobar la linealidad de ambas sin embargo en la figura 4, con la relación del porciento de error y la concentraciones calculas figura 5 fue posible conocer que tanto no cumplen con la linealidad. Con respecto a los valores del % de error cabe mencionar que el primero al ser muy grande se debe a que la concentración del analito es muy pequeña y se podría confundir con el ruido del equipo. En los demás puntos donde se presenta un % de error mayor al 2.5% por arriba o por abajo del valor real, el analista es responsable de ese error que se pudo haber cometido al momento de realizar las diluciones. Es por eso que las determinaciones se deben realizar por lo menos 5 veces para tener datos más representativos y confiables que reduzcan el grado de incertidumbre. Una de las formas de poder obtener el grado de error del analista sería efectuar una prueba de verificación de linealidad por triduplicado y posteriormente sacar promedios y realizar posteriormente el análisis estadístico correspondiente. CONCLUSIONES
Es necesario realizar 5 veces la determinación para validar los datos. El equipo esta calibrado y presenta sensibilidad en un intervalo de 0.475-0.525 con una absorbancia máxima de 0.509 a 500nm. El equipo presenta linealidad.
REFERENCIAS 1. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. I. Diagnóstico del funcionamiento de espectrofotómetros. 1991: 1719. 2. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. III. Estudio del efecto de la calibración sobre la calidad analítica. 1991: 19-24.
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3. Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2a, Barcelona, 1998. 4. MSc. Yamilé Heredia-DíazI, MSc. Roberto Machado-GarcíaI, Lic. Marllelyn Mendoza-SuárezII, Lic. Deylis Jardines-CalaIII, MSc. AlbisVázquez-DomínguezIV. Desproteinización de muestras de suero y plasma para el estudio analítico de carbamazepinan. Rev Cub Quim vol.28 no.3 Santiago de Cuba dic. 2016
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